이 방법은 뇌진탕의 분자 효과의 세로 특성을 허용하는 뇌진탕의 신뢰할 수 있고 번역 모델을 연구원에게 제공함으로써 미래 연구를위한 패러다임을 만듭니다. 이 쥐 모델은 미세 투석을 결합하여 인간의 두개골 외상의 필수 특징을 모방한 머리와 몸통의 빠른 가속과 감속을 발휘하는 웨지 랩 기술과 연속적인 해석 정량화를 허용합니다. 이 기술의 의미는 생체 내 및 중단없이 약리학 제의 메커니즘과 효능을 연구 할 수있는 귀중한 기회를 제공하기 때문에 뇌진탕의 치료 적 연구로 확장됩니다.
실험 중 조작 오류를 제한하고 효율성을 극대화하기 위해 이 방법의 뇌진탕 및 가짜 유도 단계에서 2인 팀에서 작업하는 것이 좋습니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 기술자 클로이 프로보스트가 될 것입니다. 절차를 시작하려면 전기 클리퍼를 사용하여 동물의 머리를 면도합니다.
2%이소프로필 알코올과 2%클로르헤시딘 글루코네이트의 용액을 사용하여 면도 부위를 세 번 청소하십시오. 그런 다음 윤활 눈 연고를 적용하여 마취 시 건조를 방지합니다. 다음으로, 쥐를 스테레오탁스 장치에 놓는다.
이어바를 외이도에 삽입하여 주의하고 코 클램프를 조입니다. 그 후, 스테인레스 스틸 가이드 캐뉼라를 스테레오탁스 장치의 홀더 암에 고정합니다. 두피에 3센티미터의 중간 절개를 합니다.
절개 주위에 4개의 클램프를 설치하여 두개골을 깨끗하게 둡니다. 두개골에서 수술용 블레이드로 골망을 단단히 긁어 내고, 브레그와 람다 봉합사가 보일 때까지. 출혈이 있는 경우 거즈 패드 또는 면 팁 어플리케이터로 두개골에 단단한 압력을 유지하십시오.
두개골이 브레그마와 람다 봉합사의 등소벤트랄 좌표를 비교하여 스테레오탁스 장치에 올바르게 정렬되었는지 확인합니다. 가이드 캐뉼라의 좌표에 대한 기준점으로 bregma 봉합사의 전방, 평범성 및 도르소벤트강 좌표를 식별합니다. 그런 다음 bregma 봉합좌를 참조로 복용하여 해마에서 가이드 캐뉼라 이식 부위의 좌표를 계산합니다.
마커를 사용하여 정확한 이식 부위를 표시합니다. 이어서 가이드 캐뉼라의 대상 부위에 있는 두개골을 통해 직경 0.5밀리미터의 구멍을 뚫는다. 아크릴 치과 시멘트가 적용 된 후 캐뉼라를 고화시키는 두개골에 3 개의 앵커 나사를 스레드하기 위해이 지점 주위에 약 5 밀리미터 주위에 3 개의 다른 구멍을 드릴.
다음으로, 해마에 캐뉼라를 삽입하고 치과 시멘트로 고정하십시오. 체중이 떨어질 사이트 주위에 과도한 치과 시멘트를 흘리지 않도록주의하십시오. 시멘트를 2분 동안 건조하게 한 다음 캐뉼라에서 홀더 암을 제거합니다.
뇌척수액 의 침투 및 감염의 위험을 피하기 위해 캐뉼라에 스테인레스 스틸 이동식 obturator를 삽입합니다. 그 후, 네 개의 클램프를 제거하고, 철회된 피부를 다시 당기고 외과 봉합사 실로 바느질합니다. 다음으로, 장치에서 쥐를 제거하고 통증을 치료하기 위해 피하부프노르핀을 주입하십시오.
설치류를 케이지에 다시 놓고, 설치류는 의식이 될 때까지 난방 패드를 가지고 있습니다. 그런 다음 면밀한 모니터링하에 7 일간의 복구 기간 동안 동물 보호 시설로 반환하십시오. 이 절차에서는 캐뉼라에서 외고를 제거하고 미세 투석 프로브를 천천히 삽입하십시오.
다음으로, 프로브 어셈블리를 액체 회전에 묶은 스테인레스 스틸 스프링에 고정하고 링 스탠드와 클램프로 레버 암의 균형을 맞추어 동물이 케이지 내에서 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다. 테더드랫은 전체 미세 투석 절차 동안 음식과 물에 대한 광고 리비도 액세스 할 수 있습니다. 마이크로인퓨전 펌프를 사용하여 프로브에 퍼퓨전을 전달하고 융합된 실리카 콘센트 라인에서 투석을 수집합니다.
절차가 시작되기 최소 1시간 30분 전에 프로브를 분당 1마이크로리터로 작동 유량으로 설정합니다. 피펫으로 시간이 지남에 따라 볼륨을 측정하여 프로브의 유량이 일관성이 있는지 확인합니다. 그 후, 각 투석 시료를 리터당 0.25 두더지 1마이크로리터로 미리 로드하여 각 투석 시료를 수집하여 분해분해를 방지합니다.
후속 분석을 위해 샘플을 섭씨 4도에 저장합니다. 마지막 샘플이 수집되면 캐뉼라에서 미세 투석 프로브를 제거하고 쥐를 동물 관리 시설로 되돌리기 전에 obturator를 다시 삽입하십시오. 뇌진탕 장치를 설치하려면 폼 쿠션이 들어있는 U자 형 플렉시 유리 프레임에 알루미늄 시트를 단단히 테이프로 고정하십시오.
날카로운 면도날을 사용하여 알루미늄 시트에 슬릿을 만듭니다. 슬롯 알루미늄 시트를 테이프. 그런 다음 PVC 가이드 튜브 아래에 플렉시 글래스 프레임을 배치합니다.
PVC 가이드 튜브를 슬롯 알루미늄 위 3-1/2센티미터에 클램프 스탠드로 고정하십시오. 금속 루프를 통해 나일론 플라이 낚시 라인을 부착하여 무게의 바닥이 슬롯 알루미늄에 2-1/2 센티미터 떨어져 있어 쥐가 거품 쿠션에 떨어질 때 여러 개의 안타를 방지합니다. 그런 다음 나일론 플라이 낚시 라인을 클램프 스탠드에 부착합니다.
나일론 플라이 낚시 라인으로 PVC 튜브를 통해 무게를 당깁니다. 슬롯 알루미늄 호일 위의 1미터에 예비 드릴 구멍을 통해 육사 키를 삽입하여 제자리에 보관하십시오. 뇌진탕을 유도하기 위해, 머리가 황동 무게의 경로에 직접 위치되도록 슬롯 알루미늄 시트에 그 동물을 가슴에 배치합니다.
코 콘을 제거하고 육소 키를 당깁니다. 무게는 PVC 튜브를 통해 수직으로 떨어지고 쥐의 머리에 영향을 미칩니다. 그 결과, 쥐는 빠른 180도 회전을 겪고 뒷면에 착륙합니다.
폼 쿠션에서 쥐를 제거하고 케이지에 뒷면에 놓습니다. 디지털 타이머를 사용하여 올바른 반사 시간을 회복 및 부상 심각도의 표시로 측정합니다. 오른쪽 반사 시간은 쥐가 깨어나서 자발적으로 경향이있는 위치로 돌아가거나 걷기 시작할 때까지 충격에서 총 시간입니다.
사망, 골절 또는 출혈의 징후를 기록하십시오. 가짜 유도의 경우, 머리가 황동 무게의 경로에 직접 놓이 있도록 슬롯 알루미늄 시트에 그 동물을 가슴에 놓습니다. 코 콘을 제거한 다음 육소 키를 당기지 않고 알루미늄 시트에서 동물을 제거합니다.
그 후, 쥐를 케이지에 등에 놓습니다. 디지털 타이머를 사용하여 신경 학적 복원의 지표로 적절한 시간을 측정하십시오. 부상당한 그룹의 동물들은 평균적으로 수치심과 큰 시간을 크게 증가시켰으며 의식을 되찾자 기절한 것으로 나타났습니다.
뇌진탕 그룹에서 10 의 경우 중, 단지 하나의 동물은 체중 저하 다음 충격 부위에서 출혈의 사소한 징후를 보였다. 세포외 글루타민염 농도의 현저한 증가는 가짜 부상에 비해 외상 유도 후 처음 10 분 동안 해마 CA1 지역에서 관찰되었다. 뇌진탕 유도 동안 기억하십시오이 뇌진탕보다 훨씬 더 심각한 쥐의 핵심에 부상을 생성 할 것이기 때문에 무게와 캐뉼라에 영향을 피할 수 있습니다.
이 방법은 반복뇌진탕의 연구에 적용될 수 있는데, 절차는 서로 다른 시점에서 동일한 동물에서 반복될 수 있는 가까운 머리 부상이기 때문이다.
