Лиссавирус является зоо-нет-тик патогенов. Чтобы оценить наличие лиссавируса в популяциях тайваньских летучих мышей, мы инициировали программу эпиднадзора. С 2016 по 2018 год она успешно выявила четыре лиссавируса.
Этот протокол является пошаговое введение в vi-al Lyssavirus эпиднадзора на Тайване. Мы надеемся, что это будет полезно для исследователей, которые заинтересованы в vi-al Lyssavirus эпиднадзора. Важно подключить правильный символ так-кега.
Мертвая или умирающая летучая мышь больше подходит, чем живая летучая мышь для наблюдения за лиссавирусом. В зависимости от правил биобезопасности страны, где находится лаборатория; выполняем следующие процедуры в подходящей лаборатории уровня биобезопасности. И убедитесь, что исследователи в настоящее время квалифицированы и носить надлежащее личное защитное оборудование.
После сбора слабых или больных летучих мышей или туш, есть летучая мышь эколог определить вид летучих мышей по морфологическим характеристикам образца. Отправьте в лабораторию информационный бюллетень, включающий место сбора, виды, клинические признаки и другие соответствующие данные с каждым образцом летучей мыши. Перед началом некроскопии, изучить все внешние отверстия и сфотографировать летучих мышей внешних особенностей, особенно головы, ушей и крыльев для дифференциации видов.
Для сбора устного образца тампона поместите летучую мышь в брюшной лежачий на стерильную доску для вскрытия и зафиксировать голову пинцетом. Используйте скальпель, чтобы сократить кожу вдоль средней линии области теленка; и потяните кожу к боковым бокам, чтобы сделать разрез в черепе вдоль средней линии области теленка. Откройте череп пинцетом, чтобы разоблачить ткани мозга и использовать пинцет, чтобы мягко отделить ткани мозга от подключенной нервной ткани.
Вырезать поперечное сечение мозга, в том числе ствола мозга и мозжечка, и слегка коснуться разреза поверхности ткани мозга со стеклянными слайдами, чтобы сделать мазок впечатления. Нажмите слайд на ткани объектива, чтобы удалить избыток ткани и исправить мазок впечатление слайды в минус 20 градусов по Цельсию ацетон в течение 30 минут. Затем исправить небольшой кусочек свежей ткани мозга, в формалин, для гистопатологического обследования.
И поместите остальную часть ткани в emi-em 10 для извлечения нуклеиновой кислоты. Далее, наклонять кожу от многообразия к анусу вдоль средней линии тела, и использовать пинцет, чтобы поднять и отделить кожу и подчеркнуть мышечные ткани; чтобы позволить сбор слюнных желез, расположенных рядом с миндибулярной кости. Слегка подняв грудину пинцетом, используйте скальпель, чтобы разрезать грудину и брюшную стенку вдоль средней линии и вырезать ключицы.
Используйте иглы, чтобы исправить левые и правые грудные клетки на доске для вскрытия, чтобы открыть грудную полость. И записывают грубые легионы и степень посмертного изменения. Затем используйте пинцет и скальпель, чтобы удалить висцеральные ткани, как это уместно для запланированного анализа вниз по течению.
Для выполнения прямого теста флуоресцентных антител в конце фиксации, высушить мазок впечатление слайды и выбрать по крайней мере два флуоресценции конъюгированных антител против бешенства для анализа. Фильтр одного антитела на каждом слайде через 0,45 микрометра ситечко. И инкубировать горки в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию во влажной камере.
В конце инкубации слейте излишки спряжения и вымойте горки с помощью PBS. Затем используйте небольшой объем 10%глицерол для установки крышки скользит на слайды и изображение слайдов с помощью микроскопии флуоресценции. Когда либо флуоресцентные антитела тест или анализ RT-PCR указывает на положительность, гомогенизировать образец мозга в 10%подвески в emi-en 10 и осадок тканей fleu-rry центрифугации.
Привить 200 микролитров супер-нат-эн с 3 раза от 10 до 6-й мыши нейробластомы клеток и один миллилитр эми-ан 10 в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию и 1%углекислого газа. И перенести подвеску однородных клеток мозга на 25-сантиметровую колбу в квадрате, содержащую шесть миллилитров свежего эми-ан 10. На один миллилитр мозга однородно-клеточной подвески в четыре хорошо тефлон покрытием стеклянной горки, с диаметром шесть миллиметров и место слайд на 37 градусов по Цельсию и 1%углекислого газа в течение трех-четырех дней.
После фиксации 100%ацетоном, пятно слайды с теми же двумя флуоресценции конъюгированных антител против бешенства, как используется для теста на флуоресценцию антител. И визуализировать слайды с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы определить количество intracida-plas-mic включений. После трипсинизации и суб-культивирования привитой клеточной культуры в соответствии со стандартными протоколами, верните холодную культуру в инкубатор клеточной культуры еще на три-четыре дня с повторным подсчетом количества инфицированных клеток, как это было продемонстрировано до тех пор, пока не будет достигнута 100%-ная инфекционность.
С января 2014 года по май 2017 года для наблюдения было собрано 332 туши летучих мышей 13 видов. В этом репрезентативном анализе двух положительных случаев летучих мышей, впечатление мозга испытания отрицательных с помощью флуоресцентных антител тест с одним из коммерческих, подходят си спряженных антител против бешенства, в то время как RT-PCR с использованием каждого из двух различных наборов грунтовки, дали положительные результаты. Тема полученной последовательности ампли-кон к взрыву запроса в базе данных Ген банка показала, что последовательность была похожа на лиссавирусы с идентичностями менее 79%, поддерживающими личности обнаруженных лиссавирусов.
Два лиссавируса были впоследствии успешно изолированы от двух мозгов, что подтверждается тестом на флуоресценцию антител и секвенированием. Ключевым шагом для определения положительности лиссавируса являются тест на флуоресценцию антител и анализ RT-CPR. Использование двух или более антител против бешенства в грунтовки наборы настоятельно рекомендуется.
В дополнение к Lyssavirus другие зоо-не-ical летучих мышей патогенов можно контролировать с помощью закрытых диагностических методов. Эти данные могут быть использованы для информирования общественности об избежании контакта с летучими мышами. Чем больше мы сможем изучать лиссавирус летучих мышей, тем больше мы сможем понять его эволюцию и влияние на общественное здравоохранение.
