このプロトコルは、水和および乾燥した形態における細胞外小胞のAFMイメージング、静電固定化、表面スキャン、ベシカル同定、およびデータ分析および解釈のための簡単な準備を概説する。この技術の主な利点は、皮膚表面上の小胞の便利な静電気固定と、固定化によって生じる形状の歪みを考慮したポストイメージング解析です。得られた小胞のサイジング結果は、コストがかかり、挑戦的な技術のままゴールドスタンダードCryoTEMイメージングと一致しています。
AFM の新規ユーザーの場合は、まず乾燥サンプルの特性評価から始めてから、水和サンプルに進みます。水和サンプルの取得に影響を与える可能性のある追加の要因が数多く存在するため。まず、付随するテキストプロトコルに記載されているように、生体液から細胞外小胞を分離する。
次に、磁気ステンレス製の試料ディスクにマイカディスクをしっかりと取り付けます。材料の新しい層を公開するために鋭いカミソリを使用してマイカディスクを切断します。室温では、10ミリモルニッケルII塩化溶液の100マイクロリットルで10秒間、マイカの上面を処理します。
これにより、サーフェスの電荷が負から正に変化します。リントフリーワイプまたはブロッティングペーパーでニッケルII塩化液をブロットします。その後、水を脱イオン水でマイカ表面を3回洗い、乾燥窒素の流れで乾燥させます。
アタッチされた表面修正マイカとAFM標本ディスクをシャーレに入れます。次に、エキソソームをPBSで希釈し、溶液1ミリリットル当たり40億粒子から400億粒子の濃度を得る。ナノ粒子追跡解析を用いて、希釈粒子濃度を検証します。
ピペットから希釈したエキソソーム溶液の100マイクロリットルを空にすることによって、マイカの表面にセスシルドロップを形成します。その後、シャーレに蓋を置き、パラフェンフィルムで密封してサンプルの蒸発を減らします。冷蔵庫で12時間インキュベートします。
インキュベーション後、試料の80〜90%を表面を乱すことなく慎重に吸引する。この時点で、エキソソームは、マイカ基板上に静電固定化される。水和サンプルをイメージングする場合は、PBSで表面を3回リンスします。
リンスプロセス全体を通してサンプルを水分補給してください。PBSでマイカ表面を洗浄した後、液体の80〜90パーセントを取り除き、サンプルをカバーするために新鮮なPBSのピペット40マイクロリットルを除去する。水和サンプルは、イメージングの準備ができています。
脱熱したEVを撮像する際、脱イオン水で基板を3回リンスして表面から塩を取り除きます。できるだけ多くの液体を吸引した後、表面に触れることなく、残りを乾燥窒素の流れで乾燥させる。乾燥した細胞外小胞を画像化するには、タップおよび非接触イメージングモードで空気中をスキャンするように設計された片持ち体を選択し、プローブホルダーに取り付けます。
サンプルを AFM ステージに配置します。磁気ステンレス鋼の標本ディスクはステージ上のサンプルを固定する。プローブホルダーをAFMに入れる。
準備とステージが熱的に平衡化する時間を待ちます。タップモードを使用して、512 本のラインでラスター化された 5x5 ミクロンのエリアを、1 つのヘルツのスキャンレートでスキャンします。高さと位相の両方の画像を取得し、サンプルの地形と表面特性に関する無料の情報を提供します。
スキャン時間は、画像領域と画像を形成するために選択されたラインの数によって増加しますが、スキャン速度に応じて減少します。高速スキャン速度はイメージ品質に影響を与える可能性があるため、ラスタリングの速度は取得時間と画質のバランスをとる必要があります。水和小胞を画像化するには、柔らかい水和サンプルをスキャンするのに適した片持ち面を選択し、液体中のスキャン用に設計されたプローブホルダーに片持ち体を取り付けます。
PBSで片持ちレバーの先端を濡らし、スキャン中に液体に気泡を導入する可能性を減らします。次に、サンプルをAFMステージに固定化します。サンプルが熱的に平衡したら、水和したマイカ表面をタッピングモードで画像化します。
高さと位相の両方の画像を取得します。撮影した画像を分析するには、まずデータプロセスの選択 SPM モードに移動し、次に「ヒント」を選択し、サンプルのスキャンに使用するジオメトリとチップの寸法を選択し、OK をクリックして、サーフェスの再構築を実行してチップの腐食アーティファクトを修正します。画像を開きます。
メニューから[データ処理]を選択し、[SPMモード]を選択してから[チップ]を選択し、[OK]を選択して[次へ]をクリックし、[データプロセス]を選択して[レベル]を選択し、[平面レベル]を選択して、イメージング平面を整列させ、スキャンデータから基板の傾きを取り除いて実験室のXY平面に一致させます。[データプロセス]の[次に正しいデータ]を選択して画像内の行を整列し、[行を整列]を選択し、各スキャンラインの平均高さを検出してデータから減算するアルゴリズムである中央値を含む複数の整列オプションを使用できます。次に、データプロセスの後に[修正データ]に移動し、[傷跡を取り除く]を選択し、これは「スカーズ」と呼ばれる一般的なスキャンエラーを削除し、マイカサーフェスをゼロの高さに揃えるには、[データプロセス]メニューに移動し、[レベル]ドロップダウンメニューで[ベースを平坦化]を選択します。
「グレインズ」メニューに移動し、「閾値によるマーク」を使用して、スキャンした表面上の余分な細胞小胞を特定する'このアルゴリズムは、ユーザーが選択した閾値を超える高さによってゼロ表面基板から突き出た粒子として表面固定化エキソソームを識別します。1 ナノメートルから 3 ナノメートルまでの範囲でしきい値を選択します。これにより、バック グラウンド干渉の大部分が排除されます。
最後に、Grainsメニューからアクセス可能な分布アルゴリズムを使用して、同定された小胞の幾何学的および次元的特性を実行します。他の計算ツールやカスタムコンピュータプログラムによる特殊な分析のためにGwyddionからAFMデータをエクスポートします。塩化ニッケル表面改質は時間依存性の細胞外小胞の固定化をもたらす。
固定化された小胞の表面濃度は、24時間のインキュベーション後に過度に密度が高く、12時間のインキュベーションは正確に分析しやすいエキソソームおよびスキャンデータを少なくする。このAFM画像は、改変マイカ表面に静電に固定化された水分補給MCF7エキソソームを示す。対応するAFM位相画像は、高さ画像の粒子が膜小胞に期待されるように軟ナノ粒子であることを確認します。
同じ線に沿った 3 つの小胞の高さデータを次に示します。これらのプロファイルは、変性マイカの正電荷面へのエキソソームの静電引力によって引き起こされる平坦化形状を示す。形状の歪みは、固定化された小胞とその断面の拡大図で明らかである。
溶液中のエキソソームの球状サイズを推定するために、上で固定化された表面および球状膜エンベロープによって囲まれた体積を一致させることができる。溶液中の球状小胞のサイズ分布は、561固定化小胞のAFMデータから決定した。クライオテム画像の小胞サイズは、AFMの結果と一致しています。
ヒュルド化されたエキソソームをイメージングする前に、PBSで表面を十分に洗いすがることが重要です。これにより、インバウンドエキソソームが削除され、AFM チップへの添付ができなくなります。乾燥エキソソームを撮像する際には、必ず基板を上昇させるためにDI水を使用してください。
DI洗浄は、基材が乾燥するにつれて表面に塩結晶が形成されるのを防ぎます。もし存在すれば、塩結晶は画像処理を困難な作業にする。
