안녕하세요, 내 이름은 바르톨로메오 보스코이며, 나는 이탈리아 트렌토 대학의 통합 생물학 센터에서 전사 네트워크 연구소에서 박사 과정 학생입니다. 아시다시피, 전사는 전사 인자와 공동 요소의 공간 및 측두조직과 관련된 매우 복잡한 과정입니다. 인간 P53을 포함한 이들 대부분은 반응 요소라고 불리는 특정 시스 작용 요소를 인식하고, 이 DNA 시퀀싱에 대한 결합은 표적 유전자의 전사의 변조에 필요하다.
이 작품에서, 우리는 당신에게 색상 리포터 유전자 또는 루시파라제 또는 세포 성장의 정량화에 단백질로 효모를 사용하여 변환 기능에서 특정 P53 서열을 연구하는 프로토콜을 보여주고 싶습니다 이러한 접근 방식의 주요 실험 단계와 다재다능함을 강조하고자합니다. 프로토콜 1, 아데닌-2 또는 반딧불 루시파라제 유전자의 상류에 특정 P53 반응 요소를 포함하는 리포터 효모 균주의 시공. 기자 균주를 구성하기 위해 먼저 1.1~1.15단계를 수행하여 원하는 프로모터 영역을 대상으로 올리고뉴클레오티드로 효모 세포를 변형시킨다.
변환은 표준 리튬 아세테이트 기반 프로토콜을 기반으로 합니다. 변압제가 5-FOA 플레이트에 나타나면, 보통 3일 동안 30도에서 배양한 후, 복제판은 선택적이지 않은 YPDA 플레이트와 G418을 포함하는 YPDA 플레이트에 플레이트를 플레이트에 표시하여 후속 비교를 용이하게 합니다. 접시를 30도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
다음 날, G418 에 민감한 하지만 YPDA 플레이트에 성장 하는 식민지에서 후보 기자 균주를 확인 합니다. 새로운 YPDA 플레이트에 확인된 식민지를 줄이면 단일 식민지 분리를 얻고 30도에서 이틀 동안 자랄 수 있습니다. 원하는 P53 응답 요소의 올바른 통합을 확인하여 1.20 단계에서 언급된 조건과 PCR 반응을 수행합니다.
sanger 시퀀싱 전에 올바른 앰플리코 길이를 확인하기 위해 아가로즈 젤에 PCR 제품의 알리쿼트를 로드합니다. 프로토콜 2, 우리는 질적 색상 기반 adenine-2 효모 분석법을 사용하여 P53 단백질 변환 능력을 평가하는 방법의 예를 제시한다. 섹션 1에 설명된 동일한 리튬 아세테이트 계 프로토콜에 따라 P53 발현 벡터를 갖는 효모 세포를 변환한다.
새로운 선택적 접시에 접시 당 최대 6 까지 단일 효모 변환제 식민지를 줄이며, 30도에서 하룻밤 성장하자. 다음날, 멸균 벨벳을 사용하여, 복제판은 색 표현형, 즉 아데닌의 제한량을 포함하는 선택적 플레이트의 평가를 허용하는 새로운 선택적 플레이트에 줄무늬를 플레이트한다.
3 일 동안 30도에서 배양하십시오. 동일한 줄무늬는 복제본을 여러 번 도금할 수 있습니다. 프로토콜 3, 우리는 지금 정량 발광 계 LUC1 효모 분석기를 사용하여 P53 단백질 환화 능력의 평가의 예를 제시한다.
먼저, P53 발현 벡터를 갖는 효모 세포를 변환하고, 다시, 제2항에 기재된 리튬 아세테이트 계 프로토콜. 탄소원으로 포도당을 포함하는 새로운 선택적 플레이트에 단일 변압제를 패치하고 하룻밤 사이에 30도에서 성장하게하십시오. 각 변환 유형에 대해 5~7개의 패치를 만듭니다.
하룻밤 성장 후, 탄소 원으로 라피노스를 포함하는 합성 선택적 매체에서 멸균 이쑤시개 또는 파이펫 팁을 사용하여 소량의 세포를 재연한다. 이러한 세포 현탁액은 약 0.4의 600 나노미터에서 광학 밀도를 가져야하며, 다른 온도, 치료 또는 P53 발현을 활성화하기 위해 다양한 양의 갈락토에 세포를 노출하기 위해 여러 96 웰 플레이트로 분할 될 수 있습니다. 반딧불이 리포터 활성을 측정하기 위해 투명 96웰 플레이트에서 10~20마이크로리터의 셀 서스펜션을 백색 384웰 플레이트로 옮기고, 셀을 동일한 양의 용해 완충제로 혼합하여 셰이커의 실온에서 10분, 15분 동안 배양한다.
반딧불 루시파라기 기판 10, 20 마이크로리터를 추가합니다. 그리고 멀티 라벨 플레이트 리더기를 사용하여 라이트 유닛을 측정합니다. 또한 96웰 플레이트에서 배양물의 광학 밀도를 측정합니다.
프로토콜 4, 우리는 지금 P53에 의해 유도된 효모의 성장의 억제를 이용하는 방법의 예를 제시한다. P53 발현 벡터를 사용하여 효모 세포를 변환하거나, P53 및 MDM2와 같은 공동 인자 중 하나인 코익스프레스에 발현 벡터를 결합하여 제1항에 기재된 리튬 아세테이트 계 프로토콜을 다시 한 번 변환한다. 선택적 매체에서 약 1개의 광학 밀도로 변압제 세포를 성장시키도록 한다.
그리고 그들을 0.05로 희석하고, 선택한 분자를 적절한 농도에 첨가한다. 42 시간 동안 셰이커에 30도에서 세포를 배양. 이어서, 최소한의 선택적 중간 플레이트에서 효모 세포 배양의 100 마이크로리터를 종자.
30도에서 이틀 동안 배양하십시오. ICORE 카세트 대신에 올바른 RE 통합은 콜로니 PCR에 의해 확인할 수 있으며, 후보 효모 클론으로부터 의 외량의 세포로부터 시작하여 표 3에 기재된 프라이머를 사용하여 표적 궤적을 증폭시킬 수 있다. PCR 제품, 약 500뉴클레오티드의 대역은, 정확한 P53 반응 요소 서열의 존재를 위해 편집된 게놈 위치의 서열을 확인하기 위해 Sanger 시퀀싱에 의해 검사될 수 있다.
리포터 변형은 기능적 에세이에 사용될 준비가 되어 있습니다. P53 단백질 변환 능력을 평가하려면 효모 콜로니의 색상을 확인하십시오. 예를 들어, 우리는 두 개의 서로 다른 기자, P21-5-프라임 및 PUMA, 두 개의 서로 다른 온도, 30도 및 37도를 사용하여 야생 형 P53및 돌연변이 R175H 및 R282W 사이의 비교를 제시한다.
흥미롭게도 R175H는 기능 상실 P53 알렐레, 모든 조건에서 붉은 식민지인 반면, R282W는 잔류 환원 활성을 30도에서 나타내며, 백색 식민지의 결과로 온도 민감도를 나타내지만 37도에서 활동이 손실되어 빨간색 또는 분홍색 콜로니가 생성됩니다. 확장된 데이터 세트는 4개의 돌연변이 진상선에 있는 2개의 B.Wild 형 P53을 10개의 다른 P53 반응 요소 리포터 균주, 3개의 온도 및 구성식 수준을 사용하여 변환활성화를 위해 시험되었다. 결과는 효모 식민지 색상 표현형을 생각 나게하는 색상 코드로 요약됩니다.
P53 K139E 돌연변이 진상제는 부분 활성을 유지하고 냉소 민감성입니다. 예를 들어, 식민지는 24도와 30도에서 GADD45 기자 변형에 빨간색이지만, 37도에서 흰색입니다. 여기서, 우리는 인간과 C.elegans P53 효모의 트랜스활성화 특이성을 비교하는 이 방법으로 얻은 결과의 예를 제시합니다.
막대 그래프의 결과는 4개의 복제의 표준 오차가 있는 평균 상대 광 단위로 표현됩니다. 5개의 다른 P53 응답 요소를 비교했습니다. P53 단백질 발현의 세 가지 상이한 수준은 배지내의 갈라토제 농도를 변화시킴으로써 시험하였다.
두 P53 교정기는 현저하게 다른 상호 활성화 특이성을 보여줍니다. 이는 28-뉴클레오티드 스페이서의 존재 또는 부재를 제외하고 동일한 서열을 공유하는 ced13 및 V1 반응 원소의 결과에 의해 예시된다. 인간 P53은 V1 바인딩 사이트와 훨씬 더 높은 변환을 나타내며 C.elegans P53은 그 반대를 보여줍니다.
결과는 갈라토세 유도 할 수없는 프로모터에서 P53 발현의 수준에서 독립적이다. 100 마이크로리터 배양물에서 얻은 콜로니수를 계산하여 효모 성장을 측정합니다. 돌연변이 P53을 발현하는 세포의 성장이 0 레벨의 재활성화를 나타내는 동안 효모를 최대한 의약으로 표현하는 야생형 P53의 성장을 고려한 화합물의 돌연변이 반응 효과를 계산한다.
이 예에서, Nutlin-3a는 MDM2의 공동 발현에 의한 야생형 P53의 억제를 완화하고, PhiKan083은 Y220C P53 돌연변이를 부분적으로 재활성화한다. 두 경우 모두, 이것은 효 모 성장의 P53 의존 적인 감소 결과. 효모 기저 세포는 P53 단백질 기능의 가치, 측면을 조사하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다.
이 작품에 설명된 프로토콜은 야생형 또는 암 관련 돌연변이 P53의 전환 가능성을 표적 사이트의 이체로 평가하기 위해 특히 민감하다. 추가, 접근은 P53 기능에 영향을 미치는 작은 분자를 확인하고 공동 인자와 P53 상호 작용을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 색상 기자의 사용, 루시파라제의 소형화뿐만 아니라 성장 억제 테스트는 비용 효율적이고 확장 가능한 분석을 초래화학 라이브러리 스크리닝에 잠재적으로 적합.
마지막으로, 이 작업에 기재된 시스템은 다른 서열 특이적 전사 인자의 연구와 함께 쉽게 채택될 수 있다.
