Name: studying ribonucleotide incorporation: strand-specific detection of ribonucleotides in the yeast genome and measuring ribonucleotide-induced mutagenesis
Uploaded: 2018-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis at Jo

우리는 그들의 작품에 대 한 모든 현재 및 이전 Kunkel 연구소 회원 감사 토론 프로토콜에 관련 된 하 고 여기에 제공 된 데이터를 다시. 이 작품은 국립 보건원 (NIH), 국립 환경 보건 과학 연구소 (NIEHS)의 교내 연구 부문에서에서 T.A.K.를 프로젝트 Z01 ES065070에 의해 지원 되었다.

1. 알칼리 가수분해 하 고 물가 관련 남쪽 오 점 (그림 1)
<ol><li>세포 성장 및 genomic DNA 분리<ol>
<li>효 모 제조업체의 지침에 따라 DNA 정제 키트를 사용 하 여 효 모 게놈 DNA를 격리 합니다. 사용 하 여 (0.5의 광학 밀도)과 1 사이 성장의 지 수 단계에 있는 문화. 35 ml 테 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 7.5, 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)) x 1의 최종 DNA 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>DNA에 5 mg/mL RNase A의 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
		<li>3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2)의 0.1 볼륨을 사용 하 여 DNA를 침전 물 및 얼음에 20 분에 대 한 100% 에탄올의 2.5 볼륨.</li>
		<li>4 ° c.에 20 분 16000 x g에서 원심 분리기 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다.</li>
		<li>펠 릿의 70% 에탄올 500 mL로 두 번 씻는 다. 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다.</li>
		<li>벤치에 펠 릿을 건조 하 고 테 버퍼 x 1의 35 ml에서 resuspend.</li>
		<li>Fluorimeter (테이블의 재료)를 사용 하 여 dsDNA BR 분석 결과 키트와 DNA quantitate</li>
		<li>3 M 나트륨 아세테이트, 100%의 pH 5.2와 2.5 볼륨의 0.1 볼륨을 사용 하 여 각 샘플에서 DNA의 5 mg을 침전 EtOH 200 mL의 총 볼륨 (DNA의 필요, 추가 5 mg 중립 젤 컨트롤이 필요한 경우 필요한 경우 추가 H2O). 20 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에 20 분 16000 x g에서 원심 분리기 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다.</li>
		<li>벤치에 펠 릿을 건조. H2o.의 14 ml에서 DNA resuspend</li>
	</ol></li>
	<li>알칼리 성가 수 분해와 젤 전기 이동 법<ol>
<li>1 M 코의 6 mL을 추가 하 고 2 h 55 ° C에서 품 어.</li>
		<li>5 분 동안 얼음에 샘플을 품 어.</li>
		<li>알칼리 성 DNA 로딩 버퍼 x 6의 4 개 mL를 추가: 300 mM 코, 6 m m EDTA, pH 8.0, 18 %polysucrose (테이블의 자료), 0.15 %bromocresol 녹색, 및 0.25% 자일 렌 cyanol FF.</li>
		<li>1 %agarose, 50 m NaOH, m 1 m m EDTA, pH 8.0 이루어진 알칼리 젤을 캐스팅. DNA 샘플의 24 mL 레인 당 로드 하도록 허용 하는 빗을 사용 합니다.</li>
		<li>알칼리 성 전기 이동 법 버퍼 x 1에 실 온에서 젤 실행: 50 m m NaOH, 1 m EDTA, pH 8.0 m. 적절 한 DNA 크기 마커를 포함 합니다.</li>
		<li>짧게 튜브 아래로 회전 시키십시오 고 알칼리 agarose 젤으로 전체 24 mL 샘플을 로드 합니다. 30 V, V 10에 18-20 h 뒤에 30 분 동안 electrophorese.</li>
		<li>2 외피의 부드러운 동요 HCl-중화 버퍼 i: 1 M Tris, 1.5 M NaCl와 실 온에서 각 45 분에 대 한 젤을 무력화.</li>
		<li>부드러운 진동으로 실 온에서 2 h SYBR 골드 얼룩의 1/10000 희석을 포함 하는 물 200 mL에 무력화 젤을 몸을 담글 하 여 DNA를 얼룩.</li>
		<li>UV transilluminator를 사용 하 여 DNA를 시각화 합니다. 알칼리 감도 증가 DNA5배달된 ribonucleotides의 높은 밀도 나타내는 작은 DNA 파편의 모양을 발생 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>남부 전송<ol>
<li>10모 세관 작용 의해 알칼리 젤에서 충전 된 나일론 막 DNA을 전송. 어떻게이 전송 설정할 수 있습니다 예 Sambrook와 러셀의 수동10에서 제공 됩니다.</li>
		<li>알칼리 성 전송 버퍼에 실 온에서 15 분 알칼리 젤을 담근 다: 0.4 M NaOH, 1 M NaCl.</li>
		<li>물, 나일론 막 (젤의 크기로 잘라)를 짧게 습식 및 다음 알칼리 전송 버퍼에 5 분 동안 담근 다.</li>
		<li>3 유리 비 커 (100 mL)을 반전 하 여 유리 베이킹 접시에에서 전송 플랫폼을 설정 합니다. 이 접시는 agarose 젤의 크기 보다 약간 더 큰 해야 합니다. 그들의 정상 유리 접시를 설정 합니다.</li>
		<li>유리 접시 위에 (젤 플러스 버퍼 저수지로 가장자리를 통해 드러 워 진 수 있는 더 긴 측의 폭의 크기로 잘라) 3MM CHR 크로마토그래피 종이의 2 큰 조각을 드러 워 진.</li>
		<li>크로마토그래피 종이 절반 채우기 유리 접시 이상의 알칼리 전송 버퍼를 붓는 다. 5 mL 유리 피 펫을 사용 하 여 거품이 부드럽게.</li>
		<li>Agarose 젤을 거품으로 부드럽게 다시 위에 놓습니다. Parafilm으로 젤의 모든 가장자리를 둘러싸고 있습니다. 젤에 소량의 알칼리 전송 버퍼를 붓는 다.</li>
		<li>젤 위에 미리 젖된 나일론 막 장소. 부드럽게 거품.</li>
		<li>종이의 젖은 2 조각 agarose 젤의 크기로 잘라. 그들은 막 위에 놓고 모든 거품을 밖으로 부드럽게 합니다.</li>
		<li>전송 샌드위치 위에 종이 타 올 (agarose 젤 보다 약간 큰 크기로 컷)의 대형 스택에 배치 합니다. 신중 하 게 유리 접시를 종이 타월 위에 놓습니다. 상단 (잘 400 g의 질량을 가진도 서)를 가중치 개체를 추가 합니다.</li>
		<li>하룻밤 실 온에서 진행 하는 전송 하자.</li>
		<li>신중 하 게 전송 스택을 분해 하 고 중화 버퍼 2에서 실 온에서 15 분 동안 막 흡수: 0.5 M Tris HCl, pH 7.2, 1 M NaCl.</li>
		<li>Crosslink UV crosslinker를 사용 하 여 충전된 나일론 막에 DNA. cross-linker에 막 놓고 autocrosslink 설정을 사용 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>남부 조사 준비 참고: 여기에 초기 선도 뒤지는 가닥 DNA 물가의 대 알칼리에 민감한 사이트는 프로토콜 기반 감지 설명 접근11이전 게시. 우리의 실험에 대 한 조사는 두 방향 (OR1 또는 OR2) 염색체 III (그림 3A)에 ARS306 복제 원점에 인접 한 중 하나에 삽입 된 URA3 취재 원 유전자에서 수행 됩니다. 효 모 게놈 DNA에 알칼리에 민감한 사이트의 존재는 ribonucleotide 관, DNA 중 합 효소 활동12,,1314의 biomarkers로 ribonucleotides 사용할 수 있습니다. 대상 복제의 효율적인 ARS306 근원에 인접 한 DNA 순서를 사용 하 여이 접근 다른 genomic 위치 및 대상 유전자도 순종 해야 합니다.<ol>
<li>다음 뇌관 쌍을 사용 하 여 URA3 취재 원 유전자의 PCR 증폭 520 기반 쌍 세그먼트: URA3 F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC)와 URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).</li>
		<li>템플릿으로 효 모 게놈 DNA의 10-20, 각 뇌관 (10 μ M 주식) Taq 버퍼 (Mg2 + 플러스) 예, dNTP 혼합물 (2.5 m m 각)의 8 μ, 0.5 μ의 전 Taq DNA 중 합 효소 x 10의 10 μ의 4 μ를 사용 하 여 PCR 반응을 수행 (5 U/μ) 100 μ H2o.를 최종 볼륨을 조정</li>
		<li>다음 PCR 프로그램 실행: 95 ° C 5 분; 1 분, 1 분, 2 분; 72 ° C에 55 ° C 95 ° C의 30 주기 72 ° C 10 분 및 4 ° c.에서 개최</li>
		<li>PCR 정화 키트를 사용 하 여 PCR 제품을 정화 하 고 H2o.의 50 mL를 사용 하 여 DNA elute 이것은 지금 radiolabeling 반응에서 템플릿으로 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>물가 관련 radiolabeling에 대 한 다음 뇌관을 사용 하 여: DNA 프로브 A. anneals는 시각화 사용 URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) 이 때 URA3 OR2와 tnascent URA3 OR1 때 가닥 DNA를 후행 초기 선도 가닥 DNA에 해당 합니다. URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG)를 사용 하 여 초기 DNA 프로브 B. anneals는 시각화에 대 한 이 때 URA3 OR1 및 초기 뒤지는 가닥 DNA URA3 OR2 때 초기 선도 가닥 DNA에 해당 (그림 3).<ol>
<li>URA3 조각 ng 증폭에 10-20을 사용 하 여 템플릿으로 DNA, 뇌관 (10 μ M 주식), Taq 버퍼 (Mg2 + 플러스) 전 10 x 5 μ, 4 μ (마이너스 dCTP), 2.5 m m dNTPs의 2 μ radiolabeling 반응 수행 5 μ (50 μCi)는-32P dCTP의 0.5 μ ExTaq DNA 중 합 효소의 (5 U/μ) H2o. 실행 다음 프로그램 radiolabeling 50 μ를 최종 볼륨을 조정: 94 ° C 5 분; 25 주기 94 ° C의 1 분, 55 ° C 30 초, 1 분; 72 ° C 72 ° C 5 분 및 4 ° c.에서 개최</li>
		</ol>
</li>
		<li>비법 인된 방사성 라벨을 제거 하려면 G-25 스핀 열을 사용 합니다. 방사선된 샘플을 추가 하기 전에 pipetting으로 g와 removethe 버퍼 x 720에서 1 분 동안 열을 원심. 방사선된 반응 제품 및 elute 레이블이 프로브를 720 x g에서 2 분 동안 원심 분리기를 로드 합니다.</li>
		<li>교 잡 직전 프로브 변성을 5 분 동안 95 ° C에서 품 어. 차가운 얼음에 잠시입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>남부 교 잡<ol>
<li>교 잡 관으로 유체 막 구르 고 갓된 교 잡 버퍼의 25 mL를 추가: 0.5 M 나트륨 인산 염 버퍼, pH 7.2, 7% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA). 교 잡 오븐에 회전 1-2 h 65 ° C에서 품 어.</li>
		<li>신중 하 게는 솔루션을 부 어 하 고 교 잡 버퍼 플러스 radiolabelled 프로브 25 mL를 추가 합니다. 65 ° C 16-18 h 회전에서 품 어.</li>
		<li>방사성 폐기물 컨테이너에 솔루션을 붓는 다. 수행 하는 각 인산 염-SDS 세척 솔루션 i: 40 mM 나트륨 인산 염 버퍼, pH 7.2, 실 온에서 5 분의 5 세척 5 %SDS, 0.5 %BSA, 1 mM EDTA, pH 8.0.</li>
		<li>2 세척 각 인산 염-SDS 세척 솔루션 ii 65 ° C에서 15 분의 수행: 40mm 나트륨 인산 염 버퍼, pH 7.2, 1 %SDS, 1 m EDTA, pH 8.0 m.</li>
		<li>핀셋을 사용 하 여 교 잡 튜브에서 멤브레인을 제거 하 고 열린된 플라스틱 슬리브 보호에. 표지 및 이미징 접시에 노출. 4 d 4 h에서까지 시간 다른 노출의 수를 보십시오.</li>
		<li>필요한 경우 제거 하 고 다시 프로브 다른 프로브를 사용 하 여 약 3-4 회 오. 스트립, 50% formamide 2 x SSPE 솔루션의 25 mL에 65 ° C에서 2 시간에 대 한 멤브레인을 품 어. 참고: 20 x SSPE 재고 솔루션: 3 M NaCl, 0.2 M NaH2포4, 0.02 M EDTA, pH 7.4.</li>
		<li>방사성 폐기물 컨테이너에 솔루션을 붓는 다. 인산-SDS 세척 솔루션 II에 65 ° C에서 15 분 각 2 세척을 수행 합니다.</li>
		<li>가 거 카운터로 막 확인 하 고 신호 유지 하는 경우 스트립 프로토콜을 반복.</li>
		<li>위에서 설명한 사전 교 잡 및 교 잡을 수행 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 측정 변이 속도 S. cerevisiae 긴장에 특이성
<ol><li>세포 배양 준비<ol>
<li>단일 식민지 (건강 한 효 모 세포 걸립니다 크기의 적절 한 형태를 30 ° C에서 2-3 일 식민지) YPDA 국물 (아데닌의 보충은 유일한 필요한 경우 250 mg/mL 아데닌으로 보충의 5 mL로 100 mg/mL 아데닌으로 보충 하는 YPD agar에 접종 사용 하는 긴장은 아데닌 주별)입니다. 성장 통 보육 또는 30 ° C에서 회전자에 문화 채도 (심각한 성장 결함 없이 긴장을 위한 36-48 h)를 도달할 때까지.</li>
		<li>5 분 ~ 2000 x g에서 셀 아래로 회전 합니다.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 메 마른 물 5 mL로 세포를 씻어.</li>
		<li>메 마른 물 500 mL에 셀 resuspend</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 배양 및 도금의 희석<ol>
<li>비 선택 컨트롤에 대 한 1,600,000 및 격판덮개의 완전 한 (COM) 접시에 각 문화 100 mL의 요인에 의해 96 잘 접시의 세포를 희석.</li>
		<li>Ura3 돌연변이 선택 하려면 100 mL 야생-타입 (WT) 긴장에 대 한 5-FOA 접시에 undiluted 셀의 접시. 관심의 긴장의 돌연변이 속도 WT 피로 보다 높을 것으로 예상 된다 하는 경우 그에 따라 셀을 희석.</li>
		<li>Can1 돌연변이 대 한 선택, 5-fold 셀을 희석 하 고 WT 스트레인에 대 한 포함 하는 canavanine 접시 (수)에 100 mL 접시. 희석 비율 0.5입니다.</li>
		<li>효 모 식민지 양식까지 30 ° C에서 번호판을 품 어. 성장 결함 없이 긴장에 대 한 2-3 일 일반적으로 COM에 대 한 충분 한 이며 접시와 5 FOA 번호판에 대 한 3-5 일 수 있습니다. 다른 긴장 사이 변이 속도 비교를 식민지를 성장의 같은 날 선택 최상 이다. 콜드 룸 (~ 4 ° C)에 포함 될 준비가 접시를 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>자연 돌연변이 율의 계산<ol>
<li>각 접시에 보이는 식민지 고 식민지 숫자의 메모</li>
		<li>드레이 크의 수식을 사용 하 여 돌연변이 율 계산: μ = f ÷ ln (μNt). f 마지막 문화에 있는 셀의 수로 나눈 돌연변이의 수로 계산 하는 돌연변이 주파수 이다. Nt는 최종 문화에는 셀의 수 이며 μ 돌연변이 비율. 이 방정식은 뉴 톤 Raphson 메서드와 같은 반복 방법으로 해결할 수 있습니다. 레 아와 Coulson 테스트 돌연변이 속도15계산 하을 포함 하 여 다른 견적 방법 있다.</li>
		<li>개별 격리의 utation 비율의 신뢰 구간 가정 로그 정규 분포를 계산 합니다. 95% 신뢰 구간 가장 자주 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>돌연변이 스펙트럼의 분석<ol>
<li>각 5 FOA에서 단일 식민지 나 판 수 YPDA 접시에 새로 고칩니다.</li>
		<li>식민지 다음 프라이 머를 사용 하 여 돌연변이 탐지 하기 위해 URA3 또는 CAN1 유전자와 순서를 증폭 하는 PCR을 수행: URA3 F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3')와 URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') 두 PCR 증폭에 대 한 고 800 bp URA3 유전자;의 시퀀싱 CAN1 F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3')와 CAN1 R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') 증폭 및 CAN1 아칸소 (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1 9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1 10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3')와 CAN1 BR ( 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') 1800 bp CAN1 취재 원 유전자의 시퀀싱에 대 한.</li>
		<li>식민지 PCR을 수행 하려면 resuspend H2O의 5 μ에서 단일 식민지 하 고 템플릿으로 1 μ를 사용 합니다. 뇌관 (5 μ M 주식), 5 x KAPA2G 버퍼 (Mg2 + 플러스)의 2 μ의 각각의 1 μ, dNTP (2.5 m m)의 0.5 μ, 0.5 μ의 KAPA2G 빠른 DNA 중 합 효소, 12 μ H2o.의 추가</li>
		<li>URA3 유전자의 증폭에 대 한 다음 PCR 프로그램 실행: 95 ° C 5 분; 10 95 ° C의 5 주기 s, 61 ° C 15에 대 한 s, 72 ° C 30에 대 한 s; 10 95 ° C의 35 주기 s, 61 ° C 15에 대 한 s, 72 ° C 30에 대 한 s; 72 ° C 2 분 및 4 ° c.에서 개최 CAN1 유전자의 증폭에 대 한 다음 PCR 프로그램 실행: 95 ° C 5 분; 10 95 ° C의 5 주기 s, 61 ° C 15에 대 한 s, 45 72 ° C s; 10 95 ° C의 35 주기 s, 61 ° C 15에 대 한 s, 45 72 ° C s; 72 ° C 2 분 및 4 ° c.에서 개최</li>
		<li>시퀀싱 결과 돌연변이 식별 하기 위해 DNASTAR Seqman 프로 또는 Sequencher 같은 프로그램을 사용 하 여 참조 시퀀스를 정렬 합니다.</li>
		<li>(그림 4) 돌연변이 유형 또는 돌연변이 위치 (그림 5) 변이 데이터를 컴파일하십시오. (관찰 하는 이벤트 수는 시퀀싱 하는 돌연변이의 수로 나눈) 돌연변이의 주파수에 의해 특정 돌연변이 속도 전체 돌연변이 율을 곱한 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Joyce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+the+right+sugar:+how+polymerases+select+a+nucleotide+substrate.">Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).</li><li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases.">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).</li><li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+H2-initiated+ribonucleotide+excision+repair.">RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair.</a> Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).</li><li>Li, Y., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+RNA+Degradation+by+Specific+Base+Catalysis+of+Transesterification+Involving+the+2'-Hydroxyl+Group.">Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).</li><li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+instability+due+to+ribonucleotide+incorporation+into+DNA.">Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA.</a> Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).</li><li>Williams, J. S., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotides+in+DNA:+origins,+repair+and+consequences.">Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences.</a> DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).</li><li>Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+ribonucleotides+incorporated+during+eukaryotic+DNA+replication.">Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).</li><li>Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luria-Delbruck+fluctuation+experiments:+design+and+analysis.">Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis.</a> Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).</li><li>Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+practical+guide+to+the+Luria-Delbruck+protocol.">A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol.</a> Mutat Research. 781, 7-13 (2015).</li><li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+roles+of+DNA+polymerases+epsilon+and+delta+at+the+eukaryotic+replication+fork+are+evolutionarily+conserved.">The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved.</a> PLoS Genetics. 7 (12), e1002407 (2011).</li><li>Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotides+are+signals+for+mismatch+repair+of+leading-strand+replication+errors.">Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors.</a> Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).</li><li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+1-mediated+removal+of+ribonucleotides+from+nascent+leading-strand+DNA.">Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA.</a> Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).</li><li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation.">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).</li><li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates.">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).</li><li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+processing+of+ribonucleotides+in+DNA+by+topoisomerase+1+is+leading-strand+specific.">Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).</li><li>Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+consequences+of+putative+active+site+mutations+in+yeast+DNA+polymerases+alpha,+epsilon,+delta,+and+zeta.">In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta.</a> Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).</li><li>Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+correction+of+lagging-strand+replication+errors+made+by+DNA+polymerases+{alpha}+and+{delta}.">Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).</li><li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon.">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity.">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016 (2012).</li><li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development.">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li><li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition.">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 ribonucleotides 동안에 DNA 복제 및 배달된 ribonucleotides의 변이 원 성 영향 통합 반 정량적 분석에 자주 사용 되는 실험의 두 집합에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 비록 이러한 접근 모델 진핵생물 S. cerevisiae를 포함, 이러한 기술은 다른 미생물과 더 높은 진핵생물에 쉽게 적응 될 수 있다.
남부 럽과 함께 agarose 알칼리 성 전기 이동 법을 사용 하 여 DNA에 배달된...

진 핵 DNA 복제 하는 동안 ribonucleotides 모든 3 개의 주요 DNA replicases와 DNA polymerases (Pols) α, ε, δ1,2게놈에 통합 됩니다. RNase h 2 종속 ribonucleotide 절단 복구 (RER3)이 포함 된 ribonucleotides의 대부분을 제거합니다.
2' 수 산 기 그룹 설탕 moiety의 인접 한 phosphodiester 본드, 2'-3' 순환 인산 및 5'-오4다른 한쪽 끝을 풀어 공격 수로 DNA에 ribonucleotide 가수분해을 받기 쉽습니다. 알칼리 조건 크게이 반응을 가속화할 수 있습니다. 따라서, 기본 솔루션에서 부 화 하는 동안 포함 된 ribonucleotides의 가수분해 agarose 알칼리 성 전기 이동 법5에 의해 구상 될 수 있다 게놈 DNA의 분열을 발생 합니다. 이 DNA는 막 전송 및 남쪽 오 점 분석 알칼리에 민감한 사이트 ribonucleotides에 초기 선도-또는 지체-가닥 DNA, 통합으로 인 한 식별 수 있도록 물가 관련 프로브를 사용 하 여 탐색할 수 있습니다. 각각.
효 모 세포 RNase h 2 활동 부족, ribonucleotides의 제거 topoisomerase 나 (Top1) 임베디드 ribonucleotide6,7에서 DNA 흠 때 시작할 수 있습니다. 그러나, Top1 3'의는 ribonucleotide 앞, 이것 생성 5'-아와 2'-3' 주기적인 인산 염 DNA religation 내 화물을 합니다. 수리, 또는이 '더러운 끝'의 탈 선 처리 실패는 게놈 불안정성으로 이어질 수 있습니다. 또한, 절 개 반복 DNA 시퀀스 내에서 발생 하는 경우 복구 프로세스 삭제 돌연변이 발생할 수 있습니다. 이것은 특히 문제가 있는 탠덤 반복, 어디 삭제를 짧은 (의 2 개의 그리고 5 개의 기본적인 쌍 사이) RNase h 2-불충분 한 세포에서 일반적으로 관찰 된다. 효 모 활동 ribonucleotide 설립 초기 선도 가닥 종합 동안에 대 한 무차별 DNA 중 합 효소 ε 돌연변이 (pol2 M644G)에서 악화는 RNase h 2의 부재에 Top1 종속 해로운 효과.
DNA에는 ribonucleotides의 처리 자연 스러운 돌연변이에 지도 하 고이 mutagenesis 적절 한 리포터 유전자를 사용 하 고 동반 phenotypic 변화에 대 한 선택 하 여 검출 될 수 있다. 변동 테스트 또는 Luria 그리고 델 브 룩 실험 자발적인 돌연변이 속도 선택 가능한 기자 유전자8,9를 사용 하 여 측정을 가장 일반적으로 사용 되는 방법 중 하나입니다. 효 모, URA3 및 CAN1 유전자 유전자 기능의 손실 모든 돌연변이 유형의 탐지에 대 한 수 있는 앞으로 돌연변이 분석 결과에 기자로 사용할 수 있습니다. 자발적인 돌연변이 속도 여러 병렬 문화 대상 취재 원 유전자에 돌연변이 없이 단일 식민지에서 시작에 대 한 관찰의 중간값으로 추정 된다. RNase h 2 불충분 한 변형 rnh201Δ는 적당히 높은 전반적인 자발적인 돌연변이 속도에 2-5 bp 삭제의 높은 부각으로 인해 크게와 같은 효 모 시퀀스를 반복 합니다. 따라서, 완전히 게놈에 있는 ribonucleotides의 변이 원 성 영향 특성, 특정 돌연변이 속도 결정 될 필요가 있다. 이 경우에, URA3 또는 CAN1 리포터 유전자 증폭 될 수 있으며 시퀀스 유형, 돌연변이의 위치를 결정 하 고 특정 돌연변이 속도 계산할 수 있다. 여러 명의 독립적인 URA3 또는 CAN1 돌연변이에서 확인 된 돌연변이 컴파일 다음 돌연변이 스펙트럼을 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>YPD media</td><td></td><td></td><td>20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave.</td></tr><tr><td>COM plates</td><td></td><td></td><td>1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 &amp;ndash; 35 ml per plate.</td></tr><tr><td>CAN plates</td><td></td><td></td><td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 &amp;deg;C and cool down to 56 &amp;deg;C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution.</td></tr><tr><td>5-FOA plates</td><td></td><td></td><td>1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 &amp;deg;C and cool down to 60 &amp;deg;C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution.</td></tr><tr><td>L-Canavanine sulfate</td><td>US Biological</td><td>C1050</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>US Biological</td><td>F5050</td><td></td></tr><tr><td>20 mL glass culture tube</td><td></td><td></td><td>Any brand</td></tr><tr><td>Culture rotator in 30 &amp;deg;C incubator</td><td></td><td></td><td>Shaker incubator can be used instead</td></tr><tr><td>96 well round bottom plates</td><td></td><td></td><td>Sterile, any brand</td></tr><tr><td>3 mm glass beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-312A</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>12-channel pipettes</td><td></td><td></td><td>Any brand</td></tr><tr><td>Ex Taq DNA Polymerase</td><td>TaKaRa</td><td>RR001</td><td></td></tr><tr><td>Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit</td><td>Epicenter</td><td>MPY80200</td><td></td></tr><tr><td>3 M sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>Newer model available</td></tr><tr><td>dsDNA BR Assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>DSF10400</td><td></td></tr><tr><td>Bromocresol green</td><td>Eastman</td><td>6356</td><td></td></tr><tr><td>Xylene cyanol FF</td><td>International Technologies Inc.</td><td>72120</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>Teknova</td><td>T5080</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>UV transilluminator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Nylon membrane Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>3 MM CHR Chromotography paper</td><td>Whatman</td><td>3030-392</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>G-25 spin column</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (S9638);&lt;br/&gt; Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (S9390)</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671</td><td></td></tr><tr><td>Geiger counter</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studying ribonucleotide incorporation: strand-specific detection of ribonucleotides in the yeast genome and measuring ribonucleotide-induced mutagenesis

핵 DNA에 ribonucleotides의 존재 genomic 불안정성의 원천 수를 보였다. Ribonucleotide 법인의 알칼리 가수분해에 의해 평가 될 수 있다 젤 전기 이동 법으로 RNA는 알칼리 조건에서 가수분해에 매우 취약 하며 이, 남쪽 오 점 분석에와 함께 사용할 수 있습니다 위치를 결정 하는 ribonucleotides 통합 되었습니다으로 물가 하. 그러나,이 절차만 반 정량적 이며 비록 감도 향상 가닥 특정 남쪽 오 점 프로 빙 충분히 ribonucleotide 콘텐츠에 작은 변화를 감지 하는 민감한 되지 않을 수 있습니다. 하나는 DNA에 ribonucleotides의 가장 눈에 띄는 생물 학적 결과의 측정으로 자발적인 mutagenesis 앞으로 돌연변이 분석 결과 사용 하 여 분석 수 있습니다. 적절 한 리포터 유전자를 사용 하 여 선택 되 고 전체 기능의 손실 귀착되는 희소 한 일 수 있다 그리고 취재 원 유전자의 DNA 시퀀싱 변동 실험에서 데이터를 결합 하 여 특정 돌연변이 속도 측정할 수 있다. 변동 분석 결과 특정 유전 배경이 나 성장 조건에서 변이 원 성 프로세스의 다양 한 검사에 적용 됩니다.

치료 알칼리 알칼리 젤 전기 이동 법 뒤 genomic DNA의 안정적으로 통합된 ribonucleotides의 풍부 때문에 DNA 파편의 반 정량적 검출 할 수 있습니다. 그림 2 는 효 모의 게놈 DNA 치료 또는 코5없이 젤 이미지를 보여준다. Pol2, Polε의 촉매 소 단위의 M644L 변종 M644G 돌연변이 WT 중 합 효소 보다 더 ribonucleotides를 통합 하는 동안 ribonucleotides를 통?...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis at Jo

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Ribonucleotides는 가장 풍부한 비정규 뉴클레오티드 핵 핵 DNA 복제 중 게놈으로 통합 중 이다. 제대로 제거, DNA 손상과 mutagenesis ribonucleotides 발생할 수 있습니다. 여기, 우리가 DNA와 그 변이 원 성 영향으로 ribonucleotide 설립의 풍부를 평가 하는 데 사용 되는 두 가지 실험 방법을 제시.

Ribonucleotides 효 모 게놈에 Ribonucleotide 유도 된 Mutagenesis 측정의 공부 Ribonucleotide 법인: 물가 관련 검색

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

studying-ribonucleotide-incorporation-strand-specific-detection

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.7K 조회수.  National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, DHHS. Ribonucleotides는 가장 풍부한 비정규 뉴클레오티드 핵 핵 DNA 복제 중 게놈으로 통합 중 이다. 제대로 제거, DNA 손상과 mutagenesis ribonucleotides 발생할 수 있습니다. 여기, 우리가 DNA와 그 변이 원 성 영향으로 ribonucleotide 설립의 풍부를 평가 하는 데 사용 되는 두 가지 실험 방법을 제시.

비디오: Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

연구

생화학

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

유전학

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of different functional assays to study the impacts of 1) binding site [i.e., response element (RE)] sequence variants on P53 transactivation specificity or 2) TP53 mutations, co-expressed cofactors, or small molecules on P53 transactivation activity. Different basic and translational research applications have been developed. Experimentally, these approaches exploit two major advantages of the yeast model. On one hand, the ease of genome editing enables quick construction of qualitative or quantitative reporter systems by exploiting isogenic strains that differ only at the level of a specific P53-RE to investigate sequence-specificity of P53-dependent transactivation. On the other hand, the availability of regulated systems for ectopic P53 expression allows the evaluation of transactivation in a wide range of protein expression. Reviewed in this report are extensively used systems that are based on color reporter genes, luciferase, and the growth of yeast to illustrate their main methodological steps and to critically assess their predictive power. Moreover, the extreme versatility of these approaches can be easily exploited to study different TFs including P63 and P73, which are other members of TP53 gene family.

Presented here are four protocols to construct and exploit yeast Saccharomyces cerevisiae reporter strains to study human P53 transactivation potential, impacts of its various cancer-associated mutations, co-expressed interacting proteins, and the effects of specific small molecules.

인간 P53을 연구하기 위한 기능성 어세이 개발을 위한 섀시로 효모

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

암 연구학

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

인간의 DNA 수리 단백질의 유전자 연구는 모델 시스템으로 효모를 사용하여

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

생물학

DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2&#8217;-O-Methylation

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in higher eukaryotes may promiscuously recognize other RNA species and 2&#8217;-O-methylate multiple targets. Here, we provide step-by-step guide for the fast and non-expensive analysis of the site-specific 2&#8217;-O-methylation using a well-established method employing short DNA oligonucleotides called DNAzymes. These DNA fragments contain catalytic sequences which cleave RNA at specific consensus positions, as well as variable homology arms directing DNAzyme to its RNA targets. DNAzyme activity is inhibited by 2-&#8217;O-methylation of the nucleotide adjacent to the cleavage site in the RNA. Thus, DNAzymes, limited only by the consensus of the cleaved sequence, are perfect tools for the quick analysis of snoRNA-mediated RNA 2&#8217;-O-methylation. We analyzed snoRNA snR13- and snR47-guided 2&#8217;-O-methylation of 25S ribosomal RNA in Saccharomyces cerevisiae to demonstrate the simplicity of the technique and to provide a detailed protocol for the DNAzyme-dependent assay.

Here we present a protocol for DNAzyme-dependent cleavage of RNA. This enables fast and site-dependent analysis of RNA 2&#8217;-O-methylation. This approach can be used for the preliminary or major assessment of snoRNA activity.

RRNA 2'-O-메틸화의 DNAzyme 의존분석

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in ...

발생학

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

mRNA의 붕괴 요금의 측정에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용&gt;<em&gt; rpb1-1</em&gt; 균주

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

동시 매핑 및 인간 미토 콘 드리 아 DNA에 Ribonucleotides의 정량

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Ribonucleotides 효 모 게놈에 Ribonucleotide 유도 된 Mutagenesis 측정의 공부 Ribonucleotide 법인: 물가 관련 검색

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터