이 작품은 건강 보조금의 국가 학회에 의해 지원되었다 (R01NS085215 K.F.에, T32 GM107000 및 F30MH122146 A.C.). 저자들은 숙련된 기술 지원을 해주신 와타나베 나오에 씨에게 감사를 표합니다.

모든 동물 프로토콜은 매사추세츠 대학교 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 슬라이스 배양 준비, 플라스미드 제제 및 전기화도 이전에 공표된 방법에 상세하며 추가정보(10)를참조할 수 있다.
1. 슬라이스 문화 준비
<ol><li>이전에설명된바와 같이 마우스 organotypic 해마 슬라이스 배양을 준비하여, 산후 6-7일 된 마우스를 사용하여 어느 성별도 있다.<ol>
<li>(mM) 구성 된 organotypic 슬라이스 문화에 대한 해부 미디어를 준비 ( mM): 238 자당, 2.5 KCl, 1 CaCl2,4 MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4,및 11 포도당 분수, 다음 가스 5% CO2/95% O2 에 7.4.</li>
		<li>▲78.8%(v/v) 최소 필수매체이글, 말 세럼 20% (v/v) ▲17.9m 나코3,26.6mMM포도당, 2M CaCl2,M MgSO4,30m HEPES, 인슐린(1μg/mL), 인슐린(1μg/mL), 인슐린(1μg/mL), 0.06m+0.06m+0.06m+0.0으로 구성된 조진형 슬라이스 배양 배지 를 준비한다. 진동계를 사용하여 삼투압을 310-330 osmol로 조정합니다.</li>
		<li>두 개의 주걱을 사용 하 여 전체 뇌에서 해 마 를 해 부, 그리고 슬라이스 (400 μm) 조직 헬기를 사용 하 여. 두 개의 집게를 사용하여 슬라이스를 분리하고 삽입 아래에 배양 매체(950 μL)로 채워진 6웰 플레이트에서 30mm 세포 배양 인서트를 분리한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조직 배양 인큐베이터(35°C, 5%CO2)에조직 배양물 컬쳐를 저장하고 2일마다 슬라이스 배양 매체를 변경한다.</li>
</ol>2. 플라스미드 준비
<ol><li>관심 유전자에 대한 플라스미드를 준비합니다.<ol>
<li>서브클론은 pCAG 벡터로 녹색 형광 단백질 (EGFP) 유전자를 향상시켰습니다.</li>
		<li>내독소가 없는 정화 키트를 함유한 pCAG-EGFP 플라스미드를 정화하고 140m K-메탄술포네이트, 0.2m MM EGTA, 2m M M MgCl2,10mM HEPES를 함유한 다이틸 파이로카보네이트 처리수로 구성된 내부 용액에 용해되어 7.3m(KOH7.3)로 조정된다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 유리 파이펫 준비
<ol><li>마이크로피펫 풀러(그림 1A)에보로실리케이트 유리 파이펫 (4.5 - 8 MΩ)을 당깁니다. 참고: 전세포 패치 클램프 레코딩에 사용되는 유리 파이펫은 전기포공에 이상적입니다.</li>
	<li>200°C에서 밤새 유리 파이펫을 구워 멸균합니다.</li>
	<li>해부 현미경의 피펫 팁의 크기를 확인하여 전기 저항을 대략화하십시오.<ol>
<li>선택 사항:파이펫을 전기기 전극에 부착하여 파이펫 저항을 확인하고 마이크로 조작기를 사용하여 파이펫 팁을 필터 멸균 된 인공 뇌척수액 (aCSF)으로 기동합니다 (mM에서): 119 NaCl, 2.5KCl, 0.5 CaCl2,5 MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4 및 11 포도당, 5% CO 2/95% O2 내지 7.4의 pH. 전기포레이터의 판독을 사용하여 실제 저항을 확인합니다. 참고: 파이펫 팁이 날카로워지며 전기 저항이 커집니다. 파이펫 저항은 10 MΩ 미만이어야 합니다. 파이펫 저항성이 높은 유리파이펫(도 1B)은반복된 전기기공 시 팁에서 종종 막힘입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 전기 기공 장비 설정
<ol><li>전기포레이터를 표준 전세포 전기생리학 장비에 설치하여 미세 조작기와 연동 펌프가 장착된 변속 테이블에 수직 현미경을 장착합니다.</li>
	<li>전자포레이터의 헤드스테이지를 미세 조작기에 설치하고 한 쌍의 스피커를 전자포레이터에 연결합니다. 전자포레이터를 풋 페달에 연결하여 준비시 펄스를 보낼 수 있습니다. 참고: 스피커가 켜져 있을 때 톤을 방출하며, 이는 전극의 전기 저항을 나타내는 지표입니다. 이렇게 하면 절차에서 주의를 끌지 않고 저항의 상대적 변화를 결정할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 전기 기공 준비
<ol><li>슬라이스 배양 물자를 6개의 웰 플레이트에서 3cm 페트리 접시로 옮기고 900 μL의 배양 매체를 적재하고 전기포기를 수행할 준비가 될 때까지 TABLEtop CO2 인큐베이터에 보관합니다.<ol>
<li>3.5cm 페트리 접시에서 3.5cm 페트리 접시에서 30분 이상 슬라이스 배양 매체(1mL)를 곁들인 신선한 배양 물자를 전기기 후 배양 슬라이스로 선적한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전기 포이션을 위해 장비를 청소하고 준비하십시오.<ol>
<li>하루에 대한 실험을 시작하기 전에 튜브와 챔버를 살균하기 위해 5 분 동안 10 % 표백제로 라인을 퍼퓨징하십시오.</li>
		<li>탈이온화된 오토클레이브 물로 라인을 30분 이상 분산하여 완전히 헹구는 경우를 대지 않습니다.</li>
		<li>0.001 mM 테트로도톡신(TTX)을 포함하는 필터 멸균 aCSF로 라인을 퍼퓨즈합니다. 참고: TTX는 인터뉴런10의과대 흥분으로 인한 세포 독성 및 사망을 최소화합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>-5 V, 정사각형 펄스, 500ms의 훈련, 50Hz 의 주파수 및 500 μs의 펄스 폭 : 전기 포로이터의 펄스 매개 변수를 설정합니다.</li>
	<li>플라스미드 함유 내부 용액5μL로 유리 파이펫을 채웁니다.<ol>
<li>파이펫 끝에서 갇힌 기포를 여러 번 가볍게 두드려 서 제거합니다.</li>
		<li>해부 현미경으로 시각화하거나 파이펫 저항을 확인하기 위해 3.3.1 단계를 반복하여 손상에 대한 팁을 확인하십시오. 참고: 팁이 손상된 경우 유리 파이펫을 폐기해야 하며 이 단계는 이전에 3단계에서 준비된 새 유리 파이펫으로 반복되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>파이펫 팁을 전극에 단단히 부착하고 스피커를 켭니다. 팁이 aCSF 매체와 접촉했을 때 전기포레이터의 판독(파이펫 저항)을 기록합니다.</li>
	<li>날카로운 블레이드를 사용하여 배양 인서트 멤브레인을 자르고 하나의 슬라이스 배양을 분리합니다. 날카로운 각진 포셉을 사용하여 슬라이스 배양을 전자기 챔버로 조심스럽게 옮기고 슬라이스 앵커로 위치를 고정합니다.<ol>
<li>신경 건강이나 기능의 변화와 같은 부작용을 방지하기 위해 한 번에 30 분 이상 인큐베이터 외부의 슬라이스 문화를 유지하지마십시오(12)</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 관심있는 전극 세포
<ol><li>입으로 파이펫에 양압을 적용하거나 튜브에 부착된 1mL 주사기(0.2 ~0.5mL 압력)를 사용하여 양압을 적용한다.</li>
	<li>마이크로 조작기의 3차원 노브 컨트롤을 사용하여 슬라이스 배양 표면 근처에서 파이펫 팁을 기동합니다.</li>
	<li>표적 세포를 선택하고 접근하여 현미경에서 볼 수 있는 세포 표면에 보조개가 형성될 때까지 양압이 가해지는 것을 유지합니다.</li>
	<li>압력 주기를 수행합니다.<ol>
<li>입에 의해 가벼운 음압을 빠르게 적용하여 파이펫 팁과 플라즈마 멤브레인 사이에 느슨한 씰이 형성되도록 하며, 피펫 팁으로 올라가는 멤브레인에 의해 시각적으로 표시됩니다. 스피커에서 나오는 음색의 증가를 청취하여 파이펫 저항의 증가(~2.5배 초기 저항)를 관찰한다. 보조가 다시 형성되도록 양압을 신속하게 다시 적용합니다.</li>
		<li>즉시 일시 중지하지 않고 적어도 두 번 더 압력 주기를 완료한 다음 1 s에 대한 음의 압력을 유지합니다. 참고: 주기 사이 를 일시 중지, 너무 많은 압력을 적용, 또는 너무 오래 대 한 부정적인 압력을 유지 상당한 세포 손상을 일으킬 수 있습니다 그리고 아마도 전기 기 공 동안 죽을 세포 원인.</li>
	</ol>
</li>
	<li>스피커의 톤이 피치의 안정적인 정점에 도달하면 발 페달을 사용하여 전자 포레이터를 빠르게 펄스하여 피크 전기 저항을 나타냅니다. 펄스를 보내기 전에 1 s 이상 피크 저항에서 기다리지 마십시오. 참고: 이프로토콜(10)을사용할 때 오프 타겟 전기기화를 관찰하지 않았습니다. 압력 주기 동안 유리 파이펫과 접촉하는 세포만 은 형감염되었습니다. 다른 뉴런 근처에 파이펫을 배치하면 유전자 이식이 발생하지 않습니다.</li>
	<li>압력을 가하지 않고 셀에서 약 100 μm 의 파이펫을 부드럽게 철회합니다.</li>
	<li>양압을 다시 적용하여 저항이 5.5단계에서 기록된 판독값과 유사하다는 것을 확인한 다음 다음 셀에 접근합니다.<ol>
<li>양압을 적용하여 전기기 후 피펫 저항을 시각적으로 또는 현저하게 증가(>15% 더 높음)에 의해 표시된 잠재적 나막신을 제거합니다. 참고: 눈에 보이는 나막신이 없고 저항성이 여전히 상당히 높으면 파이펫을 버리고 새 것을 사용합니다. 사용자가 주의 할 경우 평균적으로, 파이펫은 최대 20 개의 전기 기화 이벤트에 사용할 수있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전기기화 후, 슬라이스 배양을 신선한 배양 인서트로 옮기고 인큐베이터에서 35°C에서 최대 3일 동안 배양한다.</li>
</ol>7. organotypic 해마 슬라이스 배양의 고정, 염색 및 이미징
<ol><li>전극된 organotypic 슬라이스 배양 2 -3 일 0.01 M 인산염 완충식 식염수 (1 x PBS)로 4 % 파라 포름알데히드 및 4 % 자당으로 실온에서 1.5 h로 전환 후 2 - 3 일.</li>
	<li>2h00m 인산염 버퍼(1x PB)에서 30% 자당에서 고정 및 배양 슬라이스를 제거합니다.</li>
	<li>슬라이스를 슬라이드 유리에 놓고 슬라이드 유리를 분쇄 된 드라이 아이스 위에 올려 놓아 얼립니다. 실온에서 슬라이스를 해동하고 1x PBS로 채워진 6 개의 웰 플레이트로 옮기습니다.</li>
	<li>GDB 버퍼(0.1% 젤라틴, 0.3% 트리톤 X-100, 450mM NaCl, 32% 1x PB, pH 7.4)에서 마우스 안티-GFP 및 토끼 안티-RFP 항체로 슬라이스를 실온에서 2시간 동안 염색한다.</li>
	<li>실온에서 1x PBS로 3회 세척하여 매 세척할 때마다 10분 동안 세척합니다.</li>
	<li>항마우스 알렉사 488-컨쥬게이드 이차 항체 및 항토끼 알렉사 594-공주 보조 항체를 실온에서 1시간 동안 GDB 버퍼로 배양한다. 실온에서 10분 동안 1x PBS에서 DAPI(4 μg/mL)로 슬라이스를 배양합니다.</li>
	<li>실온에서 3분 동안 1x PBS로 슬라이스를 3분 씩 씻는다.</li>
	<li>마운팅 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 슬라이스를 마운트하고 형광 이미징을 수행합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+by+direct+microinjection+of+DNA+into+cultured+mammalian+cells.">High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.</a> Cell. 22 (2), 479-488 (1980).</li><li>Rae, J. L., Levis, R. 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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

우리는 여기에서 높은 효율성과 정밀도로 흥분성 및 억제 뉴런을 모두 횡단하는 전기 포기 법을 설명합니다. 당사의 최적화된 전기기화 프로토콜에는 매우 효율적인 유전자 이식을 달성하기 위한 세 가지 혁신적인 혁신이 있습니다. 우리의 첫 번째 수정은 이전에 게시 된프로토콜에비해 파이펫 크기를 증가하는 것이었습니다3,5,6<...

분자 생물학에서, 조사자에게 가장 중요한 고려 사항 중 하나는 그것의 기능을 해명하기 위하여 세포의 세포 또는 인구로 관심있는 유전자를 전달하는 방법입니다. 다른 전달 방법은 생물학적(예를 들어, 바이러스 벡터), 화학(예를 들어, 인산칼슘 또는 지질), 또는 물리적(예를 들어, 전기기화, 미세 주입 또는 생물리스트)1,2로분류될 수 있다. 생물학적 방법은 매우 효율적이며 세포 유형에 특이적일 수 있지만 특정 유전 도구의 개발에 의해 제한됩니다. 화학 적 접근은 시험관 내에서 매우 강력하지만, 형질은 일반적으로 무작위입니다; 추가, 이러한 접근은 주로 기본 셀에 대해서만 예약되어 있습니다. 물리적 접근법 중, 생물학은 기술적 관점에서 가장 간단하고 쉬운 방법이지만, 다시 상대적으로 낮은 효율로 무작위 형질 전환 결과를 생성합니다. 유전적 도구 개발 없이 특정 세포로 전이가 필요한 응용 의 경우, 우리는 단세포 전기기3,4를향해 바라본다.
전기포기는 전분 전기기분기만을 참조하는 데 사용되는 반면, 지난 20년 동안 여러 시험관 내 및 생체 내 단일 세포 전기기 프로토콜이 개발되어 특이성과 효율을 향상시키기 위해 개발되어5,6,7,전기포기는 개별 세포로 유전자를 전송하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 매우 정확할 수 있습니다. 그러나 절차는 기술적으로 까다롭고 시간이 많이 걸리며 상대적으로 비효율적입니다. 실제로, 최근 논문은 기계화 전기 기공 장비의 타당성을조사했다 8,9,이는 이러한 로봇 공학을 설치에 관심이 조사관을위한 이러한 장벽의 몇 가지를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 더 간단한 수단을 찾는 사람들을 위해, 전기 화, 즉 세포 죽음, 경질 실패 및 파이펫 막힘에 대한 문제는 여전히 우려사항입니다.
최근에는 더 큰 기울어진 유리 파이펫을 사용하는 전기 포기 방법을 개발했습니다. 온화한 전기 펄스 파라미터, 그리고 종신뉴런에서 훨씬 더 높은 형질전환 효율을 생성한 독특한 압력 순환 단계는 마우스 의 해마 CA1 영역에서 소마토스타틴 발현 억제 억제인터뉴런을 포함하여 억제성 인터뉴런에서 유전자를 처음으로 횡단할 수 있게하였다. 그러나, 상이한 억제 인터뉴런 유형 및 뉴런 발달 단계에서 이 전기포기 방법의 신뢰성은 해결되지 않았다. 여기서, 우리는 이 전기기 기술이 흥분성 뉴런과 인터뉴런의 다른 종류 둘 다로 유전자를 이식할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 중요한 것은, 시험관내(DIV) 슬라이스 배양 연령에 관계없이 일체내의 전환 효율이 높았다는 것이다. 이 확립 및 사용자 친화적 인 기술은 생체 외 마우스 뇌 조직의 맥락에서 다른 세포 유형에 대한 단일 세포 전기 포레이션을 사용하는 데 관심이있는 모든 조사자에게 매우 권장됩니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmid preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Organotypic slice culture preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 Well Plates</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forceps</td><td>FST</td><td>#5/45</td><td>Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation</td></tr><tr><td>Flask Filter Unit</td><td>Millipore</td><td>SCHVU02RE</td><td>Filtration and storage of culture media</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Binder</td><td>BD C150-UL</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>10180</td><td>Tissue chopper for organotypic slice culture preparation</td></tr><tr><td>Millicell Cell Culture Insert, 30 mm</td><td>Millipore</td><td>PIHP03050</td><td>Organotypic slice culture inserts</td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Precision Systems</td><td>OSMETTE II</td><td></td></tr><tr><td>PTFE coated spatulas</td><td>Cole-Parmer</td><td>SK-06369-11</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Vacuum Filtration System</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>Filtration and storage of aCSF</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Electrode preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillary Glasses</td><td>Warner Instruments</td><td>640796</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetter Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Puller</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Binder</td><td>BD (E2)</td><td></td></tr><tr><td>Puller Filament</td><td>Sutter Instrument</td><td>FB330B</td><td>Puller</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5 mm Falcon Petri Dishes</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Airtable</td><td>TMC</td><td>63-7512E</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Q Imaging</td><td>Retiga-2000DC</td><td>Camera</td></tr><tr><td>Electroporation System</td><td>Molecular Devices</td><td>Axoporator 800A</td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>Fluorescence Illumination System</td><td>Prior</td><td>Lumen 200</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td>MPC-385</td><td>Manipulator</td></tr><tr><td>Metamorph software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Image acquisition</td></tr><tr><td>Peristaltic Pump</td><td>Rainin</td><td>Dynamax, RP-2</td><td>Perfusion pump</td></tr><tr><td>Shifting Table</td><td>Luigs &amp;amp; Neuman</td><td>240 XY</td><td></td></tr><tr><td>Speaker</td><td>Unknown</td><td></td><td>Speakers connected to the electroporator</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ30</td><td></td></tr><tr><td>Table Top Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr><tr><td>Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fluorescence imaging #2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All-in-One Fluorescence Microscope</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell electroporation across different organotypic slice culture of mouse hippocampal excitatory and class-specific inhibitory neurons

전기 기화는 그들의 기능을 이해하기 위하여 세포로 특정 유전자를 전송하는 중요한 방법으로 그 자체를 설치했습니다. 여기서, 우리는 마우스 organotypic 해마 슬라이스 배양에서 흥분 및 클래스 별 억제 뉴런에서 체외 유전자 의 효율 (~80%)을 최대화하는 단세포 전기 기법을 설명합니다. 대형 유리 전극, 테트로도톡신 함유 인공 뇌척수액 및 가벼운 전기 펄스를 사용하여 배양 된 해마 CA1 피라미드 뉴런 및 억제 인터뉴런에 관심 유전자를 전달했습니다. 더욱이, 전기기화는 다양한 슬라이스 배양 발달 단계에 대한 연구를 가능하게 하는, 형질 효율의 감소없이 시험관내에서 최대 21일까지 배양 된 해마 슬라이스에서 수행될 수 있었다. 다양한 세포 유형에 걸쳐 유전자의 분자 기능을 검사하는 데 관심이 증가함에 따라, 우리의 방법은 기존의 전기 생리 장비 및 기술로 수행 할 수있는 마우스 뇌 조직에서 체외 유전자 트랜스펙트에 대한 신뢰할 수 있고 간단한 접근 방식을 보여줍니다.

우리의 단세포 전기기는 시각적으로 확인된 흥분성 및 억제 신경으로 유전자를 정확하게 전달할 수 있습니다. 우리는 세 가지 다른 시점에서 세 가지 다른 신경 세포 유형을 전기화. 파브알부민(Pv) 또는 셀란 글루타민3 타입(VGT3)은 각각 Pv/TdTomato 및 VGT3/TdTomato 라인으로 명명된 TdTomato(적색 형광 단백질의 변형) 리포터 라인(Jax #007905)을 통해 Pvcre(JAX #008069) 또는 VGT3cre(JAX #018147) 라인?...

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Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

여기에 제시된 단세포 전기기화는 체외 해마 슬라이스 배양 연령의 범위에 걸쳐 흥분성 및 억제 뉴런 모두에서 유전자를 전달할 수 있는 프로토콜입니다. 우리의 접근은 개별 적인 세포에 있는 유전자의 정확하고 능률적인 발현을 제공합니다, 세포 자율및 세포 간 기능을 검토하기 위하여 이용될 수 있는.

마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

single-cell-electroporation-across-different-organotypic-slice

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.6K 조회수.  University of Massachusetts Medical School. 여기에 제시된 단세포 전기기화는 체외 해마 슬라이스 배양 연령의 범위에 걸쳐 흥분성 및 억제 뉴런 모두에서 유전자를 전달할 수 있는 프로토콜입니다. 우리의 접근은 개별 적인 세포에 있는 유전자의 정확하고 능률적인 발현을 제공합니다, 세포 자율및 세포 간 기능을 검토하기 위하여 이용될 수 있는.

비디오: Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

출생 후 신경 발생의 연구 Organotypic 슬라이스 문화

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

연구

발생학

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

신경과학

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

네크로 텍스의 Organotypic 슬라이스 준비에서 전체 셀 녹음

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

Source: Richevaux, L., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/59534">In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a protocol to study synaptic interactions and neuronal responses in a transfected mouse hippocampal brain slice. It involves illuminating long-range sensory neurons to trigger action potentials and recording the resulting excitatory post-synaptic potentials in the recorded neuron using the whole-cell patch-clamp technique.

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Solutions for acute slice ...

마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화

요약

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