生体内で高分子量カットオフと間質液を脳から大規模な細胞外タンパク質を収集するマイクロダイアリシス法プローブします。

この方法は、脳内細胞外空間におけるシグナル伝達基質輸送と廃棄物クリアランスの発生に関する神経科学研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、自由に動く動物を目覚めさせる間質流体またはISFにおける大きな細胞外分子のサンプリングと定量を可能にすることです。つま先ピンチへの応答の欠如を確認した後、麻酔マウスの頭蓋骨から髪を取り除き、耳の棒と鼻クランプを使用して、アダプタに固定動物をしっかりとします。

動物の目に軟膏を塗布し、ステレオタックス装置にアダプターを置きます。メスを使用して頭蓋骨の上に皮膚切開を矢状にし、立体フレームのマニピュレータにドリルを取り付けます。ラムダにそっと触れるまでドリルを下げ、ドリルのDV座標をゼロにリセットします。

次に、ドリルをブレグマに移動して、AP座標とML座標をゼロにリセットします。ドリルをブレグマから垂直座標に移動します。ドリルを頭蓋骨に下げ、DV 座標をもう一度ゼロに設定します。

3番目の座標の手順を繰り返した後、ターゲット座標でバリ穴を慎重に掘削し、続いて頭頂骨の反対側に2番目の穴を開けます。2番目の穴に骨ネジを挿入し、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブの蓋からロックピースを頭蓋骨に置き、バリ穴が円の中に入るようにします。次に、ステレオタキシックアダプターの短いアームにガイドカニューレを置き、キャップナットでカニューレを締めます。

ステレオタックスアダプターの長いアームを電極クランプにセットし、ステレオタックス装置のマニピュレータにアームを取り付けます。マニピュレータアームの DV ステレオタックス アセンブリを 12 度回転させ、ガイド カニューレをバリ穴に移動します。その後、ゆっくりと脳にガイドカニューレ1.2ミリメートルを下げます。

ガイドカニューレの金属部分、骨ねじ、露出した頭蓋骨が覆われ、固定され、セメントが乾燥するまで、王冠に歯科用セメントを追加します。12~20分後、電極クランプからステレオタックスアダプタを取り外し、キャップナットを取り外し、ステレオアクティックアダプタをダミープローブに交換します。次に、キャップナットを再ファスンし、ステレオタキシック装置からマウスを離し、マウスを個別のケージに単独で収容します。

マイクロ透析を設定する前に、使い捨ての1ミリリットルのシリンジに蒸留水を充填し、ビトンチューブを使用して注射器をマイクロ透析プローブの出口に接続します。手動で通気孔をカバーし、静かに水でプローブを注入するために注射器プランジャーを押し下げます。プローブの入口に水が入り口に現れ、マイクロ透析膜の表面に漏れがあることを確認します。

プローブを活性化するには、プローブ膜を70〜100%エタノールに2秒間沈め、続いて2回目の蒸留水注入を行う。1つの入口および1つの出口線に接続針を取り付け、準備したての灌流バッファーで使い捨て3ミリリットルシリンジをロードします。鈍い端の針を装備したシリンジをチューブの入口端に接続し、注射器ポンプを使用してチューブ全体を灌流バッファーで満たします。

チューブがいっぱいになったら、入口と出口線の間の接続針を、活性化されたマイクロ透析プローブとキャップナットに交換し、ローラーポンプの出口管にローラーチューブを取り付けます。シリンジポンプは毎分10マイクロリットル、ローラーポンプは毎分9.5~9.8マイクロリットルで始動します。今度は麻酔付きガイドカニューレ埋め込まれた動物の首の周りに襟を置き、キャップナットとダミープローブを取り外します。

ガイドカニューレを通してマイクロ透析プローブをゆっくりと挿入し、キャップナットを留めします。次に、マウスを自由に動かすシステムに接続されたケージに入れ、マウスを首輪につなぎます。少なくとも1時間後、ローラーポンプとシリンジポンプを順次停止し、シリンジポンプをローラーポンプよりも20%速く設定してポンプを再起動し、冷蔵分画コレクタに出口管の自由端を置いて脳ISFを収集する。

適切な実験ボリュームが得られたら、プローブを取り外し、実例通りマウスの回復を処理します。以前の観察と一致して、50ミクロモルピクロトキシンがC57B6Jマウスの覚醒に示されるように逆ミクロジアルを介して投与される場合、間質内在性タウレベルの増加は、車両制御で処理された動物で測定されたレベルと比較して観察される。薬物投与に加えて、脳透析は、脳神経活動がISFの基質濃度にどのように影響するかについての追加の質問に答えるために、脳脳細胞記録または光遺伝学のような他のin vivo方法と組み合わせることができます。