Name: measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains
Uploaded: 2014-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
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Research in the author&#8217;s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board&#8217;s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

효모 세포의 1. 성장 <ol><li> mRNA의 붕괴 속도 측정을 위해 활용 될 수있는 적절한 효모 균주를 선택합니다. RNA 중합 효소 II의 온도에 민감한 대립 유전자를 사용하여 전사를 억제하기 위해, rpb1-1 돌연변이 일을 품고 효모를 사용합니다. 이미 하나를 가지고이 실험실에서 효모 균주를 얻거나 특정 유전 적 배경이 9 필요한 경우 표준 기술을 사용하여 실험실에서 생성. </li><li> 표준 절차 (10)를 사용하여 효모 미디어를 준비, 멸균 기술을 사용. 어떤 선택이 필요하지 않은 경우, 이러한 YPD으로 리치 미디어를 준비합니다. 및 선택 플라스미드로 형질 전환 된 효모 세포가 필요할 경우 선택적으로, 선택 배지를 준비한다. 미디어를 압력솥. </li><li> 이 효모의 허용 온도 28 ° C에서 효모 세포를 성장. 두 단계로이 작업을 수행합니다 : <ol><li> 제 들면 O / N은 ​​포화 성장 배지 5ml에 효모 세포 성장.</li><li> 둘째 날의 끝에서 두 번째 O / N을 설정한다. 제 O / N의 경우, 제 O 발 / N 100 μL 1 ㎖, 2 ㎖의 이상 범위의 성장 배지 (100~150 ㎖ 중에 효모 세포 상이한 양의 접종에 따라 효모 세포가 될 필요가있을 때 ) 다음날 수확. 문화 중 하나가 올바른 OD (600) 다음 날에 있는지 확인하기 위해이 단계를 수행합니다. </li></ol></li></ol> 2. 수확 효모 세포 <ol><li> 효모 세포를 수확 준비합니다. 이 단계를위한 타이밍이 중요하다; 필요한 모든 튜브에 라벨을 한 곳에서 필요한 모든 장비와 자료를 수집합니다. 39 ° C의 물 목욕을 데우고 C 28 ° C에서 60 °에서 성장 미디어의 두 15 ml의 테스트 튜브를 예열. 참고 : 15 ml의 성장 배지 볼륨 세포 수확하는 시점의 수에 따라 변할 수있다. </li><li> 그들은 0.7 0.4 OD 600에 도달 할 때 효모 세포 수확. TRANSF어 4 셀 - 50 6 멸균 ml의 캡 병 나사. RT에서 5 분 동안 고속 원심 분리기에서 7,500 XG 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 28 ° C에서 평형화 된 15 ml의 성장 배지에서 펠렛을 재현 탁. 하나 멸균 250 ml의 플라스크에 효모 세포를 수영장과 28 ° C의 성장 온도에서 ~ 5 분 동안 그들을 평형. </li><li> 효모 세포가 성장 온도로 평형화 한 후, 즉시 39 ° C (nonpermissive 온도)까지 승온 후, 60 ° C로 평형화 된 성장 배지의 15 ㎖에 추가하고 즉시 39 ° C의 물을 용기에 플라스크를 배치 . 문화 매체가 전사의 전원이 켜져 있는지 확인하기 위해 나머지 세포 수확 단계에 걸쳐 39 ° C의 물을 욕조에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 39 ° C의 물을 용기에 플라스크를 배치 한 후 다른 시간에 세포를 수확. 제 시점의 경우, # 39에 플라스크를 배치 직후에 세포를 수확176; C. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브를 3 mL를 수확하고 두에 3 ㎖를 배포 할 수 있습니다. 미니 원심 분리기에 10 초 동안 펠렛은 세포 또는 빠른 감속 picofuge 상층 액을 붓는다. </li><li> 즉시 드라이 아이스 / 에탄올 욕에서 또는 액체 질소 중에서 동결 펠릿. 세포가 제로 시점에서 수확 같은 제 시점을 지정한다. </li><li> 실험적으로 관심의 mRNA에 따라 파일럿 테스트하여 세포에 수확 후 시점을 결정한다. 일반적으로, 다음과 같은 시점에서 수확 효모 세포 : 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 및 35 분 (도 2B). mRNA의 반감기가 상술 한 시점을 이용하여 판별 할 수없는 경우,이 시점을 조절한다. 예를 들어, 예상 짧은 반감기 mRNA에 대해, 짧은 시간 포인트를 사용하는 (즉, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12, 18 분) 및 예상 긴 반감기 mRNA에 대해, 확장 시점. </li><li> 전지 후, 하이다RNA 추출이 수행 될 때까지 rvested는 -80 ° C의 냉동고에 저장합니다. </li></ol> 효모 세포 3. 추출 RNA <ol><li> 프로토콜의 RNA 추출 부용, RNases 의해 RNA의 분해를 방지하기의 RNase에게 무료 기법을 사용한다. 의 RNase에게 무료 솔루션, 유리 및 플라스틱 도자기는 RNA의 추출에 사용되는을 준비합니다. </li><li> 표준 프로토콜에 따라 효모 세포에서 RNA를 추출합니다. 일반적으로, 핫 페놀을 사용하는 방법 (12). 대안 적으로, 효모 세포로부터 RNA를 추출하기 위해 사용될 수있는 키트를 사용한다. </li><li> 일반적으로 260에서의 흡광도와 Nanodrop를 사용하여 RNA의 280 2 μl를 측정하여, RNA의 양과 순도를 결정합니다. 농도를 기준 (260)로부터의 RNA의 농도를 측정, 1 μg의 RNA로 희석 / DEPC 처리 된 물을 사용 μL. 참고 : 260의 비율 / t에 대한 정보를 제공합니다 (280)RNA의 고 순도. 260 / 280 비율이 2.0 ± 0.1 인 경우 RNA 샘플은 순수하다. </li></ol> 4. 노던 블롯 분석 참고 : mRNA 수준을 정량화 및 성적 증명서의 크기에 대한 정보를 얻기 위해 북부도 말을 사용합니다. 또한, 같은 mRNA를 여러 이성체의 mRNA를 생산을 검출하는 노던 블롯을 사용한다. <ol><li> 1.0 % 아가로 오스 - 포름 알데히드 젤을 준비합니다. 표준 프로토콜 (12)에 따라 전기 영동으로 아가 로스 포름 알데히드 겔에 샘플 RNA 같은 양을 실행합니다. RNA 샘플과 함께 RNA 사다리를 실행하고 북부 오점에서 감지 된 RNA의 크기를 결정하는 데 사용합니다. 막에 아가로 오스 포름 알데히드 겔에서 분리 된 RNA를 전송하기 전에, 젤에서 RNA 사다리 차선을 절감하고 에티 디움 브로마이드를 사용하여 시각화. 주 : 대안 적으로, 전체 겔 RNA의 전사 전에 티듐 브로마이드로 염색 할 수있다. </li><li>따고 RNA 시료를 겔상의 적절한 간격으로 이주,의 RNase에게 무료 기술을 이용하여 막에 RNA를 옮긴다. 막 12 ~ 13에 RNA를 전송하는 데 사용할 수있는 여러 가지 프로토콜 중 하나를 사용합니다. 막에 RNA를 전송하려면, 겔과 거의 동일한 크기로 잘라 막. 표준 프로토콜 (12)에 따라 RNA를 전송합니다. </li><li> 자외선 제조업체의 지침에 따라 UV 가교 결합제를 사용하여 막에 RNA를 크로스 - 연결합니다. 대안 적으로, 1 시간 동안 80 ° C로 설정된 오븐에 구워 막. 이 특정 프로브에 혼성화 될 때까지 무기한 비닐 봉투에 -20 ° C에서 막을 저장합니다. 주 : 건조 막은 또한 여과지 사이 RT에서 저장 될 수있다. </li></ol> 5. 혼성화 프로브 막에 대한 관심의 RNA에 대한 보완 주 : 멤브레인에 mRNA를 검출하는 방법 중 하나는 P (32) 표지 된 DNA 프로브를 혼성화하는 것이다. 주의 : resea의32 P 작업 rchers는 오염을 방지하기 위해 보호 절차를 사용해야합니다. 방사성 물질의 사용에 대한 제도적 가이드 라인을 따르십시오. <ol><li> 25 라벨에 의해 DNA 프로브를 준비 - DNA의 50 NG는 표준 프로토콜 (12)에 따라 막에 하이브리드합니다. PCR 또는 절단에 의해 플라스미드 DNA 단편을 생성한다. 비법 뉴클레오티드 12 제거한 후 방사성 표지 된 DNA 프로브의 1 μl를 카운트하여 DNA 프로브의 특이 적 활성을 결정한다. </li><li> 42 ° C에서 예열 예비 혼성화 / 하이브리드 버퍼입니다. 막 (12)의 100cm 2 당 예비 혼성화 / 하이브리드 버퍼의 ~ 10ml를 사용합니다. </li><li> 1 혼성화 - 멤브레인 O 혼성화 완충액 1 ㎖ 당 방사성 표지 된 DNA 프로브의 5 × 106 CPM을 / 혼성화 오븐에서 N은 관심 (12)의 mRNA를 검출한다. 하이브리드 동안 하이브리드 오븐 회전 방향에 있는지 확인하는전체 막은 적절한 혼성화를 보장하기 위해, 혼성화 용액에 노출되도록한다. </li><li> 2 × SSPE 50 ㎖, 15 분간 12 배속 SSPE / 2 % SDS 50 ㎖와 65 ℃에서 한 시간 15 분 동안 RT에서 막 두 번 씻는다. 그것을 건조 또는 형광면을 오염시키지 않도록하기 위해 플라스틱 랩 막 감싸. </li><li> 가이거 계수기를 사용하여, 막에 방사능의 강도를 추정한다. 주 :이 추정 멤브레인 시간 적절한 양 형광면에 노출되는 것을 보장한다. 방사능의 낮은 양의 세포막이 더 오래 노출 시간을 사용합니다. </li><li> 북부도 말 들어, RNA 같은 양의 각 지점에로드하는 것을 확인하기 위해 로딩 컨트롤을 사용합니다. 이를 위해 막을 제거하고 프로세스가 검사되는 영향을받지 않는 RNA로 reprobe. XS 박리 액 (0.1 % SDS / 0.01 끓는 200 ㎖을 함유하는 유리 트레이에 배치하여 멤브레인을 벗기고2 분 동안 SC). 제거 솔루션을 붓고 절차를 다섯 번 12를 반복합니다. 참고 :. 로딩 대조군으로 사용 RNA의 예는 SCR1입니다 SCR1 안정적이고 풍부한 RNA 중합 효소 III 성적 증명서입니다 SCR1 RNA 풍부는 RNA 중합 효소 II 억제의 짧은 기간 동안 크게 변경하지 않아야합니다.. </li></ol> 6. 막에 바인딩 된 RNA를 정량화 참고 : 멤브레인 방사능의 양을 정량화 형광면에 막을 노출하기. 적절한 노출 시간 후,은 phosphorimager을 사용하여 형광면을 스캔. <ol><li> 은 phosphorimager의 제조업체가 제공하는 지침을 사용하여 형광체 화면을 검색합니다. </li><li> 각 시점에서 mRNA의 정량화. ImageQuant 소프트웨어 또는 관련 소프트웨어를 사용하여 mRNA 수준을 정량화. 로딩 컨트롤 각 시점에서의 mRNA 정규화. SCR1는로드로 사용 되었다면제어는 SCR1으로 반감기 northerns 정상화. </li><li> mRNA의 반감기는 시각 0에서 mRNA의 존재의 양에 의해 각 시점에서 남아있는 mRNA의 양 (초기 시점)을 나누어 계산한다. semilogarithmic 플롯 (그림 2C)에 대 시간 남은 퍼센트의 mRNA를 그래프입니다. 다음 식에 의해 mRNA의 반감기를 계산한다 : t 1/2 = -0.693 / K (음 0.693) </li><li> k는 추세선의 기울기이고, t 1/2 mRNA의 반감기이다. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interest.

mRNA의 합성과 새로운 합성의 부재 하에서 mRNA의 회전율을 모니터링 억제 자주 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 사용되는 방법이다. S.에서 cerevisiae를는 RNA 중합 효소 II의 온도 민감성 대립 유전자를 사용하여 전사를 억제함으로써 mRNA의 붕괴 속도의 측정은 가장 자주 사용되는 방법 중 하나이다. 이 방법은 구체적으로는 RNA 중합 효소 II를 억제한다. 이 기술을 사용하여 mRNA의 붕괴 속도의 결정...

전사 및 특정 mRNA를 붕괴는 유전자 발현의 중요한 결정 요인이다. 합성 및 특정의 mRNA의 붕괴 속도는 특정 mRNA를 정상 상태 수준을 결정합니다. 의 mRNA의 정상 상태 수준의 mRNA의 풍요 로움을 지배하고 단백질 합성에 사용할 수 있습니다 얼마나 많은 각각의 mRNA를 결정합니다. mRNA의 반감기의 측정의 mRNA 붕괴 속도를 결정하기 위해 광범위하게 사용된다. mRNA의, mRNA와 환경 조건에 의해 암호화 된 단백질의 기능의 기능에 관련된 다른 속도 특정 mRNA를 붕괴. mRNA의 붕괴 속도를 판단하기 위해 이용 된 기술에 따라서, 감소율 측정은 전역 적 또는 개별 사체에 대해 결정될 수있다. 효모 S.에서 cerevisiae에 가장 일반적으로 전체 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 사용되는 기술은 RNA 중합 효소 II 화학 transc의 온도 민감성 대립 유전자를 보유하는 효모 균주를 이용하는 것을 포함이러한 thiolutin 1,10- 페난 트롤 린 1-5 riptional 억제제. 이러한 방법은 또한 개개의 mRNA 붕괴 속도 4를 측정하는데 이용 될 수있다. 다른 방법은 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 이용 될 수있다. 이러한 방법은 정상 상태 표시 또는 유일한 선택 조건에서 발현되는 규제 프로모터로부터 발현되는 mRNA의 분자의 활용에 대한 접근 방법을 포함한다. 이러한 기술의 각 특정 장점과 제한 사항이 있습니다. 여기에 기재된 기술은 RNA 중합 효소 II의 온도 민감성 대립 유전자를 이용한다. 이 방법을 사용하여 S. cerevisiae의 모델로서, 특정 전사 억제 기술 (6)을 사용하는 다른 시스템들에서 이용되어 변형과 수 있지만. RNA 중합 효소 II의 온도에 민감한 대립 유전자를 사용하여 mRNA의 반감기 측정은 광범위하게 mRNA의 붕괴 4-5의 두 게놈 전체 및 개별 측정에 사용됩니다. 이 기술과 특이의 사용을 필요RNA 중합 효소 II, rpb1-1 1의 온도에 민감한 대립 유전자를 품고 IC 효모 균주. 이 기술에 대한 이론적 근거는 nonpermissive 온도로 온도에 민감한 효모의 노출이 mRNA의 합성을 억제한다는 것입니다. 전사가 억제 된 후에 계속해서, 기존의 mRNA 붕괴가 상이한 시점에서 모니터링된다. 기존의 mRNA 전사 소멸이 해제 된 후에 서로 다른 시간 지점에서 효모 세포로부터 RNA를 추출하여 모니터링된다. 효모 세포를 수확하는 시점은 파일럿 실험에 의해 미리 결정된 및 성적 및 시스템이 연구되고에 달려있다. 긴 시간 점 이상 거주 증명서에 사용하는 동안 더 빨리 시점은, 단명 한 성적 증명서에 사용됩니다. 그 후, mRNA를 붕괴 중 하나 북부 얼룩 분석, 정량적 PCR 또는 RNAseq 모니터링합니다. 테를 사용하여 mRNA의 반감기의 측정RNA 중합 효소 II의 mperature 민감한 대립 유전자는 장점이있다. 첫째,이 기술은 곧장 앞으로 쉽고입니다. 둘째, 효모 균주는 mRNA의 반감기의 측정은 다른 성장 조건을 결정할 수있다 실험실에서 획득되거나 생성되면; mRNA의 붕괴에 대한 환경 영향의 결정을 가능하게한다. 셋째, mRNA의 붕괴 속도는 전체 게놈 모니터링 할 수있다. 다른 전사 억제 기술의 사용은 또한 장점과 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 유도 성 프로모터의 사용은 조절 된 프로모터의 제어하에 mRNA를 생성하기 위해 서브 클로닝이 필요하다. Thiolutin는 준비되지 않은 때 비싼 사용할 수 있습니다. 또한, 동작 모드의 thiolutin의 완전히 이해되지 않고,이 mRNA를 감쇠 7 억제를 포함하는 다른 세포 과정에 영향을 미치는 것으로보고되었다. 또한, 1,10- 페난 트롤 린은, 더 쉽게 사용할 수 있습니다. 또한, 모든 기술은 PERT 수 전사를 억제하기 위해 사용세포 기능을 URB 별개의 방식으로 서로 다른 mRNA에 영향을 미칠 수 있습니다. 조사원은 가장 신뢰할 수있는 결과를 달성하기 위해 자신의 실험 조건에서 사용하기에 가장 적절한 방법을 결정할 필요가있다. 자신의 애플리케이션에 가장 적합한 방법을 결정하기 위해, 연구원 조사되는 성적 증명서에 의해 코딩되는 단백질의 성적 증명서 및 함수를 식별 할 필요가있다. 가장 신뢰할 수있는 mRNA의 감쇠율 측정은 여러 기술들을 사용하여 동일한 감쇠율을 표시해서 결정들이다. 어떤 하나의 기술은 항상 가장없고, 가장 적당한 방법은 특정 상황에 따라 달라진다. S.에서 많은 연구 cerevisiae의 다양한 조건과 유전 적 배경에서 mRNA의 붕괴 속도를 측정했다. mRNA의 붕괴 속도가 측정되는 조건은 특정 실험 조사를 받고에 따라 달라집니다. 조건이 존재하는지 여부 다른 셀룰러 환경에서의 mRNA 붕괴 속도를 측정하는 것은 결정우선적으로 특정의 mRNA 붕괴 속도에 영향을 조사 하였다. 의 mRNA의 붕괴 속도는 사용되는 효모에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들면, mRNA의 붕괴 속도는 비 기능성 넌센스 매개 mRNA의 분해 (NMD) 통로와 야생형 효모 세포 및 효모 세포에서 결정될 수있다. 이 mRNA의 분해 경로는 지금까지 조사 된 모든 진핵 생물에서 발견되며, 이는 번역 8 조기 종료의 mRNA의 분해를 트리거한다. NMD는 초기에 조기 종료 코돈 또는 넌센스 코돈과의 mRNA를 분해 경로로 확인되었다,하지만 지금은 천연의 mRNA를 포함하는 비 넌센스의 발현을 조절하는 통로로 인식되고 있습니다. 경로의 대상이되는 mRNA를 빠르게 기능 NMD 경로와 효모 세포에서 분해 및 비 기능 NMD 경로와 효모 세포에서 안정화된다. 따라서,이 경로의 직접적인 대상인의 mRNA의 반감기는 야생형 효모에서 CEL 짧다비 기능 NMD 통로와 효모 세포에 비해 LS.

<table><tbody><tr><td>High Speed Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22628169</td><td></td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>Genescreen Plus membrane</td><td>PerkinElmer</td><td>50-905-0169</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>95-0030-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphor screen</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon phosphorimager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29004080</td><td></td></tr><tr><td>UV cross-linker</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>80-6222-31</td><td>Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80&amp;deg; for 1 hour</td></tr><tr><td>NorthernMax prehybridization/hybridization buffer&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM8677</td><td></td></tr><tr><td>Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation</td><td></td><td>Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of mrna decay rates in saccharomyces cerevisiae using rpb1-1 strains

mRNA의 정상 상태 수준은 환경 조건에 따라 달라집니다. mRNA를 정상 상태 축적 레벨의 규정은 단백질의 정확한 양이 특정 셀의 성장 조건에 대해 합성되는 것을 보장한다. mRNA의 붕괴 속도를 측정하기위한 한 가지 방법은 전사를 억제이어서 이미 존재하는 mRNA를 소실을 모니터링. mRNA의 붕괴 속도는 정량화 될 수 있으며, 정확한 반감기는 여러 기술을 이용하여 결정될 수있다. S.에서 cerevisiae의, 반감기가 개발 된 mRNA의 측정 및 RNA 중합 효소 II, rpb1-1의 온도에 민감한 대립 유전자 항구 균주를 사용하여 mRNA의 전사를 억제 포함 프로토콜을 지원합니다. 조절 성 프로모터의 제어하에 mRNA를을 이용하여 반감기는 대안 thiolutin 또는 1,10- 페난 트롤 린, 또는 전사와 전사 억제제를 포함 mRNA의 억제를 측정하기위한 다른 기술,이러한 갈락토스 유도 성 프로모터와 TET 오프 시스템으로. 여기서 우리는 S.의 측정을 설명 RNA 중합 효소 II의 온도에 민감한 대립 유전자를 사용하여 cerevisiae의 mRNA의 붕괴 속도. 이 기술은 개인의 mRNA 또는 게놈의 전체 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 사용될 수있다.

<html> RNA와 노던 블로 팅을 추출하면서 정확하게 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는이 프로토콜의 능력은 기술 된 RNase 자유로운 전사의 억제, 적절한 시점에서 효모 세포 수확, 및 이용에 따라 달라진다. 각각 불안정하고 안정적​​인 것으로 알려진 두 개의 제어의 mRNA에 대한 프로빙 실험을했다 확신을 제공합니다. 예를 들어, 이는 앤 mRNA를 미리 CYH2 모두를 검출 프로브로 프로빙함으로써 달성 ?...

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Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

특정의 mRNA의 정상 수준은 mRNA의 합성과 부패의 속도에 의해 결정된다. 전체 게놈 mRNA의 분해율 또는 특정의 mRNA 붕괴 속도는 mRNA의 반감기를 측정함으로써 측정 할 수있다. 이 프로토콜은 사카로 미세스 세 레비 시아에서 mRNA의 붕괴 속도의 측정에 초점을 맞추고있다.

mRNA의 붕괴 요금의 측정에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용&gt;<em&gt; rpb1-1</em&gt; 균주

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

measurement-mrna-decay-rates-saccharomyces-cerevisiae-using-rpb1-1

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Biology

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Unit 1

Translation: RNA to Protein

SCIENTISTS IN ACTION

12.5K 조회수.  Baylor University.  특정의 mRNA의 정상 수준은 mRNA의 합성과 부패의 속도에 의해 결정된다. 전체 게놈 mRNA의 분해율 또는 특정의 mRNA 붕괴 속도는 mRNA의 반감기를 측정함으로써 측정 할 수있다. 이 프로토콜은 사카로 미세스 세 레비 시아에서 mRNA의 붕괴 속도의 측정에 초점을 맞추고있다. 

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Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

효 모 S. cerevisiae Hypoxic 응답 하는 동안 시간이 지남에 mRNA 수준 측정

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

연구

유전학

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ours, have demonstrated that quiescence is associated with widespread changes in gene expression. Some of these changes occur through changes in the level or activity of proliferation-associated transcription factors, such as E2F and MYC. We have demonstrated that mRNA decay can also contribute to changes in gene expression between proliferating and quiescent cells. In this protocol, we describe the procedure for establishing proliferating and quiescent cultures of human dermal foreskin fibroblasts. We then describe the procedures for inhibiting new transcription in proliferating and quiescent cells with Actinomycin D (ActD). ActD treatment represents a straightforward and reproducible approach to dissociating new transcription from transcript decay. A disadvantage of ActD treatment is that the time course must be limited to a short time frame because ActD affects cell viability. Transcript levels are monitored over time to determine transcript decay rates. This procedure allows for the identification of genes and isoforms that exhibit differential decay in proliferating versus quiescent fibroblasts.

We describe a protocol for generating proliferating and quiescent primary human dermal fibroblasts, monitoring transcript decay rates, and identifying differentially decaying genes.

확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

생화학

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be bound by many different RBPs that will regulate its production, stability, activity, and degradation. As such, much has been done to understand the dynamics that exist between these two types of molecules. A particularly important breakthrough came with the emergence of &#8216;cross-linking and immunoprecipitation&#8217; (CLIP). This technique allowed stringent investigation into which RNAs are bound by a particular RBP. In short, the protein of interest is UV cross-linked to its RNA substrates in vivo, purified under highly stringent conditions, and then the RNAs covalently cross-linked to the protein are converted into cDNA libraries and sequenced. Since its conception, many derivative techniques have been developed in order to make CLIP amenable to particular fields of study. However, cross-linking using ultraviolet light is notoriously inefficient. This results in extended exposure times that make the temporal study of RBP-RNA interactions impossible. To overcome this issue, we recently designed and built much-improved UV irradiation and cell harvesting devices. Using these new tools, we developed a protocol for time-resolved analyses of RBP-RNA interactions in living cells at high temporal resolution: Kinetic CRoss-linking and Analysis of cDNAs (&#967;CRAC). We recently used this technique to study the role of yeast RBPs in nutrient stress adaptation. This manuscript provides a detailed overview of the &#967;CRAC method and presents recent results obtained with the Nrd1 RBP.

Kinetic cross-linking and analysis of cDNA is a method that allows investigation of the dynamics of protein-RNA interactions in living cells at high temporal resolution. Here the protocol is described in detail, including the growth of yeast cells, UV cross-linking, harvesting, protein purification, and next generation sequencing library preparation steps.

χCRAC를 사용하여 높은 시간 분해능에서 생체 내 단백질-RNA 상호 작용 역학 모니터링

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

특이적이고 효율적인 단백질 고갈을 달성하기 위한 튜닝 분해

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...

면역학 및 감염병학

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

생물학

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this yeast model is relevant to many organisms, including humans, since DNA repair and DNA damage response factors are well conserved across diverse species. However, S. cerevisiae has not yet been used to fully address whether the rate of accumulating mutations changes with increasing replicative (mitotic) age due to technical constraints. For instance, measurements of yeast replicative lifespan through micromanipulation involve very small populations of cells, which prohibit detection of rare mutations. Genetic methods to enrich for mother cells in populations by inducing death of daughter cells have been developed, but population sizes are still limited by the frequency with which random mutations that compromise the selection systems occur. The current protocol takes advantage of magnetic sorting of surface-labeled yeast mother cells to obtain large enough populations of aging mother cells to quantify rare mutations through phenotypic selections. Mutation rates, measured through fluctuation tests, and mutation frequencies are first established for young cells and used to predict the frequency of mutations in mother cells of various replicative ages. Mutation frequencies are then determined for sorted mother cells, and the age of the mother cells is determined using flow cytometry by staining with a fluorescent reagent that detects bud scars formed on their cell surfaces during cell division. Comparison of predicted mutation frequencies based on the number of cell divisions to the frequencies experimentally observed for mother cells of a given replicative age can then identify whether there are age-related changes in the rate of accumulating mutations. Variations of this basic protocol provide the means to investigate the influence of alterations in specific gene functions or specific environmental conditions on mutation accumulation to address mechanisms underlying genome instability during replicative aging.

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Mutation rates in young Saccharomyces cerevisiae cells measured through fluctuation tests are used to predict mutation frequencies for mother cells of different replicative ages. Magnetic sorting and flow cytometry are then used to measure actual mutation frequencies and age of mother cells to identify any deviations from predicted mutation frequencies.

어머니 세포 및 변동 시험의 자기 정렬을 결합에서 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성을 분석합니다<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be assessed by alkaline hydrolysis and gel electrophoresis as RNA is highly susceptible to hydrolysis in alkaline conditions. This, in combination with Southern blot analysis can be used to determine the location and strand into which the ribonucleotides have been incorporated. However, this procedure is only semi-quantitative and may not be sensitive enough to detect small changes in ribonucleotide content, although strand-specific Southern blot probing improves the sensitivity. As a measure of one of the most striking biological consequences of ribonucleotides in DNA, spontaneous mutagenesis can be analyzed using a forward mutation assay. Using appropriate reporter genes, rare mutations that results in the loss of function can be selected and overall and specific mutation rates can be measured by combining data from fluctuation experiments with DNA sequencing of the reporter gene. The fluctuation assay is applicable to examine a wide variety of mutagenic processes in specific genetic background or growth conditions.

Ribonucleotides are among the most abundant non-canonical nucleotides incorporated into the genome during eukaryotic nuclear DNA replication. If not properly removed, ribonucleotides can cause DNA damage and mutagenesis. Here, we present two experimental approaches that are used to assess the abundance of ribonucleotide incorporation into DNA and its mutagenic effects.

Ribonucleotides 효 모 게놈에 Ribonucleotide 유도 된 Mutagenesis 측정의 공부 Ribonucleotide 법인: 물가 관련 검색

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

mRNA의 붕괴 요금의 측정에

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