이 프로토콜은 수화 및 건조 된 형태로 세포 외 소포의 AFM 이미징, 정전기 고정, 표면 스캐닝, vesical 식별 및 데이터 분석 및 해석에 대한 간단한 준비를 간략하게 설명합니다. 이 기술의 주요 장점은 피부 표면에 소포의 편리한 정전기 고정및 고정으로 인한 모양 왜곡을 설명하기 위한 포스트 이미징 분석입니다. 획득한 소포 크기 조정 결과는 비용이 많이 들고 도전적인 기술로 남아있는 골드 스탠다드 CryoTEM 이미징과 일치합니다.
새로운 AFM 사용자인 경우 수화 샘플을 진행하기 전에 건조 시료의 특성화로 시작합니다. 수화 샘플 획득에 영향을 미칠 수 있는 수많은 추가 요인이 있기 때문입니다. 시작하려면, 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 생체 유체로부터 세포외 소포를 분리한다.
다음으로, 마그네틱 스테인리스 시편 디스크에 마우스 디스크를 단단히 부착합니다. 날카로운 면도기를 사용하여 새로운 재료 층을 노출하여 운모 디스크를 크리브하십시오. 실온에서 10밀리알라 니켈 II 염화물 용액의 100 마이크로 리터로 10초 동안 운하의 상단 표면을 처리합니다.
이렇게 하면 표면의 전하가 음수에서 양수로 수정됩니다. 니켈 II 염화물 용액을 보풀 프리 와이프 또는 블로팅 페이퍼로 블롯합니다. 그런 다음, 산화 된 물로 운하 표면을 세 번 씻고 건조 질소의 스트림으로 건조.
부착된 표면 수정 된 운하와 AFM 표본 디스크를 페트리 접시에 놓습니다. 다음으로, PBS로 엑소좀을 희석하여 용액의 밀리리터당 4~40억 입자의 농도를 얻습니다. 나노 입자 추적 분석을 사용하여 희석된 입자 농도를 검증합니다.
파이펫에서 희석된 외민용의 100 마이크로리터를 비우어, 운하의 표면에 세실 낙하를 형성한다. 그런 다음 뚜껑을 페트리 접시에 놓고 파라펜 필름으로 밀봉하여 시료 증발을 줄입니다. 12 시간 동안 냉장고에 인큐베이션.
인큐베이션 후, 표면을 방해하지 않고 주의 깊게 샘플의 80 ~ 90 %를 흡인. 이 시점에서, 엑소솜은 정전기로 운모기판에 고정됩니다. 수화 된 샘플을 이미징 할 때 PBS로 표면을 세 번 헹구습니다.
헹구기 과정 전반에 걸쳐 샘플을 수화상태로 유지하십시오. PBS로 운하 표면을 세척한 후, 시료를 커버하기 위해 신선한 PBS의 액체 및 파이펫 40 마이크로리터의 80~90%를 제거합니다. 수화 된 샘플은 이미징을 위한 준비가 되어 있습니다.
건조 된 EV의 를 이미징 할 때, 탈이온 된 물로 기판을 세 번 헹구어 표면에서 소금을 제거합니다. 가능한 한 많은 액체를 흡입 한 후, 표면에 닿지 않고, 건조 질소의 스트림으로 나머지를 건조. 건조된 세포외 소포를 이미지화하려면 도청 및 비접촉 이미징 모드에서 공중에서 스캔하도록 설계된 캔틸레버를 선택하고 프로브 홀더에 장착합니다.
샘플을 AFM 단계에 배치합니다. 자기 스테인레스 스틸 시편 디스크는 무대의 샘플을 고정합니다. 프로브 홀더를 AFM에 넣습니다.
준비 와 스테이지가 열을 평형화할 시간을 허용합니다. 도청 모드를 사용하여 512 줄로 래스터된 5x5 미크론 영역을 하나의 hertz의 스캔 속도로 스캔합니다. 지형과 샘플의 표면 특성에 대한 무료 정보를 제공하면서 높이 및 위상 이미지를 모두 획득합니다.
검색 시간은 이미지 영역과 이미지를 형성하기 위해 선택한 줄의 수로 증가하지만 스캔 속도에 따라 감소합니다. 빠른 스캔 속도가 이미지 품질에 영향을 미칠 수 있기 때문에 래스터링 속도는 획득 시간과 이미지 품질 간의 균형을 유지해야 합니다. 수화 소포를 이미지화하려면 부드럽고 수화된 샘플을 스캔하는 데 적합한 캔틸레버를 선택하고 액체 스캔을 위해 설계된 프로브 홀더에 캔틸레버를 장착합니다.
스캔 하는 동안 액체에 기포를 도입의 가능성을 줄이기 위해 PBS와 캔틸레버의 끝을 적시. 그런 다음 샘플을 AFM 단계로 고정합니다. 샘플이 열적으로 평형되면 도청 모드에서 수화 된 운하 표면을 이미지합니다.
높이 와 위상 이미지를 모두 획득합니다. 촬영한 이미지를 분석하려면 먼저 데이터 프로세스의 SPM 모드 선택후 Tip'을 선택하고 모델 Tip'을 선택하여 샘플을 스캔하고 표면 재구성을 수행하여 팁 침식 아티팩트를 확인'을 클릭합니다. 이미지를 엽니다.
메뉴에서 데이터 프로세스를 선택한 다음 Tip'다음에 SPM 모드를 선택한 다음 Surface 재구성을 선택하고 확인'Next를 클릭하고, 데이터 프로세스를 선택하고, 레벨'을 선택하고, 평면 레벨을 선택하여 이미징 평면을 정렬하고 스캔 데이터에서 기판의 기울기를 제거하여 실험실 XY 평면과 일치합니다. 데이터 프로세스를 선택한 다음 올바른 데이터'를 선택한 다음 각 검색 선의 평균 높이를 찾아 데이터에서 빼는 알고리즘인 중앙값을 포함하여 행 정렬 옵션을 정렬하는 것을 선택하여 이미지의 행을 정렬합니다. 다음으로 데이터 프로세스로 이동하여 흉터 제거를 선택합니다'이 Scars'로 알려진 일반적인 스캔 오류를 제거'제로 높이에서 운하 표면을 정렬하려면 데이터 프로세스 메뉴로 이동하여 레벨 드롭 다운 메뉴에서 플랫텐 베이스를 선택합니다.
Grains'menu로 이동하여 임계값에 의해 표시를 사용하여 스캔 된 표면의 추가 셀룰러 소포를 식별'이 알고리즘은 사용자가 선택한 임계값 위의 높이에 의해 제로 표면 기판에서 튀어 나온 입자로 표면 고정 된 엑소좀을 식별합니다. 1~3나노미터 범위의 임계값을 선택합니다. 이렇게 하면 대부분의 백 그라운드 간섭이 제거됩니다.
마지막으로 Grains 메뉴에서 액세스할 수 있는 사용 가능한 배포 알고리즘을 사용하여 식별된 소포의 기하학적 특성과 치수 특성을 수행합니다. 다른 계산 도구 및 사용자 지정 컴퓨터 프로그램에 의해 전문 분석을 위해 Gwyddion에서 AFM 데이터를 내보냅니다. 니켈 염화물 표면 수정은 시간에 따라 달라 지는 여분의 세포 소포의 고정을 초래합니다.
고정 된 소포의 표면 농도는 24 시간 인큐베이션 후 지나치게 조밀한 반면 12 시간 잠복은 더 적은 엑소좀으로 이어지고 정확하게 분석하기 쉬운 데이터를 스캔합니다. 이 AFM 이미지는 수정된 운모 표면에 정전기적으로 고정된 수화 MCF7 엑소좀을 보여줍니다. 해당 AFM 상 이미지는 높이 영상의 입자가 멤브레인 소포에 대해 예상대로 부드러운 나노 입자임을 확인합니다.
동일한 선을 따라 세 가지 소포에 대한 높이 데이터가 여기에 표시됩니다. 이러한 프로파일은 변형된 운하의 양전하 표면에 엑소좀의 정전기 매력으로 인한 평평한 형상을 보여 준다. 형상 왜곡은 고정된 소포와 그 단면의 확대보기에서 명백합니다.
용액에서 엑소좀의 구형 크기를 추정하기 위해 표면 고정 및 구형 멤브레인 봉투에 의해 동봉된 볼륨과 일치할 수 있습니다. 용액에서 구형 소포의 크기 분포는 561개의 고정된 소포의 AFM 데이터로부터 결정되었다. CryoTEM 이미지의 소포 크기는 AFM 결과와 일치합니다.
hyrdrated 엑소좀을 이미징하기 전에 PBS로 표면을 철저히 헹구는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 인바운드 엑소좀이 제거되고 AFM 팁에 대한 첨부 파일이 방지됩니다. 건조된 외민을 이미징할 때는 DI 물을 사용하여 기판을 상승시십시오.
DI 세척은 기판이 건조함에 따라 표면에 소금 결정의 형성을 방지할 것입니다. 존재하는 경우, 소금 결정은 이미지 처리어려운 작업을 만들 것입니다.
