우리는 Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka 및 Matthias Toberer에게 훌륭한 기술 지원과 Victor Tarabykin에게 도움이되는 토론에 대해 감사드립니다. 이 연구는 도이체 Forschungsgemeinschaft의 SB (BR-2215)에 대한 지원으로 지원되었습니다.

모든 실험 절차는 동물 복지위원회 (Regierungspräsidium Tübingen)에 의해 승인되었으며 독일 동물 복지 법 (German Animal Welfare Act) 및 EU 지침 2010 / 63 / EU에 따라 수행되었습니다. 1. Utero Electroporation <ol><li> 미세 주입 바늘 <ol><li> 박스 필라멘트 (2.5mm x 2.5mm)가있는 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관 (외경 : 1.0mm, 내경 : 0.58mm, 길이 : 100mm)을 미세 주입 바늘로 당겨 다음 프로그램 : 열처리 : 540, PULL : 125, VELOCITY : 20, DELAY : 140. RAMP 테스트 (HEAT 값 : RAMP + 25)를 수행하여 모든 개별 필라멘트의 HEAT 값을 결정합니다. </li><li> 배아 일 (E) 13.5 이하에서 주사 할 때 팁 크기 20-30 μm를 얻기 위해 마이크로 그라인더 (microgrinder)를 사용하여 38 °의 각도로 높은 회전 속도의 중간에있는 베벨 바늘 및 구형 배아에서 주사 할 경우 30-40 μm단계. 보관을 위해서는 팁 손상을 방지하기 위해 모델링 점토로 상자 또는 페트리 접시에 바늘을 고정하십시오. </li></ol></li><li> 플라스미드 DNA 용액 <ol><li> 제조 업체의 지침에 따라 endotoxin - 무료 맥시 준비 키트를 사용하여 형광 리포터 단백질 ( 예 : GFP)를 포함하는 플라스미드 DNA 구조를 준비합니다. </li><li> 0.01 %의 최종 농도에서 패스트 그린을 함유하는 내 독소가없는 Tris-EDTA 완충액에서 1 - 2 μg / μL의 최종 농도로 플라스미드 DNA 용액을 희석한다. -20 ° C에서 나누어지는 솔루션 및 저장. </li></ol></li><li> 정균 염화 나트륨 용액 <ol><li> 등용 0.9 % 염화나트륨 용액에 0.9 %의 최종 농도로 벤질 알코올을 첨가하여 정균 염화 나트륨 용액을 준비한다. 사용하기 전에 멸균 필터 솔루션. </li></ol></li><li> Carprofen 주입 솔루션 <ol><li> carprofen 주입 솔루션을 준비멸균 된 등장 성 0.9 % 염화나트륨 용액에 0.5 mg / mL의 최종 농도로 카프로 펜을 첨가 하였다. 4 ° C에서 최대 28 일 동안 보관하십시오. </li></ol></li><li> 마취, DNA 주사 및 일렉트로 포 레이션 <ol><li> E14.5 시간 임신 마우스의 무게를 달아 기화기에 연결된 투명한 마취 챔버에 넣고 5 % 이소 플루 란으로 포화시킵니다. 동물이 의식을 잃었을 때 37 ° C의 웜 플레이트에 부착 된 마취 마스크로 옮기고 1.8 - 2.2 % 이소 플라워로 마취를 유지하십시오. 참고 : 꼬리 핀치와 페달 반사 (발가락 핀치)의 손실로 수술 마취의 발달을 평가하십시오. </li><li> 진통제의 경우 마우스 체중 10mg (5mg / kg bodyweight) 당 carprofen 주사액 100 μL를 피하 주사하십시오. 다시 아래로 마우스를 돌려 건조에서 그들을 방지하기 위해 조심스럽게 석유 젤리로 눈을 덮으십시오. </li><li> 부드럽게 팔다리를 펼쳐서 고정 시키십시오.외과 용 테이프가 달린 온난화 판에. 셀룰로오스 면봉을 사용하여 70 % 에탄올로 복부를 소독 한 다음 요오드 용액 (7.5 mg / mL)으로 소독합니다. 적절한 소독을 위해이 절차를 세 번 반복하십시오. </li><li> 복부 절개를위한 밭 (직경 : 2 - 2.5cm)을 절개하기 위해 절개가 된 멸균 거즈로 복부를 덮으십시오. 세균 정 염화나트륨 용액으로 거즈를 적셔주십시오. 주의 : 페달 반사의 상실로 수술 마취의 발달을 재평가하십시오. </li><li> Micro Adson Forceps (톱니 모양, 길이 : 12cm) 및 미세한 가위 (옆으로 길게, 길이 : 9cm)를 사용하여 복부의 정중선을 따라 약 1.5cm의 피부를 자릅니다. Linea Alba를 따라 밑에있는 근육을 자릅니다. </li><li> 링 집게 (길이 : 9cm, 외경 : 3mm, 내경 : 2.2mm)로 자궁 경적 하나를 제거하고 축축한 거즈 위에 부드럽게 놓습니다. 주의 사항 : 링 포셉으로 자궁 경적을 잡아주십시오.태반이나 공급 혈관에 혼란을주지 마십시오. 항상 세균성 염화 나트륨 용액으로 자궁을 촉촉하게 유지하십시오. </li><li> 조심스럽게 링 집게로 배아를 위치시키고 시상 부비동과 평행 한 초승달 모양의 그림자로 보이는 외측 뇌실을 찾습니다. 주사 부위는 색소 침착 된 안구와 시상 부비동의 합류점 사이의 선의 중간에 위치하며, 시상 부비동은 두 개의 횡 동맥으로 분지합니다. 자궁 벽과 측면 뇌실로 microinjection 바늘을 밀어. 참고 : 필요한 경우 바늘을 후퇴시켜 주입 깊이를 수정할 수 있습니다. </li><li> 풋 페달로 작동되는 마이크로 인젝터로 25 psi, 1 회 펄스 당 10-20 ms 및 5-10 펄스를 사용하여 1에서 2 μL의 DNA 용액을 측면 뇌실로 주입하십시오. 성공적인 주사는 심실 시스템을 채워야하는 유색의 DNA 용액으로 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> &quot;양성&quot;단자가 주입 된 뇌실과 같은면에 있고 &quot;음극&quot;단자가 삽입 된 뇌실과 같은면에 위치하도록 핀셋 형 전극 (E13.5 이하의 경우 직경 3mm, E14.5 이상인 경우 직경 5mm) 터미널은 배아 머리의 귀 아래에 주입 심실의 반대편에 있습니다. </li><li> 일렉트로 포 레이션 사이트를 항균성 염화 나트륨 용액 몇 방울에 적신 다음 950ms 간격으로 50ms 지속 시간의 5 가지 전류 펄스 (E13.5 이하에서는 35V, E14.5 이상에서는 40V)를 적용하십시오. 참고 : 성공적인 electroporation을 위해서는 보통 60 ~ 90 mA의 전류로 충분합니다. 낮은 전류는 뉴런을 효율적으로 전달하지 못하지만 높은 전류는 배아의 죽음을 초래할 수 있습니다. </li><li> 자궁 경부의 모든 배아에 대해 절차 (단계 1.5.7. ~ 1.5.10.)를 반복하고 복강 내로 부드럽게 다시 넣으십시오. </li><li> 다른 쪽에서 자궁 경적을 제거하고 proc을 반복하십시오.edure 1.5.7 단계에서 설명합니다. 1.5.11. </li><li> 마이크로 Adson 집게, Mathieu 바늘 홀더 (텅스텐 카바이드, 길이 : 14cm) 및 비 흡수성 수술 봉합사 (3 / 8 원형, 13mm, 테이퍼 포인트)를 사용하여 피부를 봉합하기 전에 근육 층을 봉합하여 복강을 닫으십시오. 주의 : 봉합하는 동안 자궁이나 다른 장기를 포착하지 않도록주의하십시오. </li><li> 조심스럽게 요오드 용액 (7.5 mg / mL)으로 피부 봉합사를 소독하고 셀룰로오스 면봉을 사용하여 석유 젤리의 과립 과다를 부드럽게 제거합니다. 그것이 일어날 때까지 적외선 램프 아래에 마우스를 놓습니다. 다음 2 일 동안 마우스를 밀접하게 모니터하십시오. 12 ~ 24 시간 후 1.5.2 절에 설명 된대로 진통 치료를 반복합니다. </li></ol></li></ol> 2. Organotypic 조각 문화 <ol><li> Laminin Stock Solution <ol><li> 1mg의 동결 건조 라미닌을 멸균 수에 용해시켜 1mg / mL 라미닌 스톡 용액을 얻는다. 50 μL 분취 량 준비-80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 폴리 -L- 라이신 원료 솔루션 <ol><li> 멸균 수에 폴리 -L- 라이신 50mg을 용해시켜 1mg / mL 폴리 -L- 라이신 스톡 용액을 얻는다. -20 ° C에서 0.5 ML aliquots과 저장을 준비합니다. </li></ol></li><li> 완벽한 행크의 균형 소금 솔루션 (완벽한 HBSS) <ol><li> 10x HBSS 용액 50mL, 1M HEPES 완충액 (pH 7.4) 1.25mL, 1M D- 글루코오스 용액 15mL, 100mM 염화칼슘 용액 5mL, 100mM 황산 마그네슘 5mL 1 M 탄산 수소 나트륨 용액 2 mL를 넣는다. 0.5L의 멸균 수를 멸균 필터에 넣고 4 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 슬라이스 문화 매체 <ol><li> 기본 중 독수리 (BME) 35 mL, 완전한 HBSS (2.3.1 절 참조), 1M D- 글루코스 1.35 mL, 200 mM L- 글루타민 0.25 mL 및 페니실린 - 스트렙토 마이신 0.5 mL를 슬라이스 배양액 50 mL를 얻는다.매질. 무균 여과기에 말 혈청을 최종 농도가 5 %가되도록 첨가합니다. 4 ° C에서 4 주 동안 보관하십시오. </li></ol></li><li> 저 융점 (LMP) 아가로 오스 솔루션 <ol><li> LMP 아가로 오스 1.5g을 50mL의 완전한 HBSS에 용해시켜 중력에서 1 ~ 2 분간 전자 렌지로 가열하여 3 % LMP 아가 로스 용액을 준비한다. 참고 : 끓는 동안 넘치지 않도록 열을주의 깊게 모니터링하십시오. </li><li> 사용할 준비가 될 때까지 38 ° C의 수조에 용액을 놓습니다. 4 ° C에서 보관하고 한 번 재사용하십시오. </li></ol></li><li> 멤브레인 삽입물 코팅 <ol><li> 라미닌 스톡 용액 (단계 2.1.1 참조)과 폴리 -L- 라이신 스톡 용액 (단계 2.2.1 참조)의 한 분취 량을 6 mL의 멸균 수에 첨가하여 코팅 용액을 얻습니다 (6 개 삽입에 충분 함) . </li><li> 각 우물 바닥에 2 ML의 멸균 물이 들어있는 6 잘 접시에 멤브레인 인서트를 놓습니다. 코팅액 1 mL를 넣고(2.6.1 단계 참조)를 각 막 위에 올려 놓고 37 ° C와 5 % 이산화탄소 대기에서 밤새 배양한다. 참고 : 폴리 테트라 플루오르 에틸렌 (PTFE) 멤브레인과 같은 광학적으로 투명한 멤브레인이있는 인서트 만 사용하십시오. </li><li> 1mL의 멸균 수로 막을 3 번 씻고 건조시킨다. 같은 날에 코팅 된 멤브레인을 사용하거나 4 ℃에서 깨끗한 6-well plate에 4 주 동안 보관하십시오. </li></ol></li><li> 뇌 절개 및 삽입 <ol><li> electroporation 2 일 후 기화기에 연결된 투명 챔버에 마우스를 넣고 5 % isoflurane으로 포화. 동물이 의식을 잃었을 때, 동물을 체임버에서 꺼내어 자궁 경관 탈구로 희생 시키십시오. </li><li> 배아를 포함하는 자궁을 제거하고 얼음처럼 차가운 완전한 HBSS와 10cm 페트리 접시에 넣습니다. 참고 :이 시점부터 모든 용액, 배아 및 뇌를 얼음에 보관하십시오. </li><li> 입체 현미경을 사용하여 미세하게 기울어 진 집게 (직선,11 cm)와 한 쌍의 Vannas Tübingen Spring Scissors (각진, 길이 : 9.5 cm)로 각 배아를 자궁과 분리하고 얼음으로 찬 완전한 HBSS가 들어있는 다른 배양 접시로 옮깁니다. </li><li> 뇌 줄기의 수준에서 절개를 만들고 시상 정중선을 따라 자릅니다. 뇌를 덮고있는 피부와 연골을 껍질을 벗기십시오. 그런 다음 뇌 반구 바로 뒤의 뇌간을 잘라 내고 두개골에서 뇌를 제거하십시오. ice-cold complete HBSS가 들어있는 12-well plate에 micro-spoon spatula (185mm x 5mm)로 뇌를 옮긴다. 12 - 웰 플레이트에있는 쓰레기에서 모든 두뇌를 수집합니다. </li><li> 형광 현미경을 사용하여 electroporated 지역의 크기뿐만 아니라 형광 밝기에 대한 12 - 웰 플레이트의 두뇌를 검사하십시오. 추가 처리를 위해 추정 체세포 감각 피질에서 밝은 형광 신호가있는 2 ~ 4 개의 뇌를 선택하십시오. </li><li> 38 ° C에서 3 % LMP 아가로 오스 솔루션을 부어 껍질을 벗기는 일회용 임베딩 금형에 넣으십시오. 리메이크전자 두뇌와 마이크로 숟가락 주걱으로 신중하게 티슈 페이퍼를 사용하여 뇌 주위에 과도한 완전한 HBSS를 배수구. </li><li> 두뇌를 아가로 오스 용액에 부드럽게 넣고 금형 바닥으로 밀어 넣고 20 게이지 바늘로 조심스럽게 위치를 조정합니다. 코로나 섹션의 경우, 위쪽을 향한 후각 구근과 함께 두뇌 방향을 맞 춥니 다. 아가로 오스 용액이 고형화 될 때까지 금형을 얼음에 보관하고 두뇌를 절개하십시오. </li></ol></li><li> Vibratome 단면 및 슬라이스 문화 <ol><li> 곰팡이에서 아가로 오스 블록을 제거하고 멸균 페트리 접시의 뚜껑에 놓습니다. 후각 구배 아래 약 2 ~ 3mm, 다른면의 아가로 오스 1mm를 남겨 놓은 깨끗한 면도날로 여분의 아가로 오스를 제거하십시오. 후각 구근이 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용하여 시험편 스테이지 아래쪽을 가리키는 트리밍 된 아가로 오스 블록을 고정하십시오. 참고 : 70 % 에타 노 장비 및 장비 소독l 절개하기 전에. </li><li> 얼음처럼 차가운 완전한 HBSS를 포함하는 진동 블레이드 마이크로톰의 슬라이싱 챔버로 시험편 스테이지를 옮기고, 블레이드를 향해 등쪽으로 두뇌를 위치시킨다. 0.9mm의 낮은 진폭과 중간 진폭의 electroporated 영역과 0.09-0.12mm / s의 매우 느린 섹션 속도를 포함하는 250um 두께의 뇌 조각을 자르십시오. 대개 밝은 형광 신호가있는 4 ~ 6 조각이 성공적으로 일렉트로 포 레이션 된 뇌에서 얻어집니다. </li><li> 구부러진 마이크로 숟가락 주걱과 미세 팁 집게로 주위 아가로 오스와 함께 뇌 조각을 얼음처럼 차가운 완전한 HBSS가 들어있는 6 웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 주의 : 전달하는 동안 집게가있는 부분 주위의 아가로 오스 테두리 만 만져서 뇌 조직을 손상시키지 않도록주의하십시오. </li><li> 2.8.1 단계에서 설명한대로 선택된 모든 뇌를 처리하십시오. 2.8.3. </li><li> 뇌 H1을 놓기 전에 멤브레인 인서트에 100 μL의 HBSS를 적 십니다슬라이스의 위치를 ​​용이하게하기 위해 막 상에 배치된다. 1 개의 멤브레인 인서트에 최대 5 개의 슬라이스를 놓을 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 구부러진 마이크로 숟가락 주걱과 미세 팁을 사용하여 막 위에 슬라이스를 옮깁니다. 부드럽게 포 퓰린으로 아가로 오스 테두리 만 만져 주걱에 슬라이스를 당겨 부드럽게 막에 주걱에서 슬라이스를 밀어. 포셉을 사용하여 슬라이스를 배치하고 나머지 슬라이스를 계속 전송하십시오. 과량의 완전한 HBSS를 피펫으로 제거하십시오. 주 : 조각을 서로 겹치지 마십시오. </li><li> 겸자의 도움으로 조심스럽게 슬라이스 배양 매체 (단계 2.4.1 참조)의 1.8 ML을 포함하는 6 잘 접시에 조각과 함께 멤브레인 인서트를 배치하고 저속까지 37 ° C와 5 % 이산화탄소 대기에서 품어 이미징. </li></ol></li></ol> 3. 시간 경과 영상 <ol><li> 현미경 설정 <ol><li> 기후 챔버를 무대 위에 놓습니다.반전 공 촛점 현미경으로 37 ° C 및 5 % 이산화탄소 대기로 옮겼습니다. 하이브리드 검출기를 사용하여 레이저 강도를 줄이고 세포 생존 능력을 향상시킵니다. 자세한 분석을 위해 0.6 이상의 개구 수를 가진 40X 건식 대물 렌즈를 사용하십시오. 참고 : 현미경의 모든 구성 요소는 이미징 프로세스 중에 안정적인 초점을 제공하기 위해 이미징 전에 2 ~ 3 시간 동안 37 ° C로 예열해야합니다. </li></ol></li><li> 슬라이스 이미징 <ol><li> 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 멤브레인 인서트를 포함하는 6 - 웰 플레이트에서 이미징을위한 뇌 조각을 선택합니다. 주의 : 자외선에 대한 노출 시간을 길게하지 마십시오. 이로 인해 세포가 손상 될 수 있습니다. 참고 : 상단 SVZ의 밝은 싱글 뉴런이있는 슬라이스를 슬라이스의 pial 표면쪽으로 반경 방향으로 이동합니다. 전체 CP를 가로 지르는 방사형 glial 세포의 미세 형광 과정은 손상되지 않은 방사상 glial scaffold를 나타냅니다.d는 반경 방향으로 피질 뉴런을 이동시킨다. </li><li> 포셉의 도움으로 슬라이스 문화 매체의 2 ML을 포함하는 50mm 직경 유리 바닥 접시에 시간 저속 이미징을 위해 선택된 슬라이스와 멤브레인 삽입을 전송합니다. 공 촛점 현미경의 기후 챔버에 접시를 놓습니다. </li><li> 해상도를 512 x 512 픽셀로 설정하고 스캔 속도를 400 Hz에서 700 Hz로 높이면 프레임 속도가 초당 약 1.4에서 약 2.5 프레임으로 증가합니다. 평균을 두 번 이상 사용하지 마십시오. 1.5 μm의 스텝 크기로 electroporated 영역 (일반적으로 400-100 μm의)을 통해 z - 스택을 정의합니다. 총체적으로,이 설정은 이미지의 충분한 해상도와 밝기를 허용하는 반면 수집 중에는 광 손상을 낮게 유지합니다. 30 분마다 z- 스택을 사용하여 저속 시리즈를 시작하십시오. 참고 : 슬라이스가 레이저 광선에 장시간 노출되면 광 손상이 생기고 세포의 생존 가능성이 감소합니다. 특급 조정이에 따라 레이저 광에 대한 충분한 시간. </li><li> ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/iij/) 또는 이에 상응하는 도구를 사용하여 시간 경과 시리즈를 분석하십시오. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+mechanisms+of+oriented+neuronal+migration+in+the+developing+brain.">Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).</li><li>Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+co-regulation+of+neuronal+migration+and+laminar+identity+in+the+neocortex.">Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex.</a> Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li><li>LoTurco, J. J., Bai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multipolar+stage+and+disruptions+in+neuronal+migration.">The multipolar stage and disruptions in neuronal migration.</a> Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).</li><li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases.">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipolar+migration:+the+third+mode+of+radial+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex.">Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).</li><li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proneural+transcription+factors+regulate+different+steps+of+cortical+neuron+migration+through+Rnd-mediated+inhibition+of+RhoA+signaling.">Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling.</a> Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).</li><li>Tabata, H., Nagata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+molecular+mechanisms+of+neuronal+migration+using+in+utero+electroporation.">Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation.</a> Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).</li><li>Wiegreffe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl11a+(Ctip1)+Controls+Migration+of+Cortical+Projection+Neurons+through+Regulation+of+Sema3c.">Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c.</a> Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).</li><li>John, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl11a+is+required+for+neuronal+morphogenesis+and+sensory+circuit+formation+in+dorsal+spinal+cord+development.">Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development.</a> Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal+development.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development.</a> Sci STKE. (136), pl9 (2002).</li><li>Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+logic+of+neocortical+projection+neuron+specification,+development+and+diversity.">Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).</li><li>De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-selective+electroporation+of+cortical+interneurons.">Subtype-selective electroporation of cortical interneurons.</a> J Vis Exp. (90), e51518 (2014).</li><li>Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+cerebellar+granule+neurons+in+vitro+and+in+vivo+to+study+neuronal+morphology+and+migration.">Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+electroporation+and+organotypic+slice+culture+of+mouse+hippocampal+tissue.">Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Simon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+of+Bcl11b/Ctip2+in+hippocampal+neurogenesis.">A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis.</a> EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).</li><li>Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+dose-dependent+cortical+neuronal+migration+and+neurite+extension+defects+in+Lis1+and+Ndel1+mutant+mice.">Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice.</a> J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).</li><li>Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+radial+migration+in+early+development+of+the+cerebral+cortex.">Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex.</a> Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).</li><li>Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+analyzing+neuronal+progenitor+development+and+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex.">Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).</li><li>Stubbs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+congruence+during+cerebral+cortical+development.">Neurovascular congruence during cerebral cortical development.</a> Cereb Cortex. 19, i32-i41 (2009).</li><li>Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trekking+across+the+brain:+the+journey+of+neuronal+migration.">Trekking across the brain: the journey of neuronal migration.</a> Cell. 128 (1), 29-43 (2007).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

방사상 이동은 신 코르 텍스 개발에서 중요한 과정입니다. 이 과정의 여러 단계에 영향을 미치는 유전자의 돌연변이는 열상과 백질 이형성증을 비롯한 심한 피질 기형을 유발할 수 있습니다 1 , 2 . 최근 우리는 젊은 이동 피질 투영 뉴런에서 발현되는 Bcl11a가 방사상 이동에 역할을한다는 것을 보여주었습니다. 우리는 electroporated 뇌의 급성 피질 조각에?...

신피질은인지 기능, 감정적 기능, 감각 기능의 주요 부위입니다. 그것은 뇌의 표면에 평행 한 6 개의 수평 층으로 구성되어 있습니다. 개발 도중에 망원 뇌파의 외벽에있는 전구 세포는 돌기 표면을 향해 반경 방향으로 이동하여 층 유형별 신경 신원을 얻는 투사 뉴런을 발생시킵니다. 심실 / 뇌실 영역 (VZ / SVZ)에서 생성 된 후 이러한 뉴런은 일시적으로 다 극성이되어 이동을 느리게합니다. 중간 구역 (IZ)에서 잠시 머무른 후에 그들은 양극 형태로 전환하고, 방사상 glial 비계에 부착하고, 대뇌 피질 판 (CP)으로 반경 방향으로 이동을 계속합니다. 최종 목표 투영 뉴런에 도달하자 뉴런은 방사상 glial 프로세스에서 분리하고 레이어 고유의 신원을 획득합니다. 신경 이식의 여러 단계에 영향을 미치는 유전자의 돌연변이는 가려움증과 같은 심한 피질 기형을 유발할 수 있습니다에필 리 또는 백색질에 테로 토피아 1 , 2 . utero에서 electroporation은 설치류 배아 3 , 4 의 개발 두뇌에서 신경 progenitor 세포를 transfect하는 빠르고 강력한 기술입니다. 이 기술을 사용하면 개발중인 뉴런에서 기능을 연구하기 위해 관심 유전자를 녹아웃 및 / 또는 과발현 할 수 있습니다. 이 방법은 형태 학적 세부 사항을 설명하고 방사상 이동 과정의 분자 메커니즘을 특성화하는 데 특히 도움이됩니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . 방사형으로 이동하는 뉴런은 시간이 지남에 따라 직접적이고 연속적인 관찰이 요구되는 이동성 방향뿐만 아니라 세포 형태, 이동 속도의 동적 변화를 겪습니다. Organotypic 슬라이스 cultuelectroporated 두뇌의 다시 및 저속 공 촛점 이미징은 시간이 지남에 마이 그 레이션 뉴런을 직접 관찰 할 수 있습니다. 이 결합 된 접근 방식을 사용하여 electroporated 두뇌의 고정 조직 섹션에서 조사 할 수없는 마이 그 레이션 뉴런의 독특한 기능을 분석하는 것이 가능합니다. 우리는 최근 electroporated 뇌의 슬라이스 배양에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징을 적용하여 피질 발달 10 동안 전사 인자 B 세포 CLL / 림프종 11a (Bcl11a)의 역할을 연구했습니다. Bcl11a는 젊은 이동 피질 뉴런에서 표현되며 우리는 조건 변이 Bcl11a 대립 유전자 ( Bcl11a flox ) 11 을 사용하여 그 기능을 연구했습니다. Cre recombinase와 녹색 형광 단백질 (GFP)을 Bcl11a flox / flox 뇌의 피질 전구 세포에 일렉트로 포 레이션 ( electroporation) 하면 모자이크 돌연변이 현상이 생겼다 .그렇지 않으면 야생형 배경. 이 방법으로 Bcl11a의 세포 자율 기능을 단일 세포 수준에서 연구하는 것이 가능했습니다. 우리는 Bcl11a 돌연변이 뉴런이 마이 그 레이션 중에 속도 감소, 속도 프로파일의 변화, 무작위 적 방향 변화를 보이는 것을 발견했습니다 10 . 약술 된 프로토콜에서 우리는 마우스 뇌의 성공적인 electroporation과 슬라이스 문화 준비 12 워크 플로우뿐만 아니라 피질 슬라이스 문화의 시간 경과 공 촛점 이미징을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>isoflurane</td><td>Abbott Laboratories&amp;nbsp;</td><td>506949</td><td>Forene</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Corning</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>non-absorbable surgical suture</td><td>Ethicon</td><td>K890H</td><td>3/8 circle, 13 mm, taper point</td></tr><tr><td>Micro Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td>serrated, length: 12 cm</td></tr><tr><td>fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-09</td><td>angled to side, length: 9 cm</td></tr><tr><td>Mathieu Needle Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12510-14</td><td>tungsten carbide, length: 14 cm</td></tr><tr><td>fine tipped forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td>straight, 11 cm</td></tr><tr><td>Vannas T&amp;uuml;bingen Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td>angled up, 9.5 cm</td></tr><tr><td>ring forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td>OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm</td></tr><tr><td>HBSS (10X)</td><td>Gibco</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>horse serum</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>borosilicate glass capillaries</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0016</td><td>1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm</td></tr><tr><td>anesthsesia system</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6471</td><td></td></tr><tr><td>anesthetizing chamber</td><td>Harvard Apparaus</td><td>34-0460</td><td></td></tr><tr><td>fluosorber filter canister</td><td>Harvard Apparaus</td><td>34-0415</td><td></td></tr><tr><td>low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>vibrating blade microtome</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence stereo microscope</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>stereo microscope</td><td>Leica</td><td>M125</td><td></td></tr><tr><td>inverted fluorescence tissue culture microscope</td><td>Leica</td><td>DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>confocal laser scanning microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SP5II</td><td></td></tr><tr><td>hybrid detector</td><td>Leica</td><td>HyD</td><td></td></tr><tr><td>objective, 40x/0.60 NA</td><td>Leica</td><td>11506201</td><td></td></tr><tr><td>microscope temperature control system</td><td>Life Imaging Services</td><td>Cube, Brick &amp;amp; Box</td><td></td></tr><tr><td>cell culture insert</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-45</td><td>use 38&amp;deg; angle for beveling</td></tr><tr><td>microinjector</td><td>Parker Hannifin&amp;nbsp;</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III</td></tr><tr><td>carprofen</td><td>Pfizer Animal Health</td><td>NDC 61106-8507</td><td>Rimadyl</td></tr><tr><td>emdedding mold</td><td>Polysciences</td><td>18986-1</td><td></td></tr><tr><td>endotoxin-free plasmid maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>magensium sulfate</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>square wave electroporator</td><td>Sonidel</td><td>CUY21EDIT</td><td></td></tr><tr><td>tweezers with 5 mm platinum disk electrodes</td><td>Sonidel</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>box filament</td><td>Sutter Instrument</td><td>FB255B</td><td>2.5 mm x 2.5 mm</td></tr><tr><td>micro-spoon spatula</td><td>VWR</td><td>231-0191</td><td>185 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>glass bottom dish, 50 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation

utero에서 electroporation은 마우스 배아를 개발하는 대뇌 피질의 방사형 이동 과정을 연구하는 빠르고 강력한 접근법입니다. 방사형 이동의 여러 단계를 설명하고이 과정을 제어하는 ​​분자 메커니즘을 특성화하는 데 도움이되었습니다. 마이 그 레이션 뉴런을 직접 및 동적으로 분석하기 위해서는 시간이 지남에 따라 추적해야합니다. 이 프로토콜은 utero electroporation과 organotypic 슬라이스 문화와 시간 경과 공 촛점 이미징을 결합하여 방사형으로 이동하는 대뇌 피질 뉴런의 직접 검사와 동적 분석을 가능하게하는 워크 플로우를 설명합니다. 또한 이동 속도, 속도 프로파일, 방사형 방향 변경과 같은 이동하는 뉴런의 상세한 특성화가 가능합니다. 상기 방법은 방사성 이동하는 피질 뉴런에서 관심있는 유전자의 기능적 분석을 기능의 손실 및 획득뿐만 아니라 구조 실험에 의해 용이하게 수행 할 수있다. 저속마이 그 레이션 뉴런의 이미징은 한번 설립 된 뉴런 마이 그 레이션 장애의 마우스 모델에서 대뇌 피질의 개발을 연구하는 강력한 도구입니다 국가의 첨단 기술입니다.

이전에는 자궁 전기에 의해 Bcl11a 유전자 결실 늦게 태어난 상층 뉴런 프로젝션 (10)의 반경 방향 이동을 손상시키는 것으로 나타났다. Cre 호텔-IRES-GFP DNA를 함유하는 플라스미드 벡터의 전기 효율적 flox / flox 뇌 11 조건부 Bcl11a에 Bcl11a 삭제. 우리가 electroporation 3 일 후에 E14.5 electroporated 뇌?...

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation at JoVE.com

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

이 프로토콜은 방사형으로 이동하는 피질 뉴런의 직접 관찰에 대한 지침을 제공합니다. utero electroporation, organotypic 슬라이스 문화, 그리고 시간 경과 공 촛점 이미징은 결합 뉴런에 관심 유전자의 overexpression 또는 downregulation의 효과를 직접적이고 동적으로 연구하고 개발하는 동안 그들의 차별을 분석합니다.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

time-lapse-confocal-imaging-migrating-neurons-organotypic-slice

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

10.2K 조회수.  Ulm University.  이 프로토콜은 방사형으로 이동하는 피질 뉴런의 직접 관찰에 대한 지침을 제공합니다. utero electroporation, organotypic 슬라이스 문화, 그리고 시간 경과 공 촛점 이미징은 결합 뉴런에 관심 유전자의 overexpression 또는 downregulation의 효과를 직접적이고 동적으로 연구하고 개발하는 동안 그들의 차별을 분석합니다. 

비디오: Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

의 Organotypic 슬라이스 문화 GFP - 표현 주변 신경 가지의 실시간 이미징을위한 마우스 배아를

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

연구

신경과학

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Visualizing Neuronal and Glial Cell Dynamics in the Developing Mouse Brain

Time-Lapse Imaging of Migrating Neurons and Glial Progenitors in Embryonic Mouse Brain Slices

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. This process is crucial for proper brain function, and its dysregulation can result in neurodevelopmental and psychiatric disorders after birth. In fact, many genes responsible for these diseases have been found to be involved in this process, and therefore, revealing how these mutations affect cellular dynamics is important for understanding the pathogenesis of these diseases. This protocol introduces a technique for time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors in brain slices obtained from mouse embryos. Cells are labeled with fluorescent proteins using in utero electroporation, which visualizes individual cells migrating from the ventricular zone with a high signal-to-noise ratio. Moreover, this in vivo gene transfer system enables us to easily perform gain-of-function or loss-of-function experiments on the given genes by co-electroporation of their expression or knockdown/knockout vectors. Using this protocol, the migratory behavior and migration speed of individual cells, information that is never obtained from fixed brains, can be analyzed.

저자 스포트라이트: Exploring Cell Migration and Gene Roles in the Developing Brain

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. Many genes are involved in this process. This protocol introduces the technique for the time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain ...

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터