면역 조직 화학 및 진단 조직 병리학에 사용되는 조직은 10 %인산염 완충체 포르말린에서 일상적으로 고정됩니다. 포르말린에 고정된 뇌 조직에서 광견병 바이러스 항원 검출은 독특한 도전을 제시하며, IHC 검사는 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 민감하고 구체적인 방법인 것으로 밝혀졌다. 생검 또는 다른 검출 방법의 주요 장점은 항원조직 및 세포 형태학과 관련하여 검출될 수 있다는 것입니다.
IHC를 사용하면 뇌 및 비 뇌 조직에서 광견병 항원을 국소화하여 일상적인 Hematoxylin 및 Eosin 얼룩 섹션을 통해 얻을 수 없는 추가 정보를 제공합니다. 광견병 진단 테스트는 광견병 바이러스에 노출된 인간에서 노출 후 예방을 개시하는 데 중요합니다. IHC는 포르말린 고정 조직에 대한 가장 일반적으로 수행되는 에세이 중 하나입니다.
특정 항체를 사용하면, 각각의 병원체의 검출을 위해 사용될 수 있다. 이 절차를 시작하려면, 뇌 조직의 3 ~ 5 밀리미터 조각을 배치, 부검 후 수집, 에 10% 버퍼링 포르말린 용액에 24 받는 시간 72 시간. 대략적인 조직 중량, 조직 모형 및 포르말린의 부피를 기록합니다.
조직을 70%에 탄올에 배치하여 포식포닌 고정 후, 그리고 처리 전에 더 긴 조직 저장을 위해 배치합니다. 표본 고정에 따라, 뇌간, 소뇌, 또는 해마의 단면과 같은 중요한 뇌 영역을 포함하도록 조직을 해부한다. 각각 3~5밀리미터 의 두께로 자른다.
조직을 카세트 처리에 넣습니다. 파라핀 왁스 침투를 위한 조직 카세트를 처리합니다. 파라핀 블록에 포함시키고 마이크로톤에 적어 두었습니다.
먼저 텍스트 프로토콜의 그림 1에 설명된 대로 염색 접시를 설정합니다. 각 접시에 준비된 용액250밀리리터를 채웁니다. AEC 기판 스톡 솔루션을 준비하려면 유리 파이펫을 사용하여 N- N-Dimethylformamide의 5 밀리리터에 AEC의 20 밀리그램 정제를 용해하십시오.
프로테아제스 스톡 솔루션을 준비하려면 PBS의 200 밀리리터에 프로테아제 7 밀리그램을 녹입니다. 헹구는 버퍼를 준비하려면 PBS의 80~990밀리리터의 100밀리리터를 추가하고 잘 섞어 PBT-T의 균일한 용액을 형성합니다. 마이크로토메를 사용하여 5마이크로미터 파라핀 섹션을 만듭니다.
섭씨 38도의 수조에 있는 섹션을 적재하고 유리 슬라이드에 수집합니다. 슬라이드에 시약 방지 펜으로 레이블을 지정합니다. 슬라이드를 트레이에 놓고 오븐에서 섭씨 55~60도에서 1시간 동안 녹입니다.
그런 다음 오븐에서 슬라이드를 제거하고 즉시 5 분의 3 연속 자일렌 헹구를 사용하여 즉시 분리합니다. 그 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 에탄올 희석을 감소시켜 탈온화된 물에 순차적으로 침수하여 슬라이드의 섹션을 다시 수분화합니다. 프로테아제프로 슬라이드를 프로테아제프로 30분 간 치료한 다음 PBS-T에서 슬라이드를 10분 간 헹구고 과산화수산화수소를 10분 동안 3%로 처리합니다.
그 후 PBS-T로 슬라이드를 10분 동안 다시 세척합니다. 시작하려면 버퍼에서 슬라이드 를 하나씩 제거하고 한 번에 하나의 슬라이드만 처리하고 다른 슬라이드는 침수 상태로 유지되고 종이 타월을 사용하여 조직 섹션 주위에서 과도한 버퍼를 제거합니다. 슬라이드를 습도 챔버에 넣고 실온에서 일반 염소 세럼으로 15 분 동안 배양하십시오.
다음으로, 습도 챔버내의 슬라이드를 최적의 소정의 희석 1차 항광견 항체및 음수 대조항체로 60분 동안 실온에서 배양하여 그 사이에 세척없이 배양한다. 그 후, PBS-T로 슬라이드를 10분 간 세척하고 실온에서 생체화 항체를 15분 동안 습도 챔버에서 배양한다. PBS-T로 슬라이드를 10분 동안 다시 씻으십시오.
슬라이드와 습도 챔버를 실온에서 스트립 분할 및 HRB 복합체로 15분 동안 배양하고 PBS-T를 10분 동안 세척합니다. 그런 다음 실온에서 습도 챔버에서 AEC로 10 분 동안 배양하십시오. 슬라이드를 10분 동안 씻어내고 길의 헤마토시린으로 카운터스테인을 사용하여 2분 동안 탈온화된 물로 1-2를 희석시합니다.
그 후, 탈이온화된 물에 미끄럼틀을 헹구어 과도한 헤마톡시린을 헹구십시오. 스콧의 수돗물에서 슬라이드를 30초 간 헹구고 탈온화된 물로 10분간 씻어내십시오. 슬라이드를 한 번에 하나씩 제거하고 수용성 장착 매체로 장착합니다.
그런 다음 가벼운 현미경을 사용하여 슬라이드를 읽습니다. 이 연구에서는, 면역 세포 화학 시험은 포르말린 고정 조직을 위한 대체 진단 시험으로 광견병 바이러스 항원의 검출을 위해 입증됩니다. 다른 뇌 조직에서 양성 및 부정적인 대조 샘플의 대표적인 면역 세포 화학 염색 결과는 뇌간, 소뇌 및 purkinje 세포 및 해마를 포함하여 여기에 표시됩니다.
청색 반염색 배경에 대한 AEC 기판을 사용하여 색 개발을 나타내는 마젠타 적색 염색은 광견병 항원에 대한 항체의 반응성 때문입니다. 면역조직화학의 양성 결과는 조직 단면도에서 자젠타 적색 염색에 해당한다. 세포질 포함 및 다양한 크기의 세분화 된 포함의 염색은 RABV 감염에 대해 긍정적 인 샘플을 나타냅니다.
헤마톡슬린으로 인해 특정 적색 염색이나 파란색 배경만 관찰되지 않은 경우 시료는 부정적으로 간주됩니다. 양성 염색 이외에, 포함물의 분포는 조직 견본의 바이러스성 하중에 대응할 수 있는 견본에 있는 광견병 항원의 수준의 간접적인 정량화를 제공할 수 있었습니다. 분포 수준에 관계없이, 임의의 특정 염색은 RABV 항원 검출을 위한 양성으로 견본을 분류할 것입니다.
조직은 포르말린에 적절하게 고정되어야하며,이 과정에서 조직을 동결하지 마십시오. 광견병 항원은 IHC에 의해 검출되고, 그 때 분자 기술은 RNA 서열 정보에 근거를 둔 Lyssavirus 이체를 결정하기 위하여 파라핀 단면도에서 수행될 수 있다. 자일렌과 포르말린과 같은 시약은 연기 후드에서 처리해야합니다.
발암 물질이기 때문에 AEC를 취급하는 동안 주의해야 합니다.
