This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.

세균 및 펩티도 글리 기판 1. 준비 주 : 전 세포 세균 펩티 기판 정제가 확산하는 마이크로 분석 및 염료 방출 분석 모두에서 효소 기질로서 사용된다. 이 기판은 효소 반응을 수행하기 전에 준비가 필요합니다. 다음 프로토콜은 자신의 준비에 대해 설명합니다. <ol><li> 전체 세균 세포 기질 <ol><li> 고초균 (168)의 2 mL의 하룻밤 배양하여 영양 액체 배지 500 ㎖에 접종하여 박테리아 세포 기질을 생산 (아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션, ATCC 23857 참조). 문화는 박테리아 문화의 두 배의 결과로 급속한 성장 단계로 정의 성장 지수 단계를 도달 할 때까지 (125 회전)을 진탕 30 ° C에서 품어. 살모넬라 엔테 subsp의 재배. 엔테 (ATCC 10708), (125 회전)을 진탕 37 ° C에서 성장 매체로 영양 국물을 사용합니다. </li&gt; <li> 압력이 3 기압에서 121 ° C에서 10 분 동안 고온 가압 멸균하여 각 문화를 열-죽인다. </li><li> 5000 x g에서 20 분간 원심 분리하여 가열 살해 박테리아 기판 수확. 타입 1 물과 펠렛을 세번 세척하고 소량의 물에 재현 탁. 본 연구에서는 1200 μL의 기판을 일시 중지합니다. </li><li> 분취 액을 20 ℃에서 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브 및 저장소 박테리아 세포 기질 300 μL. </li></ol></li><li> 정제 된 펩티도 글리 기판 <ol><li> (재료 및 장비 표 참조) 대상 기판 박테리아 7-10에서 펩티도 글리 정화 또는 공급 업체로부터 취득. 액세서리 세포 벽 폴리머에서 원유 펩티도 글리 준비를 정화. </li></ol></li></ol> 2. 질적하는 마이크로 확산 분석 [Lachica에서 수정, 등. 11] 주 : 마이크로 슬라이드 확산 분석은샘플에 항균성 효소의 존재를 검출하기위한 정 성적 방법. 효소는 아가로 오스 함유 매트릭스 기판을 통해 확산로서 효소가 기질을 가수 분해와 같은 정화 영역이 발생한다. 다음 프로토콜 정성 단백질 항생제의 존재를 검출하는 마이크로 확산 분석의 제조 및 성능을 설명한다. <ol><li> 제조사의 프로토콜에 따라 Bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 키트를 사용하여 평가 될 미생물 효소의 농도를 결정한다. </li><li> 효소 버퍼로서 인산 완충 식염수 (PBS)를 이용한다; 그러나 경험적으로 주어진 효소에 대한 버퍼 적절한를 결정한다. </li><li> 반응 버퍼로서 인산 완충 식염수 (PBS)를 사용하여 항균성 효소의 일련의 희석을 수행한다. 이러한하는 마이크로 확산 분석에 사용 된 용액을 희석 0 페이지, 10 페이지, 100 페이지, 1 NG, 10 ng의 100 NG, 1 μg의, 1의 최종 분석 단백질 질량을 생산반응 부피 당 0 μg의. </li><li> 개인의 microfuge 튜브에 단백질 질량을 분배 및 반응 우물을하는 마이크로 이외에 준비에 PBS를 사용 μL (20) 단백질의 볼륨을 조정합니다. </li><li> PBS 50 ㎖로 오스 0.25 g을 용해하여 0.5 % 아가 로스 수용액을 만든다. 아가로 오스가 완전히 용해 될 때까지 종기에 대한 해결책을 가열한다. 중량 용융 과정에서 손실 된 물을 결정하고이 용액에 다시 추가 할 수 있습니다. </li><li> 아가로 오스 용액을 물에 10 % 아 지드 화 나트륨의 50 μL를 추가 한 수욕에서 50 ℃로, 용액의 온도를 조절한다. 소듐 아자 이드는 마이크로 슬라이드 확산 분석 배양시 세균의 증식을 억제하는 오염 첨가된다. 생존 세포를 기판으로 사용하는 경우, 아가로 오스 용액의 아 지드 화 나트륨을 생략합니다. </li><li> 얼음에 열 살해 박테리아 기판을 해동. </li><li> 다시 일시 약로 오스 용액 12 ㎖ 중의 세균 기판은 2.0 MCF 탁도 일치아란은 (재료 표 참조) 표준는 등가. 대략 탁도가 달성 될 때까지 아가로 세균 기판을 추가하여 솔루션을 통해, 흰색 배경에 검은 색 선을 시각화하여 용액의 탁도를 비교한다. </li><li> 즉시 각 마이크로 슬라이드 (25 X 75 X 1mm 3)로 오스 - 기질 용액 3 ㎖를 피펫. </li><li> 슬라이드 고화 후, 코르크 나방 (4.8 mm 직경)을 사용하는 마이크로 각각의 아가 기판 층에 세 개의 웰 펀치. 각각의 웰에 각각 조정 된 단백질 용액을 희석 20 μl를 추가합니다. </li><li> 또한 음성 대조군으로 PBS (20 μL) 또는 소 혈청 알부민 (20 μl의 PBS에 5 μg의)를 사용합니다. 양성 대조군으로, 리소자임 등 같은 기판에 적합한 공지 bacteriolytic 효소를 사용한다. </li><li> 37 ℃, 습도 챔버에 슬라이드 또는 효소의 최적 활성 온도 부화. 배양의 길이는 농도에 의존하고항균 효소의 특정 활동. 전형적인 반응 시간은 밤새 (약 16 시간)입니다. </li><li> 배양 후 약 30cm의 초점 거리에서 60mm 렌즈와 디지털 일안 리플렉스 카메라를 사용하여 현상 분석의 간접 광 캡처 이미지 아래 슬라이드를 관찰한다. 주 : 특정 기판 용 항균 단백질의 효소 활성은 효소는 아가로 확산으로 잘 해결 형성 가수 투명한 영역의 발전과 관련된다. </li><li> 효소의 활동을 한정하기 위해, 각 웰 주위에 형성 영역의 크기를 관찰합니다. 낮은 효소 활성을 정량적으로 작은 영역에 관한 동안 높은 효소 활성을 정량적으로 더 큰 영역에 관한 것이다. </li></ol> 3. 기판 라벨 - Remazol 브릴리언트 블루 R 염료 라벨은 [서주 (12)로부터 수정] 주 : 염료 방출 분석에서, 기판은 공유 결합이다 LINKED는 화려한 푸른 R 염료를 Remazol합니다. 다음 프로토콜 염색 효소 기질의 제조를 설명한다. <ol><li> 타입 I, 물 99 ㎖에 1g의 NaOH를 용해시켜 250 mM의 수산화 나트륨 (NaOH) 용액을가 200㎜, Remazol 브릴리언트 블루 R 염색 (RBB) 용액을 만드는 데 사용된다. </li><li> 신선한 250 mM의 NaOH 용액 (3.1 단계)의 98.75 ml의 ± 1 mL에 1.25 g의 RBB을 용해하여 200 밀리미터 RBB 솔루션을합니다. </li><li> RBB 용액 30 ㎖ 중의 0.5 g 습윤 중량의 농도로 가열 살해 균체를 다시 일시. 정제 펩티 들어 RBB 용액 30 ㎖ 중의 0.3 g 습윤 중량의 농도 펩티을 다시 일시 중지. </li><li> 부드럽게 혼합하면서 37 ℃에서 6 시간 동안 회전 플랫폼 삼각 플라스크 내의 반​​응 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 4 ° C 배양기에 반응 혼합물을 전송, 부드러운 혼합과 함께 추가로 12 시간 동안 배양한다. </li><li> 배양 후, 3000 XG에서 원심 분리하여 염색 기판을 수확30 분 동안. 기판 펠릿의 염료 용액을 경사 분리한다. </li><li> 원심 분리 유형 I의 물로 반복 (약 3 ~ 5 세척)을 염료 표지 된 세포 또는 펩티도 글리을 세척하여 기판에서 비 공유 결합 수용성 염료를 제거합니다. 각각의 물을 추가로 철저하게 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 참고 : 언 바운드, 수용성 염료가 더 이상 원심 분리 후 물 세척에서 볼 수없는 경우. 기판은 하나의 부가적인 세척을 부여한다. 마지막 세척의 상등액을 알 수있는 반면 기판은, 푸른 남아 있습니다. </li><li> 나중에 사용하기 위해 -20 ℃에서 소량의 물에 현탁 염색 기재를 저장한다. </li></ol> 4. 양적 염료 방출 분석 주 : 염료 방출 시험 동안, 반응 상층 액으로 제품을 염색 효소 반응 릴리스 RBB 염색 기질의 가수 분해. 릴리스 염료의 양의 측정은 색도계 AMO를 나타낸다특정 효소 시료 내에 존재하는 효소 활성의 UNT. 정량 방법은, 기판에 걸쳐 상이한 효소의 비교를 허용하고 효소 반응 (예, 온도, 염도, pH를)를 좌우하는 환경 조건의 변화를 허용한다. 다음 프로토콜은 정량적 단백질 항균제의 효소 활성을 검출하는 염료 방출 분석의 제조 및 성능을 설명한다. <ol><li> 염료 분리 분석을위한 준비 <ol><li> 냉동 염색 기판을 실온으로 돌아가 경험적으로 주어진 효소에 대한 결정 분석 완충액 (PBS)로 두 번 세척 할 수 있습니다. </li><li> 수행 될 염료 방출 분석법 숫자로 200 ㎕의 반응 부피를 곱하여 필요 기판 현탁액의 부피를 계산한다. </li><li> (광학 밀도까지 4.1.2 결정 분석 완충액의 부피, 염색 기재를 첨가하여 기판 현탁액을 제조2.0 OD)를 분광 광도계를 사용하여 595 nm에서 달성된다. 농축 된 용액의 1 희석 : 분광 광도계의 기능적인 한계 내에서 유지하기 위해, 1 1.0과 2.0 OD 595을 측정한다. 빈으로 분석 버퍼를 사용합니다. 주의 : 반응 기판 탁도 고효율 효소의 활동 수준에 맞게 2.0 이상으로 상승 될 수있다. </li><li> 단백질 항균성을 중단하는 일 ㎎ / ㎖의 농도에서 추정 된 분석 완충액으로 평가한다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 BCA 단백질 분석 키트의 마이크로 분석법을 이용하여 단백질 시료의 실제 농도가 정량되도록 결정한다. mL의 분석 완충액을 사용하여 / 1 mg의 재고 현탁액의 농도를 조절한다. </li></ol></li><li> 단백질 항균을위한 최적의 배양 조건을 결정하기 위해 염료 방출 분석을 사용하여 <ol><li> 100 NG / μL에 주식 단백질 항균 서스펜션을 희석. 이 농도는 AF를 제공합니다볼륨 (10 μL) 당 단백질 1 μg의 원고 판의 반응 매스 분석 반응에 첨가 하였다. </li><li> 열 범위를 결정하는 bacteriolytic 단백질을 평가한다. 이러한 분석에 열 범위는 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C, 65 ° C를 포함했다. </li><li> 0.5 ㎖의 미세 원심 분리 관에서의 반응 분석을 수행한다. 각 열 조건, 준비 기판 서스펜션의 200 μL에 주식 단백질의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 한 시간에 한 번 반전에 의해 혼합하여 8 시간 동안 열 자전거 타는 사람에 품어. </li><li> 인큐베이션 후, 에탄올 25 μl를 첨가하여 반응을 정지. </li><li> 2 분 동안 3000 × g으로 원심 분리하여 소화 불용성 기재를 제거하고, 소화 기판의 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서, 96 웰 편평 바닥 마이크로 플레이트에 각각의 반응 혼합물에 대해 반응 상등액 150 μL를 옮긴다. </li><li> antimicrob 단백질의 효소 활성을 측정가용성 RBB 염료의 양을 결정함으로써 주어진 기판 IAL은 효소 가수 분해 후 기판으로부터 해리. 효소 활성을 정량화하기 위해, 마이크로 플레이트 분광 광도계를 사용하여 595 nm에서 상층 액의 흡광도를 측정한다. 표지 기판으로부터 상층 액에 발표 된 수용성 염료로 증가 흡광도를 효소 활성의 정량적 측정이다. 주 : 흡광도의 변화는 활성 단위 (AU)로 표시되는 경우 595 nm에서 염료 방출 반응 상청액의 광학 밀도의 증가는 0.01 AU 한 결과. 효소를 제외한 모든 반응 구성 요소와 함께 배양 빈 반응은 상기 RBB 표지 기판으로부터 인해 배양에 방출하는 염료를 빼기 위해 사용된다. 최적 온도 효소 활성의 피크 부 측정을 제공한다. </li><li> 반복 4.2.7 내지 4.2.1 미생물 효소에 대한 최적의 버퍼 상태를 결정하기 위해, 다양한 배양 버퍼를 사용하는 단계. t에서HESE 분석은, PBS를 사용합니다. </li></ol></li><li> 색소 분리 분석법을 이용하면 항균 단백질에 대한 최적의 배양 온도에서 최소 활성 농도를 결정하는 <ol><li> 분석 완충액을 사용하여 재고 항균 단백질 현탁액의 일련의 희석을 수행한다. 희석 계열 범위 항균성 효소의 활성에 따라 달라진다. 이 분석에 사용 된 용액을 희석 0 페이지, 10 페이지, 100 페이지, 1 NG, 10 ng의 100 NG, 1 μg의, 10 μg의 최종 분석 단백질 양을 생산했다. </li><li> 48 웰 평평한 바닥 마이크로 플레이트의 각 반응 분석을 수행합니다. 각각의 분석 조건의 경우, 준비된 기판 서스펜션의 200 μL에 각각의 단백질 현탁액의 10 μl를 추가합니다. 반응 완충액을 사용하여 10 ㎕의 반응로에 첨가 된 단백질 용액의 부피의 어떠한 변화를 조정한다. </li><li> 증발에 의한 부피 변화를 방지하기 위해 플레이트 밀봉 막과 마이크로 밀봉. 결정된 최적의에서 진탕 배양기에서 품어진탕 16 시간 동안 항균 주어진 단백질 cubation 온도. </li><li> 인큐베이션 후, 각각의 에탄올 25 μl를 첨가하여 반응을 정지 아니라 2 분 동안 3000 × g으로 원심 분리하여 소화 기판을 제거한다. </li><li> 소화되지 않은 기판의 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서, 96 웰 편평 바닥 마이크로 플레이트에 각각의 반응 혼합물에 대해 반응 상등액 150 μL를 옮긴다. </li><li> 효소 활성을 정량화하기 위해, 마이크로 플레이트 분광 광도계를 사용하여 595 nm에서 상층 액의 흡광도를 측정한다. 효소를 제외한 모든 반응 구성 요소와 함께 배양 빈 반응은 상기 RBB 표지 기판으로부터 인해 배양에 방출하는 염료를 빼기 위해 사용된다. 표지 기판으로부터 상층 액에 발표 된 수용성 염료로 증가 흡광도를 효소 활성을 정량적 측정을 제공합니다. 참고 : 흡광도의 변화가 활동 단위 (AU), 1 AU 결과로 표현된다595 nm에서의 염료 방출 반응 상청액의 광학 밀도의 증가를 0.01. </li></ol></li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다. MITRE Corporation은 여러 연방 정부의 재정 지원 연구 개발 센터 (FFRDCs)를 작동하는 비영리 회사입니다.

하는 마이크로 확산 분석 및 염료 방출 분석은 이전에 검출 및 미확인 된 단백질을 특성화 항생제 효과를 제공한다. 이 신속하고 민감한 방법은 더 많은 연구 자원을 투자하기 전에 관심이 효소의 식별을위한 생물 소스 라이브러리의 높은 처리량 검사를 할 수 있습니다. 명확한 표적 효소가 발견되기 때문에, 검출 분석의 변형이 급격히 효소를 검출하거나 효소의 생화학 적 특성을 결정하기 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 다단계 단백질 정제 기법 중에 확산하는 마이크로 분석 급속 관심 효소를 함유하는 분획을 검출 할 수있다. 또한, 효소 반응 OPTIMA 염료 방출 분석에서 반응 버퍼 및 배양 온도 변화에 의해 결정될 수있다. 하는 마이크로 확산 분석에서의 검출에 필요한 효소 질량의 범위는 효소 c​​haracteri의 함수stics. 분석의 검출 한계는 일반적으로 염료를 방출 분석법보다 더 많은 양의 효소의 사용을 필요로한다. 이 연구에서, 상기 염료 방출 분석 (도 4)로하는 마이크로 확산 분석 (도 1)의 검출 한계 비교를하는 마이크로 확산 분석법 염료 방출 분석보다 덜 민감한 기술임을 도시. 효소 농도가 중요하지 않은 경우, 마이크로 슬라이드 분석은 낮은 노동 및 설비 요구에 대하여 타깃 기판 단백질 항균제의 제조를위한 라이브러리의 신속한 초기 선별을 허용한다. 많은 노력과 장비를 필요로하지만, 염료 방출 분석은 주어진 기판에 대해 동일하거나 상이한 효소 염료 방출 분석법 간의 비교를 정량적 결과를 얻었다 더 민감하고 재현성이다. 두 가지 방법을 쉽게 고도의 전문 장비 필요없이 대부분의 미생물 실험실에서 수행된다. representa에서하는 마이크로 확산 분석에서 검출 된 상기 최소한 1 μg의 (도시되지 않은 데이터) 동안적인 분석은, 제어 효소 α-키모 트립신은 염료 방출 분석을 이용하여 100 NG (도 5)의 낮은 양으로 발견되었다. 항균성 효소 질적 검출법으로 유틸리티를 제공 확산 분석의 다수의 변형 11,13보고되었다. 이러한 분석을 검토에서하는 마이크로 확산 분석은 초기 화면으로 상대적으로 높은 감도와 반응 준수의 용이성을 위해 개발되었다. 단백질은으로 우물에서 확산로 아가 오버레이 포도상 구균 균주에 의해 뉴 클레아 제의 생산을 검출하기 위해 사용 된에 Lachica 외. (11)의 작업에서 수정 상기 마이크로 슬라이드 확산 분석법 방사상 면역 확산 방법 (14)와 유사하게 작동 아가로 기판을 포함. 반경 방향 immunodiffu시스템은 아가 내의 확산 항원과 항체 간의 복합체 형성의 평형에 도달 할 때 시온 방법은 면역의 영역의 확장을 중지. 대조적으로, 마이크로 슬라이드 확산 분석의 기판은 초기에 잘 용해 주변의 계속 확장 영역에서 확산 항균 단백질에 의해 분해된다. 효소가 활성을 잃는다 또는 기판이 소진 될 때까지 영역의 증가 직경이 계속됩니다. 용해 구역의 생산 속도는 효소의 순도, 따라서 특정 활동으로 소생 또는 효소의 농도가 증가 웰에 첨가 하였다. 정량적 열 사망 단백질 B. 대해 항균제의 효소 활성을 평가하기위한 서브 틸리 스, 염료 자료 분석은 선택되었다. Remazol 화려한 푸른 R 염료 (RBB)를 사용하여 비색 분석은 기질 단백질 항균 activi의 다양하고 중요한 평가를 할 수 - 표지타이. 쉽게 595 nm에서 분광 광도계로 측정 할 수 가용성 청색 제품 릴리스 RBB 표지 기판 결과의 효소 가수 분해. 다른 항균 단백질 효소의 특성을 개발 RBB 염료 방출 분석의 여러 변형, 다른 기판과 응용 프로그램이 분석의 유연성을 보여준다. 예를 들어, 활성 bacteriolytic lysostaphin의 효과를 결정하는데, 저우, 등., RBB 염색 포도상 구균 세포 및 기판 (12)을 이용하여 포도상 구균 펩티 색소 분리 분석법을보고 하였다. 이 RBB 염료 방출 분석의 응용 예의 변형 예에서, RBB 표지 마이크로 코커스 루 테우스 (Micrococcus luteus) 기판은 세균성 감염과 악성 종양의 존재와 같은 질병을 진단하기위한 빠르고 민감한 방법으로 사용 스크린 제안 된 수 혈청 15 인간 리소자임 발현 수준과 상관 될 수있다. 또한, RBB 표지 된 박테리아 세포 기질을 가지고LSO 리소자임 (16)의 검출을위한 방법 zymogram 사용되고. 우리는 효소 생산을위한 빠른 라이브러리 스크리닝을 허용, 염료 자료 분석의 저하 검출 한계, 편리 성 및 재현성을 보여줍니다. 분석의 수정은 온도, pH, 염분의 효과뿐만 아니라 항균 단백질 (6)의 활성에 다른 단백질 분해 효소의 효과를 포함 하류 정량적 생화학 적 특성 분석을 위해 수 있습니다. 또한, 정량적 인 염료 방출 분석은 주어진 기판에 대해 여러 효소의 활성을 비교하기 위해 사용될 수있다. RBB 염료 자료 분석은 특성화 및 단백질 항균제 검출 외에 다당류에 대한 활성을 갖는 효소 유틸리티를보고했습니다. Pettersson이와 에릭손은 셀룰로스, 자일란, 만난 및 전표의 비정질, RBB 염색 폴리 사카 라이드 비드를 사용하여 endoglycanase 활동을 검출하는 분석보고십칠인치 이러한 연구 결과의 확장에서, 바실러스 투 린지 엔시스 비티-107에 의해 생성 키티 나제 효소의 검출을위한 중요한 방법은 RBB (18)로 표지 콜로 이달 키틴을 사용하여 개발되었다. 이들과 다른 연구, RBB 염색 기판 시판 소스 케라틴, 아밀로펙틴, 아밀로스, 글리코겐, 라미 나린, D- 자일란, 아조 - 보리 글루칸 전분 대 포함한 당분 활성의 검출에 사용 나왔다. 본 연구에서는 비색 결과를 생성하는 데 필요한 RBB 표지 된 기질 및 효소의 양을 감소시키는, 마이크로 포맷 염료 방출 분석의 유용성을 입증한다. 도 4 및도 5에 도시 된 바와 같이, 마이크로 염료 방출 분석은 효소 활성 검출 용 마이크로 슬라이드 확산 분석법보다 더 낮은 검출 한계를 제공한다. 해석의 신속한 사용에 관하여, 노동의 보존, 그리고 쉽게, 마이크roslide 확산 분석은 항균 활성의 존재뿐만 아니라 다운 스트림 단백질 분리 및 정제 단계에서 항균 단백질 존재의 표시에 대한 초기 높은 처리량 화면에서 유틸리티를 제공합니다. 두 분석의 조합은 신규 한 단백질 항균제의 초기 스크리닝 및 특성화 궁극적으로 서로를 보완

Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and &#945;-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.

<table><tbody><tr><td>48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid</td><td>Becton Dickinson</td><td>3078</td><td></td></tr><tr><td>96-well flat-bottom microplate (Costar 3595)</td><td>Corning, Inc.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP162-100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-chymotrypsin</td><td>MP Biomedicals</td><td>215227205</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis 168</td><td>American Type Culture Collection</td><td>23857</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cork borer</td><td>Humboldt</td><td>H-9661</td><td></td></tr><tr><td>lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>McFarland equivalence standard (2.0)</td><td>Fisher Scientific</td><td>R20412</td><td></td></tr><tr><td>microslides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-38-103</td><td></td></tr><tr><td>nutrient broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25959B</td><td></td></tr><tr><td>peptidoglycan of &lt;em&gt;Bacillus subtilis&lt;/em&gt; 168</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69554-10MG-F</td><td></td></tr><tr><td>phosphate-buffered saline (1x)</td><td>Teknova</td><td>P0200</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HT microplate spectrophotometer</td><td>BioTek Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Remazol brilliant blue R dye (RBB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8001</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica subsp. enterica</td><td>American Type Culture Collection</td><td>10708</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227-100</td><td></td></tr><tr><td>sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film</td><td>Diversified Biotechnology</td><td>T-TOPS-50</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure distilled water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agarose solution&lt;br/&gt; 50 ml PBS&lt;br/&gt; 0.25 g agarose</td><td></td><td></td><td>Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution</td></tr><tr><td>nutrient broth medium&lt;br/&gt; 4 g nutrient broth&lt;br/&gt; 500 ml Type I water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mM sodium hydroxide (NaOH) solution&lt;br/&gt; 1 g NaOH&lt;br/&gt; 99 ml Type I water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mM Remazol brilliant blue R dye (RBB)&lt;br/&gt; 1.25 g RBB&lt;br/&gt; 98.75 ml 250 mM NaOH solution</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

하는 마이크로 확산 분석 및 정량 염료 방출 스크리닝 분석은 새로운 단백질 항생제 초기 조사를 측정하기위한 효과적인 방법이다. 각각의 분석은 장점과 한계가 있습니다; 함께 수행하면 이들은 빠른 초기 스크리닝 및 항균제의 기본 특성을 허용한다. 하는 마이크로 확산 분석을 효율적으로 단백질 항생제를 생산하는 미생물 라이브러리의 신속한 선별을 허용한다. 효소 농도 수준이 관심사 인 경우, 검출 감도 제약 반응보다 잘 염료 방출 분석에 추가 될 효소의 더 많은 양을 필요로 분석을 제한 할 수있다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 분석의 정성적인 특성은 관찰자가 각 웰 내에 존재하는 효소의 상대 량을 비교할 수. &quot;1&quot;&gt;도 1a에 도시 된 용해의 현상 영역에서, (25 효소 μg의) 영역의 리딩 에지는 상기 기판의 혼탁 또는 불완전 분해를 표시하면서도에 가장 가까운 영역 보다 완벽한 기판 용해를 표시합니다. 이 현상은, 선단에 확산 효소의 감소하는 농도의 생성물은 영역 직경의 정확한 측정을 복잡하게한다. 그림 1에서 관찰 된 웰 B (15 μg의), C (10 μg의), D (5 μg의), E (1.0 μg의)을하고, F (0.1 μg의)로서, 완전한 용해의 영역의 직경은 멸종 발산 효소의 감소 된 양에 상관. 조건 F (0.1 μg의) 경우, 아가 내의 효소 농도는 상기 기판을 가수 분해하여, 아가로 오스를 통해 이동함에 따라 확산 효소를 시각화 할 수 있도록 한계 이하이다. 하는 마이크로 확산 분석은 정제 된 바실러스 서브 틸리 pepti를 사용하여 실행 된기판으로 doglycan (그림 2). 영역 인해 균일 아가에서 정지하는 펩티도 글리 칸의 릴럭 턴스에 전체 세포 살모넬라 엔테 관찰보다 덜 정의되어 있지만, 미지의 미생물 효소에 의해 가수 분해 펩티은 명백하다. 염료 방출 분석은 효소 반응에 영향을주는 환경 적 요인의 낮은 검출 한계와 편차를 허용하는 마이크로 슬라이드 확산 분석법보다 더 민감하고 다양한 분석이다. 대표적인 분석에서, 온도는 미생물 효소에 대한 최적의 온도를 결정하기 위해 변화시키고, 35 ℃의 PBS (도 3)으로 결정된다. 이 최적의 푸른 색상 (도 3b)과 595 nm의 (도 3A)에서의 흡광도를 측정으로부터 유도 활성 단위로 나타낸 바와 같이 증가 된 양으로 반응 상청액 분명히 알 수있다. 그만큼염료 방출 분석의 다양성은 연구자가 급속히 소정 효소의 최적 배양 조건을 결정하는 것은 온도뿐만 아니라 반응 완충액 버퍼 구성 요소뿐만 아니라 다양 할 수있다. 미지의 미생물 효소 (도 4) 및 α-키모 트립신 제어 효소 (도 5)의 활동 수준이 RBB 표지 고초균 열 킬드 기판 대 PBS에 35 ° C의 결정된 최적의 배양 온도에서 측정 하였다. 도 4 및도 5의 결과의 비교는 미지의 미생물 효소는 B. 거의 두 배의 친화력이 것을 나타낸다 서브 틸리 기판. 또한, α-키모 트립신 제어 완전히 열 살해 B. 다이제스트 않았다 웰 내의 서브 틸리 기판 (데이터는 보이지 않음). 키모 트립신, α-제어의 활성 플레이트 시작AU 약 0.3 μg의 미지의 미생물 효소 (도 4 및도 5)에 대한 모든 효소의 양에 걸쳐 활성 단위의 지속적인 상승과 비교. 이는 미지의 효소를 더 지속 활성을 갖는 것이거나 B. 내의 효소 절단 부위 가능한 더 많은 수 있다는 것을 나타낼 수있다 서브 틸리 기판. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig1.jpg" /> 그림 1. 살모넬라 엔테 전체 셀 기판에 대하여 효소 활동하는 마이크로 확산 분석은 정 성적으로 가열 사망 살모넬라 엔테 subsp 대하여 미지의 단백질의 항균 활성을 평가 하였다 엔테를 (ATCC 10708).. 의 각각의 웰에 첨가하고 인산 완충 식염수 (PBS)에 현탁하고, 미지의 미생물의 단백질 질량슬라이드 포함 25 μg의 (물론 A), μg의 (물론 B), 10 μg의 15 (물론 C), 5 μg의 (물론 D), 1 μg의 (물론 E), 0.1 μg의 (물론 F). PBS 단독 분석법의 음성 대조군에 사용 하였다. 용해의 영역은 6 시간 배양 후 몇 군데 있었다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53819/53819fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig2.jpg" /> 그림 2. 효소 활성 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)에 대해는 펩티도 글리 칸 세포 벽하는 마이크로 확산 분석은 정 성적으로 바실러스 서브 틸리 스 (168)의 펩티도 글리 칸에 대해 미지의 단백질의 항균 활성을 평가 하였다. PBS의 20 μL, 알 수없는 항균 10 μg의 현탁 잘 상기 microslides의 추가되었습니다. PBS 단독으로 음극으로서 사용했다분석 (물론 B)에 대한 제어 할 수 있습니다. 용해의 영역이 37 ° C에서 6 시간 배양 후 몇 군데 있었다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53819/53819fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig3.jpg" /> 도 3 :. 프로틴의 최적 반응 온도는 항균 염료 방출 분석의 다양성 관심 (6)의 효소의 활성에 대한 그들의 영향을 결정하기 위해 그러한 배양 온도 및 버퍼와 같은 물리 화학적 파라미터의 변화를 허용한다. 이 도면에 도시 된 바와 같이, 미지의 단백질의 항균 (1 μg의)의 활성은 배양 온도 범위하에 RBB 표지 열 살해 고초균 PBS에 대해 평가 하였다. 활성 단위 (AU) (A), RBB-B의 흡광도로 표시가수 분해를 마이크로 플레이트 분광 광도계를 사용하여 595 nm에서 측정 한 후 운드, 제품 상등액으로 방출. 각 온도 조건에서 첨가없이 효소 반응은 다양한 온도에서 항온 처리에 기인하는 방출 염료의 효과를 빼는 데 사용되었다. 각각의 배양 온도에 대응하는 반응 상층 액은 흡광도 측정 (B) 이전에 몇 군데 있었다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53819/53819fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig4.jpg" /> 도 4 :. 단백질 활동 범위는 항균 미지의 단백질을 미생물의 활동 범위는 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 및 1000 ng의 하룻밤 배양 후 활성 단위로 측정했다 상기 BCA에 의해 측정 PROTEIN 분석 (A). 이러한 반응을위한 상기 RBB 표지 B. 서브 틸리 기판 레벨은 효소 (1000 NG)의 최대 양, 반응이 완전히 반응 잠복기 내의 모든 가능한 기판을 가수 분해하지 않도록 595 nm에서 5.0의 광학 밀도를 제공하기 위해 증가되었다. 첨가의 효소 반응을 제어 단독 배양로 인한 해제 염료의 효과를 빼는 데 사용되었다. 각 효소의 양에 대응하는 반응 상층 액은 흡광도 측정 (B) 이전에 몇 군데 있었다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53819/53819fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53819/53819fig5.jpg" /> 그림 5 :. α-키모 트립신에 대한 α-키모 트립신 활동 범위에 대한 활동 범위는 액티브로 측정 하였다밤새 배양 한 후 성만 단위 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 및 효소 (A)의 천 NG. 이러한 반응을위한 상기 RBB 표지 B. 서브 틸리 기판 레벨은 효소 (1000 NG)의 최대 양, 반응이 완전히 반응 잠복기 내의 모든 가능한 기판을 가수 분해하지 않도록 595 nm에서 5.0의 광학 밀도를 제공하기 위해 증가되었다. 첨가의 효소 반응을 제어 단독 배양로 인한 해제 염료의 효과를 빼는 데 사용되었다. 각 효소의 양에 대응하는 반응 상층 액은 흡광도 측정 (B) 이전에 몇 군데 있었다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53819/53819fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.4K 조회수.  The MITRE Corporation. Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

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An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

액체 크로마토그래피 이온 이동성 QTOF 질량 분석에 의해 단백질 바이오에 주인 세포 단백질의 정량화에 대 한 HS MRM 분석 결과

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

연구

화학

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in solution, has shown considerable potential in biochemical sensing applications with unprecedented sensitivity and specificity1-5. The drug-target interactions generate surface stress, causing the cantilever to bend, and the signal can be analyzed optically when it is illuminated by a laser. The change in surface stress measured with nano-scale precision allows disruptions of the biomechanics of model bacterial cell wall targets to be tracked in real time. Despite offering considerable advantages, multiple cantilever sensor arrays have never been applied in quantifying drug-target binding interactions.
Here, we report on the use of silicon multiple cantilever arrays coated with alkanethiol self-assembled monolayers mimicking bacterial cell wall matrix to quantitatively study antibiotic binding interactions. To understand the impact of vancomycin on the mechanics of bacterial cell wall structures1,6,7.&#160;We developed a new model1 which proposes that cantilever bending can be described by two independent factors; i) namely a chemical factor, which is given by a classical Langmuir adsorption isotherm, from which we calculate the thermodynamic equilibrium dissociation constant (Kd) and ii) a geometrical factor, essentially a measure of how bacterial peptide receptors are distributed on the cantilever surface. The surface distribution of peptide receptors (p) is used to investigate the dependence of geometry and ligand loading. It is shown that a threshold value of p ~10% is critical to sensing applications. Below which there is no detectable bending signal while above this value, the bending signal increases almost linearly,&#160;revealing that stress is a product of a local chemical binding factor and a geometrical factor combined by the mechanical connectivity of reacted regions and provides a new paradigm for design of powerful agents to combat superbug infections.

Acquired resistance to antibiotics is a major public healthcare problem and is presently ranked by the WHO as one of the greatest threats to human life. Here we describe the use of cantilever technology to quantify antibacterial resistance, critical to the discovery of novel and powerful agents against multidrug resistant bacteria.

약물 타겟 상호 작용 및 항균 저항 검출 Nanomechanics

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

면역학 및 감염병학

Isolation and Identification of Waterborne Antibiotic-Resistant Bacteria and Molecular Characterization of their Antibiotic Resistance Genes

The development and spread of antibiotic resistance (AR) through microbiota associated with freshwater bodies is a major global health concern. In the present study, freshwater samples were collected and analyzed with respect to the total bacterial diversity and AR genes (ARGs) using both conventional culture-based techniques and a high-throughput culture-independent metagenomic approach. This paper presents a systematic protocol for the enumeration of the total and antibiotic-resistant culturable bacteria from freshwater samples and the determination of phenotypic and genotypic resistance in the culturable isolates. Further, we report the use of whole metagenomic analysis of the total metagenomic DNA extracted from the freshwater sample for the identification of the overall bacterial diversity, including non-culturable bacteria, and the identification of the total pool of different ARGs (resistome) in the water body. Following these detailed protocols, we observed a high antibiotic-resistant bacteria load in the range of 9.6 &#215; 105-1.2 &#215; 109 CFU/mL. Most isolates were resistant to the multiple tested antibiotics, including cefotaxime, ampicillin, levofloxacin, chloramphenicol, ceftriaxone, gentamicin, neomycin, trimethoprim, and ciprofloxacin, with multiple antibiotic resistance (MAR) indexes of &#8805;0.2, indicating high levels of resistance in the isolates. The 16S rRNA sequencing identified potential human pathogens, such as Klebsiella pneumoniae,&#160;and opportunistic bacteria, such as Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp., and Aeromonas spp. The molecular characterization of the isolates showed the presence of various ARGs, such as blaTEM, blaCTX-M (&#946;-lactams), aadA, aac (6&#39;)-Ib (aminoglycosides), and dfr1 (trimethoprims), which was also confirmed by the whole metagenomic DNA analysis. A high prevalence of other ARGs encoding for antibiotic efflux pumps-mtrA, macB, mdtA, acrD, &#946;-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, the&#160;chloramphenicol acetyltransferase gene catB10, and&#160;the rifampicin resistance gene rphB-was also detected in the metagenomic DNA. With the help of the protocols discussed in this study, we confirmed the presence of waterborne MAR bacteria with diverse AR phenotypic and genotypic traits. Thus, whole metagenomic DNA analysis can be used as a complementary technique to conventional culture-based techniques to determine the overall AR status of a water body.

Here, we present a detailed protocol for the isolation and identification of antibiotic-resistant bacteria from water and the molecular characterization of their antibiotic resistance genes (ARGs). The use of culture-based and non-culture-based (metagenomic analysis) techniques provides complete information about the total bacterial diversity and the total pool of different ARGs present in freshwaters from Mumbai, India.

수인성 항생제 내성 박테리아의 분리 및 동정과 항생제 내성 유전자의 분자 특성 분석

The development and spread of antibiotic resistance (AR) through microbiota associated with freshwater bodies is a major global health concern. In the ...

환경과학

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

소프트 한천 오버레이 기법의 사용은 세균 생산 억제 화합물에 대한 화면으로

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

항 원 특정 항 체 응답 다음 Clostridium 남과 어울리지 않 는 감염의 혈 청 학적인 결정에 대 한 단백질 Microarray 분석 결과

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

잉크젯 프린터 기반으로 테스트 자동화 된 바둑판 배열 및 수동 시간 죽 일 방법 항균 시너지

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

<meta charset="utf8"></head><body>Dual Reporters를 사용한 Mycobacterium abscessus 에 대한 High-Throughput Screening Assay

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: M. abscessus 치료법의 효율적인 발견을 위한 확장 가능한 약물 스크리닝 프로토콜

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

요약

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액체 크로마토그래피 이온 이동성 QTOF 질량 분석에 의해 단백질 바이오에 주인 세포 단백질의 정량화에 대 한 HS MRM 분석 결과

약물 타겟 상호 작용 및 항균 저항 검출 Nanomechanics

수인성 항생제 내성 박테리아의 분리 및 동정과 항생제 내성 유전자의 분자 특성 분석

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

소프트 한천 오버레이 기법의 사용은 세균 생산 억제 화합물에 대한 화면으로

항 원 특정 항 체 응답 다음 Clostridium 남과 어울리지 않 는 감염의 혈 청 학적인 결정에 대 한 단백질 Microarray 분석 결과

잉크젯 프린터 기반으로 테스트 자동화 된 바둑판 배열 및 수동 시간 죽 일 방법 항균 시너지

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발