생물학적 샘플에서 치티나제 활성 측정

이 방법은 생물학적 샘플에서 치티나제 활성을 정량화하는 보다 효과적인 방법을 허용합니다. 치티나제 활성은 수많은 조건 및 질병에서 진단 및 치료 효능에 대한 좋은 마커역할을 하는 것으로 나타났다. 치티나아제 활성의 측정을 위한 초기 방법은 종종 시간이 많이 걸리고 수행하기 어려웠으며, 여기에 도시된 분석에 의해 해결된 두 가지 문제 모두.

이 기술은 치티나아제 활성을 보다 쉽게 측정할 수 있도록 함으로써 진단 및 치료 마커로서 갖는 잠재적치티나아제의 잠재적 인 치티나아제(chitinase) 활성이 효과적인 치료 중에 감소하는 것으로 나타났기 때문에 고처 질환의 치료를 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 분석법을 위한 기판, 표준 및 솔루션을 준비하여 시작합니다. 원고 방향에 따라 1x McIlvain 버퍼를 준비하고 치틴 기판을 각각 500 마이크로몰라로 희석하는 데 사용합니다.

표준인 4-메틸럼벨리퍼론을 스톱 버퍼에 0.1 밀리머의 농도로 녹여 표준 곡선 스톡 솔루션을 만듭니다. 매 10개의 견본을 위해, 1x McIlvain 버퍼의 2.17 밀리리터를 치틴 기판의 100 마이크로리터와 혼합하여 작동 용액을 만든 다음, 96웰 플레이트의 각 웰에 작업 용액의 파이펫 95 마이크로리터를 넣습니다. 각 음에 테스트 샘플의 5 마이크로리터를 추가하고 작업 솔루션에 혼합합니다.

접시를 덮고 5초 동안 흔들어서 15분간 37도의 플레이트를 배양하여 효소 반응이 일어날 수 있도록 합니다. 한편, 4-메틸럼벨리퍼론의 스톡 용액을 희석시켜 5마이크로몰러 작업 표준 솔루션을 만들고 원고에 따라 일련의 희석을 준비하여 표준 곡선을 만듭니다. 5 마이크로몰라 농도로 시작하여 각 희석을 잘 섞습니다.

인큐베이션 후, 반응을 중지각 우물에 정지 버퍼의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 동일한 플레이트에 각 표준의 300 마이크로리터 복제본을 추가한 다음 360나노미터의 발산과 455나노미터의 방출로 플레이트를 읽습니다. 이 프로토콜은 성공적으로 야생 유형의 기관지 정맥포 라베이지 및 혈청 액체에서 치티나제 활성을 측정하는 데 사용되었으며, 키토트리오시다제는 과발현형 형질성 마우스를 발현하였다.

상기 분석은 마우스에서 CHIT-1 유전자의 과발현이 증가된 치티나아제 활성을 초래한다는 것을 확인한다. 표준 곡선은 샘플의 형광에 기초하여 치티나아제를 결정하는 데 사용되었다. 프로토콜을 처음 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 샘플을 가능한 한 빠르고 효율적으로 추가하는 동시에 철저하게 혼합하는 것입니다.

처음 시작하면 잠복기가 짧기 때문에 측정의 정확성을 보장하기 위해 실행당 적은 샘플을 수행하는 것이 도움이 될 수 있습니다.