리사바이러스는 동물원이 없는 병원균입니다. 대만 박쥐 인구에서 Lyssavirus의 존재를 평가하기 위해, 우리는 감시 프로그램을 시작했다. 그리고 2016년부터 2018년까지 4개의 리사바이러스를 성공적으로 확인했습니다.
이 프로토콜은 대만의 vi-al Lysavirus 감시에 대한 단계별 소개입니다. 우리는 vi-al Lyssavirus 감시에 관심이있는 연구에 유용 할 수 있기를 바랍니다. 올바른 탁통 기호를 연결하는 것이 중요합니다.
죽은 박쥐 또는 죽어가는 박쥐는 Lyssavirus 감시를위한 라이브 박쥐보다 더 적합합니다. 실험실이 위치한 국가의 바이오 안전 규정에 따라 적절한 생체 안전 수준 실험실에서 다음과 같은 절차를 수행합니다. 그리고 연구원이 현재 자격을 갖추고 적절한 개인 보호 장비를 착용하도록 하십시오.
약하거나 아픈 박쥐 또는 시체의 수집시, 박쥐 생태학자는 표본의 형태학적 특성에 의해 박쥐 종을 식별해야합니다. 수집 부위, 종, 임상 징후 및 각 박쥐 표본과 함께 기타 관련 데이터를 포함하여 실험실에 정보 시트를 제출하십시오. 괴사 검사를 시작하기 전에 모든 외부 오리피스를 검사하고 박쥐 외부 기능, 특히 종 분화를위한 머리, 귀 및 날개를 촬영합니다.
구강 면봉 샘플을 수집하려면 멸균 해부 보드에 복부 용재에 박쥐를 배치하고 핀셋으로 머리를 고정합니다. 메스를 사용하여 종아리 부위의 중간선을 따라 피부를 자르고, 피부를 측면으로 끌어당겨 종아리 부위의 중간선을 따라 두개골에 절개를 합니다. 핀셋으로 두개골을 열어 뇌 조직을 노출시키고 핀셋을 사용하여 뇌 조직을 연결된 신경 조직으로부터 부드럽게 분리합니다.
뇌의 단면을 자르고 뇌 의 줄기와 소뇌를 포함한 절단을 가볍게 유리 슬라이드로 뇌 조직의 절단 표면을 터치하여 얼룩 인상을 줍니다. 렌즈 조직의 슬라이드를 눌러 과도한 조직을 제거하고 30 분 동안 영하 20도 아세톤에서 얼룩 인상 슬라이드를 수정합니다. 그런 다음 포르말린에서 조직 병리학 검사를 위해 신선한 뇌 조직의 작은 조각을 수정합니다.
그리고 핵산 추출을 위해 나머지 조직을 emi-em 10에 배치한다. 다음으로, 바디의 중간선을 따라 항문에 매니폴드에서 피부를 절개하고, 핀셋을 사용하여 피부를 들어 올리고 분리하고 근육 조직을 밑줄로; 하악 뼈 근처에 있는 타액 땀샘의 수집을 허용합니다. 핀셋으로 흉골을 약간 들어 올리고 메스를 사용하여 흉골과 복부 벽을 중간선을 따라 자르고 클라비클을 자른다.
바늘을 사용하여 왼쪽과 오른쪽 갈비뼈케이지를 해부 보드에 고정하여 흉부 구멍을 엽니다. 그리고 총 군단과 사후 모템 변화의 정도를 기록합니다. 그런 다음 핀셋과 메스를 사용하여 계획된 다운스트림 분석에 적합한 내장 조직을 제거합니다.
고정의 끝에 직접 형광 항체 테스트를 수행하기 위해, 얼룩 인상 슬라이드를 건조하고 분석을 위해 적어도 두 개의 형광 접합 항광견 병 항체를 선택합니다. 0.45 마이크로미터 여과기를 통해 각 슬라이드에 하나의 항체를 필터링합니다. 그리고 습한 챔버에서 섭씨 37도에서 30 분 동안 슬라이드를 배양하십시오.
인큐베이션이 끝나면 여분의 컨쥬게이트를 빼내고 PBS로 슬라이드를 씻으십시오. 그런 다음 소량의 10%의 글리세롤을 사용하여 커버 슬립을 슬라이드에 장착하고 형광 현미경 으로 슬라이드를 이미지합니다. 형광 항체 검사 또는 RT-PCR 분석이 양성을 나타내는 경우, emi-en 10에서 10% 현탁액에서 뇌 표본을 균질화하고 퇴적조직은 원심분리에 의해 조직을 벼룩-리리를 날화한다.
슈퍼 낫엔의 마이크로리터 200개에 3회 10~6번째 마우스 신경모세포종 세포와 37°C에서 1시간 동안 에미앙 10밀리리터를 37°C와 이산화탄소 1%로 접종하였다. 그리고 뇌균질 세포 현탁액을 25센티미터 제곱 플라스크로 옮기고, 신선한 emi-en 10의 6밀리리터를 함유한다. 직경 6mm의 테플론 코팅 유리 슬라이드로 뇌 균질 세포 서스펜션의 1 밀리리터에서 3 ~4 일 동안 섭씨 37도 및 1 %의 이산화탄소로 슬라이드를 배치합니다.
100% 아세톤으로 고정한 후, 형광 항체 검사에 사용되는 것과 동일한 두 개의 형광으로 슬라이드를 염색한다. 그리고 형광 현미경 검사법에 의해 슬라이드를 시각화하여 내산성 플라스 마이크 포함의 수를 결정합니다. 표준 프로토콜에 따라 접종된 세포 배양을 트립시화 및 하위 배양한 후, 100%의 감염성에 도달할 때까지 입증된 바와 같이 감염된 세포의 수를 반복적으로 계산하여 3~4일 동안 세포 배양 배양에 감기 배양을 반환한다.
2014년 1월부터 2017년 5월까지 13종의 박쥐 시체가 332마리의 시체가 수집되었습니다. 2개의 양성 박쥐 케이스의 이 대표적인 분석에서, 뇌 인상은 상업적, 적합 sy 공주 항광견 항체 중 하나를 가진 형광 항체 시험을 사용하여 부정적인 시험, RT-PCR는 각각 2개의 다른 프라이머 세트를 채택하는 동안, 긍정적인 결과를 산출했습니다. Gen bank 데이터베이스에서 스래스팅 쿼리를 폭발시키는 데 얻어진 증폭기 서열의 주관은 시퀀스가 검출된 Lysaviruses의 ID를 지원하는 79% 미만의 ID를 가진 리사바이러스와 유사하다는 것을 밝혀냈습니다.
2개의 Lyssaviruses는 형광 항체 시험 및 순서에 의해 확인된 대로 그 후에 성공적으로 두 개의 두뇌에서 격리되었습니다. Lyssavirus 양성을 결정하기 위한 중요한 단계는 형광 항체 시험 및 RT-CPR 분석입니다. 프라이머 세트에서 두 개 이상의 항광견 항체를 사용하는 것이 좋습니다.
Lyssavirus 이외에 다른 동물원 -비-서적인 박쥐 병원체폐쇄 진단 방법을 사용 하 여 모니터링할 수 있습니다. 그런 다음 데이터를 사용하여 대중에게 박쥐와의 접촉을 피하는 것에 대해 알릴 수 있습니다. 우리가 박쥐 Lyssavirus를 연구할 수록, 우리는 그것의 진화와 공중 보건에 미치는 영향을 더 이해할 수 있을 것입니다.
