Diese Methode schafft ein Paradigma für zukünftige Studien, indem sie Forschern ein zuverlässiges und translationales Modell der Gehirnerschütterung zur Verfügung stellt, das eine Längscharakterisierung der molekularen Wirkungen einer Gehirnerschütterung ermöglicht. Dieses Rattenmodell kombiniert mikrodialyse ermöglicht eine kontinuierliche Analytquantifizierung mit einer Keilwickeltechnik, die eine schnelle Beschleunigung und Verzögerung von Kopf und Oberkörper ausübt, die ein wesentliches Merkmal des menschlichen Schädel-Hirn-Traumas imitiert. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf therapeutische Studien der Gehirnerschütterung, da sie eine wertvolle Gelegenheit bietet, den Mechanismus und die Wirksamkeit von pharmakologischen Wirkstoffen in vivo und ununterbrochen zu untersuchen.
Es wird dringend empfohlen, in Zweierteams während der Gehirnerschütterungs- und Scheininduktionsschritte dieser Methode zu arbeiten, um Manipulationsfehler zu beschränken und die Effizienz während des Experiments zu maximieren. Demonstriert wird das Verfahren von Chloe Provost, einer Technikerin in unserem Labor. Um den Eingriff zu beginnen, rasieren Sie den Kopf des Tieres mit einem elektrischen Knipser.
Reinigen Sie den rasierten Bereich mit einer Lösung von 2%Isopropylalkohol und 2%chlorhexidin gluconnate dreimal. Dann Schmieraugensalbe auftragen, um Trockenheit während der Anästhesie zu verhindern. Als nächstes legen Sie die Ratte in ein stereotaxic Gerät.
Legen Sie die Ohrstangen mit großer Sorgfalt in die Gehörgänge ein und ziehen Sie die Nasenklammer fest. Befestigen Sie anschließend eine 26 Gauge Edelstahl-Führungskanüle am Halterarm am stereotaxic-Gerät. Machen Sie einen Mittellinienschnitt von drei Zentimetern auf der Kopfhaut.
Lassen Sie den Schädel frei, indem Sie vier Klammern um den Schnitt installieren. Das Periost mit der chirurgischen Klinge fest vom Schädel kratzen, bis die Bregma- und Lambda-Nähte sichtbar sind. Wenn es Blutungen gibt, halten Sie festen Druck auf den Schädel mit einem Gazepad oder Baumwolle gekippt Applikator.
Bestätigen Sie, ob der Schädel korrekt auf dem stereotaxic-Gerät ausgerichtet ist, indem Sie die dorsoventralen Koordinaten der Bregma- und Lambda-Nähte vergleichen. Identifizieren Sie die anteroposterior, mediolateralen und dorsoventralen Koordinaten der Bregma-Naht als Bezugspunkte für die Koordinaten der Führungskanüle. Dann unter Derobgin-Nähtealskoordinaten als Referenzen, berechnen Sie die Koordinaten der Guide Cannula Implantationsstelle im Hippocampus.
Markieren Sie die genaue Implantationsstelle mit einem Marker. Anschließend bohren Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern durch den Schädel an der Zielstelle der Führungskanüle. Bohren Sie drei weitere Löcher etwa fünf Millimeter um diesen Punkt, um drei Ankerschrauben in den Schädel einzufädeln, die die Kanüle verfestigen, nachdem Acryl-Zahnzement aufgetragen wurde.
Als nächstes legen Sie die Kanüle in den Hippocampus ein und fixieren Sie sie mit Zahnzement. Achten Sie darauf, überschüssigen Zahnzement nicht um die Stelle zu verschütten, wo das Gewicht fallen gelassen wird. Lassen Sie den Zement für zwei Minuten trocknen und entfernen Sie dann den Halterarm aus der Kanüle.
Setzen Sie einen abnehmbaren Obturator aus Roststahl in die Kanüle ein, um das Versickern von Zerebrospinalflüssigkeit und Infektionsrisiken zu vermeiden. Danach entfernen Sie die vier Klemmen, ziehen Sie die zurückgezogene Haut zurück und nähen Sie sie mit einem chirurgischen Nahtfaden. Als nächstes entfernen Sie die Ratte aus dem Gerät und injizieren Buprenorphin subkutan, um Schmerzen zu behandeln.
Legen Sie das Nagetier wieder in seinen Käfig mit einem Heizkissen darunter, bis es bewusst wird. Dann bringen Sie es für eine Erholungszeit von sieben Tagen unter genauer Beobachtung an die Tierpflegeeinrichtung zurück. Entfernen Sie bei diesem Verfahren den Obturator aus der Kanüle und legen Sie langsam eine Mikrodialysesonde ein.
Als nächstes befestigen Sie die Sondenbauanbaugruppe an einer Edelstahlfeder, die an einen Flüssigkeitsschwenk- und Gegenhebelarm mit einem Ringständer und Klemmen gebunden ist, damit sich das Tier in seinem Käfig frei bewegen kann. Die gefesselten Ratten haben während des gesamten Mikrodialyseverfahrens ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser. Verwenden Sie eine Mikroinfusionspumpe, um Perfusate an die Sonde zu liefern und das Dialysat aus der geschmolzenen Kieselsäure-Auslassleitung zu sammeln.
Mindestens eine Stunde und 30 Minuten vor Beginn des Eingriffs drehen Sie die Sonde mit einem Mikroliter pro Minute auf ihre Arbeitsdurchflussrate auf. Stellen Sie sicher, dass die Durchflussmenge der Sonde konsistent ist, indem Sie das Volumen im Zeitverlauf mit einer Pipette messen. Danach sammeln Sie jede Dialysatprobe in einer Bruchdurchstechflasche, die mit einem Mikroliter 0,25 Mol pro Liter Perchlorsäure vorbelastet ist, um den Analytabbau zu verhindern.
Bewahren Sie die Probe bei vier Grad Celsius für die nachfolgende Analyse auf. Nachdem die letzte Probe entnommen wurde, entfernen Sie die Mikrodialysesonde aus der Kanüle und setzen Sie den Obturator wieder ein, bevor Sie die Ratte in die Tierpflegeeinrichtung zurückbringen. Um die Gehirnerschütterung Gerät zu installieren, band ein Aluminiumblech fest auf einem U-förmigen Plexiglasrahmen, der ein Schaumkissen enthält.
Verwenden Sie eine scharfe Rasierklinge, um Schlitze in der Aluminiumfolie zu machen. Verkleben Sie das geschlitzte Aluminiumblech. Positionieren Sie dann den Plexiglasrahmen unter einem PVC-Führungsrohr.
Halten Sie das PVC-Führungsrohr mit einem Klemmständer in 3-1/2 Zentimetern über dem geschlitzten Aluminium fest. Befestigen Sie eine Nylonfliege Angelschnur durch die Metallschlaufe, so dass die Unterseite des Gewichts ist bei 2-1/2 Zentimeter über dem geschlitzten Aluminium, um mehrere Treffer zu verhindern, wenn die Ratte fällt auf das Schaumkissen nach dem Aufprall. Dann befestigen Sie die Nylonfliege Angelschnur am Klemmständer.
Ziehen Sie das Gewicht durch das PVC-Rohr mit der Nylon-Fliege Angelschnur. Halten Sie es an Ort und Stelle, indem Sie einen Sechskantschlüssel durch die vorläufigen Bohrungen in einem Meter über der geschlitzten Aluminiumfolie einsetzen. Um eine Gehirnerschütterung auszulösen, legen Sie das Tier auf die Brust auf das geschlitzte Aluminiumblech, so dass sein Kopf direkt im Weg des Messinggewichts positioniert ist.
Entfernen Sie den Nasenkegel und ziehen Sie den Sechskantschlüssel. Das Gewicht fällt vertikal durch das PVC-Rohr und trifft den Kopf der Ratte. Dadurch wird die Ratte eine schnelle 180-Grad-Rotation durchlaufen und auf dem Rücken landen.
Entfernen Sie die Ratte aus dem Schaumstoffkissen und legen Sie sie auf den Rücken in den Käfig. Verwenden Sie einen digitalen Timer, um die richtige Reflexzeit als Zeichen für Erholung und Verletzungsschwere zu messen. Die richtige Reflexzeit ist die gesamtzeitliche Zeit vom Aufprall bis die Ratte aufwacht und sich spontan wieder in die anfällige Position dreht oder zu gehen beginnt.
Beachten Sie alle Anzeichen von Tod, Fraktur oder Blutung. Für Schein-Induktion, legen Sie das Tier auf der Brust auf dem geschlitzten Aluminiumblech, so dass sein Kopf direkt in den Weg des Messinggewichts liegt. Entfernen Sie den Nasenkegel und entfernen Sie dann das Tier vom Aluminiumblech, ohne den Sechskantschlüssel zu ziehen.
Legen Sie die Ratte anschließend auf den Rücken in den Käfig. Verwenden Sie einen digitalen Timer, um die richtige Zeit als Indikator für die neurologische Wiederherstellung zu messen. Tiere aus der verletzten Gruppe hatten eine deutlich erhöhte Richtigeimzeit im Durchschnitt im Vergleich zu Scheinfällen und schienen fassungslos, als sie das Bewusstsein wiedererlangten.
Von den 10 Fällen aus der Gehirnerschütterungsgruppe zeigte nur ein Tier nach dem Gewichtsabfall geringfügige Anzeichen von Blutungen unter der Aufprallstelle. In den ersten 10 Minuten nach der Traumainduktion wurden in der Hippocampus-Region CA1 signifikante Anstiege der extrazellulären Glutamatkonzentrationen im Vergleich zu Scheinverletzungen beobachtet. Bitte denken Sie daran, während der Gehirnerschütterung Induktion vermeiden Auswirkungen auf die Kanüle mit dem Gewicht, da dies Verletzungen des Kerns der Ratte verursachen würde, die deutlich schwerer als eine Gehirnerschütterung sind.
Diese Methode kann auf die Untersuchung wiederholter Gehirnerschütterungen angewendet werden, da es sich bei dem Verfahren um eine enge Kopfverletzung handelt, die bei denselben Tieren zu unterschiedlichen Zeitpunkten wiederholt werden kann.
