Vivo에서 Microdialysis 메서드를 잘라 높은 분자 무게와 뇌 간 질 성 액체에서 큰 Extracellular 단백질을 수집 조사

이 방법은 신호 전달 기질 수송 및 폐적 간격이 뇌 세포 외 공간에서 발생하는 방법에 대한 신경 과학 연구 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 잠에서 자유롭게 움직이는 동물의 세포 간 유체 또는 ISF에서 큰 세포외 분자의 샘플링 및 정량화를 허용한다는 것입니다. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 마취 마우스의 두개골에서 머리를 제거하고 어댑터에 고정 동물을 안전하게 귀 막대와 코 클램프를 사용합니다.

동물의 눈에 연고를 바르고 어댑터를 스테레오탁스 장치에 놓습니다. 메스를 사용하여 두개골 위에 피부 절개를 적시하고 스테레오탁스 프레임의 조작체에 드릴을 부착합니다. 드릴이 람다에 부드럽게 닿을 때까지 드릴을 낮추고 드릴의 DV 좌표를 0으로 재설정합니다.

그런 다음 AP 및 ML 좌표를 0으로 재설정하기 위해 드릴을 bregma로 이동합니다. 드릴을 bregma에서 수직 좌표로 이동합니다. 드릴을 두개골로 낮추고 DV 좌표를 다시 0으로 설정합니다.

세 번째 좌표에 대한 절차를 반복한 후, 대상 좌표에서 버 구멍을 조심스럽게 뚫고 정수리 뼈의 모순된 면에 두 번째 구멍이 들어오게 됩니다. 두 번째 구멍에 뼈 나사를 삽입하고 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브 뚜껑에서 잠그는 조각을 두개골에 배치하여 버 구멍이 원 내에 있도록합니다. 다음으로, 스테레오탁스 어댑터의 짧은 팔에 가이드 캐뉼라를 놓고 캡 너트로 캐뉼라를 고정시하십시오.

전극 클램프에 스테레오탁스 어댑터의 긴 팔을 설정하고 스테레오탁스 장치의 조작기에 팔을 부착한다. 조작기 암의 DV 스테레오탁스 어셈블리를 12도 회전하고 가이드 캐뉼라를 버 구멍으로 옮습니다. 그런 다음 가이드 캐뉼라를 뇌로 1.2 밀리미터 천천히 낮춥춥니까.

가이드 캐뉼라의 금속 부분, 뼈 나사 및 노출된 두개골이 덮여 고정되어 시멘트가 건조할 때까지 크라운에 치과 시멘트를 추가합니다. 12-20분 후 전극 클램프에서 스테레오탁틱 어댑터를 제거하고 캡 너트를 제거하고 스테레오탁어댑터를 더미 프로브로 교체합니다. 그런 다음 캡 너트를 재포장하고, 스테레오탁스 장치에서 마우스를 방출하고, 개별 케이지에 마우스를 단독으로 보관한다.

미세 투석을 설정하기 전에 일회용 1 밀리리터 주사기를 증류수로 채우고 바이톤 튜브를 사용하여 주사기를 미세 투석 프로브의 콘센트에 연결합니다. 통풍구 구멍을 수동으로 덮고 주사기 플런저를 부드럽게 우울하여 프로브에 물을 주입합니다. 물이 프로브 입구에 나타나고 미세 투석 막의 표면에 누출이 있는지 확인합니다.

프로브를 활성화하려면 프로브 멤브레인을 70-100%에 2초 동안 담근 다음 두 번째 증류수 주입을 합니다. 하나의 입구와 하나의 콘센트 라인에 연결 바늘을 연결하고 갓 준비 관류 버퍼와 일회용 3 밀리리터 주사기를로드합니다. 무딘 엔드 바늘이 장착된 주사기를 튜브의 입구 끝에 연결하고 주사기 펌프를 사용하여 관류 버퍼로 튜브 전체를 채웁니다.

튜브가 가득 차면 입구와 콘센트 라인 사이의 연결 바늘을 활성 미세 투석 프로브와 캡 너트로 교체하고 롤러 펌프의 출구 튜브에 롤러 튜브를 장착하십시오. 분당 10 마이크로리터에서 주사기 펌프를 시작하고 롤러 펌프는 분당 9.5-9.8 마이크로리터로 시작합니다. 이제 마취 가이드 캐뉼라 이식 동물의 목에 칼라를 놓고 캡 너트와 더미 프로브를 제거합니다.

가이드 캐뉼러를 통해 미세 투석 프로브를 천천히 삽입하고 캡 너트를 고정시하십시오. 그런 다음 마우스를 자유 이동 시스템에 연결된 케이지에 넣고 마우스를 칼라로 묶습니다. 적어도 1시간 후, 롤러 펌프와 주사기 펌프를 순차적으로 멈추고, 주사기 펌프로 펌프를 재시동하여 롤러 펌프보다 20% 더 빠르게 설정하고, 냉장 된 분획 수집기에 콘센트 튜브의 자유 끝을 배치하여 뇌 ISF를 수집합니다.

적절한 실험 적 부피가 획득되면 프로브를 제거하고 방금 입증 된 대로 마우스 복구를 처리하십시오. 이전 관측과 일치하여, 50 마이크로몰러 피크로톡신이 깨어 있는 C57B6J 마우스에서 입증된 바와 같이 역미세투석을 통해 투여될 때, 차량 제어로 처리된 동물에서 측정된 수준에 비해 간질 내인성 타우 레벨의 증가가 관찰된다. 약물 투여 이외에, 마이크로 투석은 신경 활동이 ISF에 있는 기판 농도에 어떻게 영향을 미치는지에 관하여 추가 질문에 대답하기 위하여 EEG 기록 또는 광유전학 같이 그밖 생체 내 방법과 결합될 수 있습니다.