이 작품은 PTR에 건강의 국가 학회 (R01-NS084941)와 애리조나 생물 의학 연구 위원회 (ADHS16-162406)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. WA는 과거의 국가 연구소의 건강 교육 부여 (T32-HL007249)을 미리 박사 약속에서 지원 받았다.

아래에 설명 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다와 국립 보건원 (NIH) 및 동물 연구: Vivo에서 실험 (도착) 지침을 보고. 프로토콜에 대 한 절차 흐름은 그림 1에 묘사 된다.
1입니다. 설정 절차에 대 한
<ol><li>뇌 microvessel 버퍼 (BMB)를 준비 합니다. 54.66 g D-마 니 톨, 1.90 g EGTA, 깨끗 한 비 커에 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (즉, 트리 스) 자료를 재 시작 합니다. 이온된 수의 1.0 L를 추가 합니다. 자력 교 반기를 사용 하 여 BMB 버퍼의 구성 요소를 믹스. 일단 솔루션을 철저 하 게 혼합 되어, pH 7.4 1.0 M HCl을 사용 하 여를 조정 합니다.</li>
	<li>동물을 마비 전에 26 %dextran (MW 75000) 솔루션 (w/v)을 준비 합니다. 다음 단계에 설명 된 대로 dextran 솔루션을 준비 합니다. 참고: 그것은 비판적으로 dextran 약 1.5-2 h 수성 버퍼에 분해를 걸릴 수 있기 때문에 미리이 솔루션을 준비 하는 것이 중요.<ol>
<li>깨끗 한 비 커에 가루 dextran (26 g 버퍼 100 mL 당) 밖으로 무게.</li>
		<li>BMB의 적절 한 양을 밖으로 측정 하 고, 깨끗 한 별도 비 커에 분배.</li>
		<li>천천히 BMB 붓고 가루 dextran을 포함 하는 비 커. 수동으로 BMB 유리 저 어 막대를 사용 하 여의 붓는 동안 가루 dextran을 믹스.</li>
		<li>사용 하 여 즉시 사전 1.0 M HCl와 7.4에 pH를 조정 합니다. 참고: 12 개별 Sprague-Dawley 쥐에서 뇌 microvessels의 일반적인 격리 (남성 또는 여성; 나이의 3 개월, 200-250 g) dextran 솔루션 (즉, 52 g dextran BMB의 200 ml에서) 200 mL를 필요 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Sprague-Dawley 쥐에서 뇌 조직 추출
<ol><li>케 타 민 (50 mg/kg, 2.5 mL/kg i.p.) 및 xylazine를 사용 하 여 Sprague-Dawley 쥐 anesthetize 다음과 같은 원하는 실험 치료 (10mg/mL; 2.5 mL/kg 나, p.). 마 취 제와 최종 농도 20 mg/mL 및 4.0 mg/mL의 0.9% 염 분에서 xylazine을 각각 희석. 잘린 IACUC 지침에 따라 날카롭게 단두대를 사용 하 여 동물을 안락사. 동일한 절차를 사용 하 여 둘 다 남성과 여성 Sprague-Dawley 쥐를 위해.</li>
	<li>수술가 위를 사용 하 여 단일 가로 컷 하 여 쥐 두개골에서 피부를 resect.</li>
	<li>Rongeurs를 사용 하 여 신중 하 게 두개골 플레이트를 제거 하 고 뇌를 노출.</li>
	<li>주걱을 사용 하 여 뇌를 제거 합니다. 뇌를 분리 고 격리 된 뇌 조직 50 mL 원뿔 튜브 BMB의 5 mL를 포함 합니다. 프로 테아 제 억제 물 사용 전에 즉시 BMB 버퍼의 1.0 mL 당 칵테일의 1.0 μ를 추가 합니다.</li>
</ol>3. 두뇌 처리
<ol><li>50 mL 원뿔 튜브의 뇌 조직 깨끗 한 페 트리 접시에 전송.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 부드럽게 롤 두뇌에 대뇌 피 질에 느슨하게 준수 외부 meninges 제거 하 12.5 cm 직경 필터 종이. 부드럽게 필터 종이 대 한 뇌 조직의 누르고 다시 조직 롤. 이 단계 동안 자주 필터 종이 켜십시오.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 대뇌 반구에서 맥락 막 신경 총을 구분 합니다. 참고: 맥락 막 신경 총 대뇌 뇌 실의 표면에 지역화 된 맑은 액체로 조직으로 나타납니다.</li>
	<li>부드럽게 뇌 조직의 평평 하 고 나머지 meninges과 후 각 전구 집게를 사용 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>장소 냉장된 유리 박격포로 대뇌 피 질의 뇌 조직. 박격포를 BMB 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 5.0 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>오버 헤드 전원 균질 화기를 사용 하 여, 3700 rpm에 선 위아래로 15를 사용 하 여 뇌 조직의 균질. 균질 10 mL 박격포와 유 봉 조직 분쇄기를 사용 하 여 수행 합니다. 각 개별 샘플의 균질, 사이 유 봉 70% 에탄올을 사용 하 여 청소. 참고: 균질 선 속도 관점에서 일관 되 고 크기.</li>
	<li>레이블이 지정 된 원심 분리기 튜브에는 homogenate를 부 어.</li>
</ol>4. 원심 분리 단계
<ol><li>뇌 homogenate 포함 된 각 레이블이 원심 분리기 튜브를 26 %dextran 솔루션 8.0 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>튜브를 두 번 반전 그리고 철저 하 게 소용돌이 샘플. 뇌 26 %dextran 솔루션 homogenate 솔루션의 철저 하 게 혼합 되도록 여러 각도 사용 하 여 각 샘플의 vortexing를 실시 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 5000 x g 에서 원심 분리기 샘플 참고: 일부 분석에 대 한 그것은 뇌 microvessels 뇌 실질과 비교 하는 데 유용입니다. 뇌 실질에 단백질 식의 평가 해야 필요한이 원심 분리 단계 (즉, 뇌 parenchymal 분수)에서 상쾌한 수집 고 나중에 사용-80 ° C에 저장.</li>
	<li>진공 흡 인기를 사용 하 여 상쾌한을 제거 하 고 유리 파스퇴르 피 펫. 참고: 주의 펠 렛을 방해 하지로 이동 해야 합니다. 그렇지 않으면, 뇌 microvessels 수집의 수량이 줄어들 것입니다는이 절차에서 단백질 수확량 크게 줄어.</li>
	<li>BMB 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (즉, 1.0 μ 프로 테아 제 억제 물 칵테일 BMB 버퍼의 1.0 mL 당)의 5.0 mL에 펠 릿을 resuspend. 철저 하 게 혼합 되도록 펠 릿 소용돌이입니다.</li>
	<li>각 원심 분리기 튜브와 소용돌이 4.1-4.2이이 프로토콜의 단계에서 설명한 대로 26 %dextran 8.0 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 5000 x g 에서 원심 분리기 샘플</li>
	<li>진공 플라스 크, 유리 피 펫을 사용 하, 상쾌한 발음 하 고 뇌 microvessel를 포함 하는 펠 릿 방해 하지 확인 하십시오. 참고: 초과 소재 튜브 벽에 고착 했다 microvessels를 포함 하지 않는 해야 될 신중 하 게 청소 하 고 제거.</li>
	<li>두 번 추가는 4.8-4.5 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>일단 4 dextran 원심 분리 단계 완료 되었습니다, 그리고 각 펠 릿 및 resuspend 샘플을 소용돌이 BMB의 5.0 mL를 추가 합니다. 참고: 다음 단계 4.10의 완료, 전체 microvessels 단백질 지 방화의 분석에 대 한 수집할 수 있습니다. 이 여 50 μ 다시 중단된 microvessel 펠 릿의 aliquot 유리 현미경 슬라이드에 번짐 수행할 수 있습니다. Microvessels는 뒤에 얼음 처럼 차가운 에탄올에 고정 추가 10 분 슬라이드 이미징 연구에 필요한 때까지 4 ° C에 저장 된 다음 수 열 블록에 10 분 동안 95 ° C에서 열 고정.</li>
</ol>5. Ultracentrifugation 총 뇌 Microvascular 막의 샘플을 준비 하
<ol><li>냉장된 유리 균질 화기에 샘플을 전송.</li>
	<li>오버 헤드 전원 균질 화기를 사용 하 여 3000 rpm에서 선 위아래로 8-10을 사용 하 여 뇌 조직의 균질. 균질 10 mL 박격포와 유 봉 조직 분쇄기를 사용 하 여 수행 됩니다. 유 봉 각 개별 샘플의 균질에 따라 70% 에탄올을 사용 하 여 청소.</li>
	<li>Ultracentrifuge 튜브를 청소 하는 샘플을 전송 합니다. 번호와 각 개별 튜브 무게. 균형 그리고 ultracentrifuge로 터에 로드 하기 전에 튜브 쌍. 참고: 모든 무게와 ultracentrifuge 튜브의 해야 합니다 실시는 모자에 튜브 무게의 정확한 측정을 보장 하기 위해.</li>
	<li>4 ° c.에서 1 h 150000 x g 에서 원심 분리기 샘플</li>
	<li>상쾌한 발음 진공 플라스 크, 유리 피 펫 파스퇴르를 사용 하 여 모 세관 멤브레인 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 사용 하 여.</li>
	<li>펠 릿 크기에 따라 달라 집니다, 1:1 (v/v) 비율로 이온된 수와 BMB의 구성 된 저장소 버퍼의 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 일반적으로 펠 릿 저장 버퍼의 400-500 μ에 resuspended 있다. 프로 테아 제 억제 물 칵테일 저장소 버퍼의 1.0 mL 당 1.0 μ의 비율에서 저장소 버퍼에 추가 합니다.</li>
	<li>펠 릿 저장 버퍼에 resuspend를 소용돌이 샘플.</li>
	<li>Using 유리 파스퇴르 피 펫, 레이블이 1.5 mL microcentrifuge 관에 모 세관 막 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>바늘을 통해 패스 샘플 샘플은 철저 하 게 혼합 하 고 아무 셀룰러 집계 존재 5 x 주사기.</li>
	<li>-80 ° c까지 분석에 필요한 샘플을 저장 합니다. 참고: 각 microvessel 막 샘플의 단백질 콘텐츠 브래드포드 메서드를 사용 하 여 측정 됩니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals.">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).</li><li>Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Transporters+in+Central+Nervous+System+Drug+Delivery+and+Blood-Brain+Barrier+Protection:+Relevance+to+Treatment+of+Stroke.">Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke.</a> J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).</li><li>Ronaldson, P. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+transporters:+promoting+blood-brain+barrier+repair+in+response+to+oxidative+stress+injury.">Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury.</a> Brain Res. 1623, 39-52 (2015).</li><li>Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hypoxia-reoxygenation+on+rat+blood-brain+barrier+permeability+and+tight+junctional+protein+expression.">Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).</li><li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+oligomeric+assemblies+at+tight+junctions+of+the+blood-brain+barrier+are+altered+by+hypoxia+and+reoxygenation+stress.">Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress.</a> J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).</li><li>Lochhead, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+increases+blood-brain+barrier+permeability+and+induces+alterations+in+occludin+during+hypoxia-reoxygenation.">Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).</li><li>Lucke-Wold, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bryostatin-1+Restores+Blood+Brain+Barrier+Integrity+following+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury.">Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).</li><li>Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+inhibition+prevents+inflammatory+pain+induced+changes+in+the+blood-brain+barrier.">Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier.</a> Brain Res. , 6-13 (2008).</li><li>Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta+signaling+alters+substrate+permeability+and+tight+junction+protein+expression+at+the+blood-brain+barrier+during+inflammatory+pain.">Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).</li><li>Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+inflammatory+hyperalgesia+modulates+morphine+delivery+to+the+brain:+a+role+for+P-glycoprotein.">Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein.</a> J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).</li><li>Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+pain+signals+an+increase+in+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier.">Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier.</a> J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).</li><li>Pop, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+brain+injury+alters+the+blood-brain+barrier+phenotype+in+parallel+with+beta-amyloid+and+cognitive+changes+in+adulthood.">Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).</li><li>Thompson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+stress+signals+an+increase+in+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+(Oatp1a4)+at+the+blood-brain+barrier:+relevance+to+CNS+drug+delivery.">Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).</li><li>Tome, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-glycoprotein+traffics+from+the+nucleus+to+the+plasma+membrane+in+rat+brain+endothelium+during+inflammatory+pain.">P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).</li><li>Slosky, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetaminophen+modulates+P-glycoprotein+functional+expression+at+the+blood-brain+barrier+by+a+constitutive+androstane+receptor-dependent+mechanism.">Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism.</a> Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).</li><li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt/planar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells.">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+exposure+to+ethanol+downregulates+tight+junction+proteins+through+the+protein+kinase+Calpha+signaling+pathway+in+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells.">Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells.</a> Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).</li><li>Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+morphogenetic+protein-9+increases+the+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier+via+the+activin+receptor-like+kinase-1+receptor.">Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).</li><li>Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+1-Phosphate+Increases+P-Glycoprotein+Transport+Activity+at+the+Blood-Brain+Barrier+via+Prostaglandin+E2+Signaling.">Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling.</a> Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).</li><li>Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexose+transport+and+phosphorylation+by+capillaries+isolated+from+rat+brain.">Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain.</a> Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).</li><li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy.">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).</li><li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junctions+contain+oligomeric+protein+assembly+critical+for+maintaining+blood-brain+barrier+integrity+in+vivo.">Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo.</a> J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).</li><li>Brzica, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+and+kidney+expression+of+sulfate+anion+transporter+sat-1+in+rats+exhibits+male-dominant+gender+differences.">The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).</li><li>Ronaldson, P. T., Bendayan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+viral+envelope+glycoprotein+gp120+produces+oxidative+stress+and+regulates+the+functional+expression+of+multidrug+resistance+protein-1+(Mrp1)+in+glial+cells.">HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells.</a> J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).</li><li>Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+C-type+lectins-mediated+host-pathogen+interactions+with+dextran.">Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran.</a> J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).</li><li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier.">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li><li>Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Expression+of+P-glycoprotein+and+Organic+Anion+Transporting+Polypeptides+at+the+Blood-Brain+Barrier:+Understanding+Transport+Mechanisms+for+Improved+CNS+Drug+Delivery?.">Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?.</a> AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 문서에서는 갓 쥐 뇌 조직에서 분리 된 microvessels에서 막 단백질 샘플 준비의 간단 하 고 효과적인 방법을 설명 합니다. 격리 된 microvasculature에서 쥐 뇌 microvessels의 격리 및 막 준비의 세대에 대 한 몇 가지 방법은 문학13,20,,2122 에 보고 되었습니다. , 24.이 이렇게 하나의 실...

혈액-뇌 장벽 (BBB) 중앙 신경 시스템 (CNS)와 조직의 순환 간의 인터페이스에 존재 하 고 뇌 항상성 유지에 중요 한 역할. 구체적으로, 정확 하 게 제어 용 질 농도에 효율적으로 뇌 조직 CNS1의 상당한 변화 요구를 충족 하는 데 필요한는 그 영양분을 공급 하 고 뇌 세포 외 액에는 BBB 기능. 이러한 역할 의미 microvascular 내 피 세포의 수준에 있는 BBB 잠재적으로 유해한 xenobiotics 수 없습니다 하면서 뇌 실질에 액세스 하는 일부 물질을 사용할 수 있는 개별 메커니즘을가지고 있어야 합니다. 축적. 사실, microvascular 내 피 세포 fenestrated 하지 않습니다 하 고 비 선택적인 침투성2의 부족을 보장 제한 pinocytosis 전시. 또한, microvessel 내 피 세포 꽉 접점과 외화 접합 단백질 형태로 실제 인접 한 내 피 세포 사이의 "봉인"과 뇌에 혈액을 매개로 물질의 paracellular 확산을 크게 제한 하는 표현 실질입니다. 사실, 내 인 성 및 외 인 성 물질의 선택적인 침투성의 통풍 관 및 경과 전송기3기능 식이 필요합니다. 전반적으로, 단단한 접속점, 외화 교차점, 및 전송기는 BBB의 독특한 장벽 속성을 유지 하기 위해 콘서트에서 작동.
BBB는 생리 적, 병 태 생리, 약리 자극에 응답 하는 동적 장벽이 다. 예를 들어 산소/reoxygenation 스트레스는 혈관 마커 등을 증가 paracellular 침투성와 관련 중요 한 꽉 접합 단백질 (즉, occludin, zonulae occluden-1 (조로-1))의 식을 조절 하 보였다 자당4,,56으로. 외상 성 뇌 부상7 설정 주변 염증 성 통증8,9에서 BBB에서 비슷한 관찰 되었습니다. 이 같은 질병 또한 BBB10,,1112,13,14에서 전송 메커니즘을 조절 수 있습니다. 실제로, 저 산소 증/reoxygenation 부상 향상 polypeptide 1a4 수송 유기 음이온의 기능 식 (Oatp1a4)에서 BBB,으로 이어질 수 있는 특정 Oatp 전송 기판의 혈액-뇌 전송에 상당한 증가 같은 taurocholate 및 틴이13. BBB 속성 pharmacotherapy 자체, 뇌에 약물 효과에 모두 깊은 변화 및 약물-약물 상호 작용에 대 한 기초를 형성 수 있습니다 메커니즘에 의해 변경할 수 있습니다. 예를 들어 뇌 microvascular 내 피 세포에 아 세트 아미노 펜 대상 핵 수용 체 신호 메커니즘 기능 표현의 중요 한 경과 전송 P-당단백질 (P-gp), 증가 하 고 수정 하는 시간에 따른 진통 모 르 핀에 의해 수 여 된 opioid 진통제 약물 설립된 P-gp 수송 기판15. BBB 변화, 질병 또는 약물에 의해 유도 될 수 있다, 그의 철저 한 이해는 또한 식별 및 이러한 수정을 제어 하는 특정 규제 메커니즘의 필요 합니다. 사실, 이산 신호 경로 꽉 접합 단백질16,17 및 전송기15, 의 분자 표현 제어 하는 두뇌 microvascular 내 피 세포에서 발견 되었습니다 18,19. 함께 찍은, 이러한 관측 복잡 한 분자 경로 BBB 꽉 접합의 규제와 건강 및 질병에 전송기에 관련 된 나타냅니다.
BBB의 연구에 중요 한 도전 막 샘플의 후속 준비 및 실험 동물에서 파생 된 뇌 조직에서 microvessels의 격리에 대 한 간단 하 고 효과적인 방법의 절대적인 요구 사항입니다. 이 샘플은 모두 뇌 microvascular 내 피 세포에 농축 하 고 다른 세포 유형의 존재에 제한 준비 되어야 한다. 지난 몇 년 동안 설치류 두뇌에서 microvasculature의 격리에 대 한 여러 방법론 과학 문학13,20,,2122에 보고 되었습니다. 이 문서에서는 간단 하 고, 강력한, 및 쥐 두뇌에서 microvessels의 격리 및 단백질 발현의 분석에 사용할 수 있는 내 피 막 농축 샘플의 준비에 대 한 재현 방법. 이 microvessel 격리 프로토콜의 한 장점은 개별 실험 동물에서 충분 한 단백질 수율과 높은 품질의 샘플 준비를 얻을 수 있습니다. 단백질 표정에 간 동물 다양성의 고려 수 있습니다. BBB에서 단백질 변경의 진정한 크기의 과대평가 (또는-추정) 수 이제 피할 수 있기 때문에이 프로토콜에는 이러한 사전은 크게 BBB 연구의 견고성을 향상. 또한, 여러 원심 분리 단계 dextran 포함 뉴런 등 원치 않는 세포 성분의 제거를 촉진 하는 동안 실험 샘플에서 microvessels의 향상 된 농축 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8340</td>
			<td>Component of brain microvessel buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#M4125</td>
			<td>Component of brain microvessel buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#E3889</td>
			<td>Component of brain microvessel buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T1503</td>
			<td>Component of brain microvessel buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran (MW 75,000)</td>
			<td>Spectrum Chemical Mftg Corp</td>
			<td>#DE125</td>
			<td>Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetamine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>#501072</td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Western Medical Supply</td>
			<td>#5530</td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% saline solution</td>
			<td>Western Medical Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td>General anesthetic diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper (12.5 cm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#28320-100</td>
			<td>Used for removal of meninges from brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>#60.540.386</td>
			<td>Disposable tubes used for dextran centrifugation steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; Coomassie Plus (Bradford) Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#23236</td>
			<td>Measurement of protein concentration in membrane preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Overhead Power Homogenizer</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>#903475</td>
			<td>Required for homogenization of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>#358039</td>
			<td>Required for homogenization of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#H1758</td>
			<td>Required for pH adjustment of buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td>Protein standard for Bradford Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#91100-12</td>
			<td>Used for dissection of brain tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#16020-14</td>
			<td>Used for opening skull to isolate brain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#352070</td>
			<td>Used for collection of brain tissue following isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#13-678-20C</td>
			<td>Used for aspiration of cellular debris following dextran spins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#459836</td>
			<td>Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>#41121703</td>
			<td>Used for ultracentrifugation of samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels

혈액-뇌 장벽 (BBB)은 다양 한 병 태 생리 및 약리 자극에 응답 하는 동적 장벽 조직. 이러한 자극 으로부터 발생 하는 이러한 변경 고 수 있습니다 크게 뇌에 약물 전달 조절, 확장 하 여, 질병의 원인이 상당한 도전 중앙 신경 치료에서 (CNS). Pharmacotherapy에 영향을 주는 많은 BBB 변화를는 지역화 된 내 피 세포의 수준에서 단백질을 포함 한다. 실제로, 건강 및 질병에 BBB 생리학에 이러한 지식은이 막 단백질의 연구에 상당한 관심을 촉발 했다. 기초 과학 연구의 관점에서이 실험 동물에서 수확 하는 뇌 조직에서 microvessels의 격리에 대 한 간단 하지만 강력 하 고 재현할 수 방법에 대 한 요구를 의미 합니다. 갓 격리 된 microvessels에서 막 샘플을 준비 하기 위하여 샘플 준비 내 피 세포에 농축 되어야 하지만 다른 세포 유형 (즉, 이다, microglia, 신경, 혈관 단위의 존재 제한 필수적 이다 pericytes)입니다. 추가 혜택 개별 동물에서 실험적인 인구에서 단백질 식의 진정한 변화를 캡처하기 위해 샘플을 준비 하는 기능입니다. 이 원고에서 쥐 뇌 microvessels의 고립과 막 샘플의 준비에 대 한 활용 방법에 관한 세부 정보는 제공 됩니다. Microvessel 농축, 파생, 샘플에서 dextran 샘플 버퍼에 포함 된 4 개의 원심 분리 단계를 사용 하 여 이루어집니다. 이 프로토콜은 그들의 자신의 특정 응용 프로그램에 대 한 다른 실험실에 의해 쉽게 적응 수 있습니다. 이 프로토콜에서 생성 된 샘플 크게 생리 적, 병 태 생리, 약리 자극 응답 BBB의 이해를 원조 할 수 있는 단백질 분석 실험에서 강력한 실험 데이터를 얻을를 보였다.

쥐 뇌 microvessels의 격리 및 microvessel 막 샘플의 준비에 대 한 실험 흐름은 그림 1에 표시 됩니다. 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 쥐 두뇌에서 그대로 microvessels의 성공적인 절연 설명 된다 (그림 2A). 이러한 혈관 원심 dextran와 ultracentrifugation 막 샘플 (즉, 다음 준공 단계 4.10) 준비를 개시 직전의 완료 후 얻은 했다. 이 이미지는 m...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels at JoVE.com

A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

여기, 쥐 뇌 microvessels의 격리에 대 한 고 막 샘플의 준비에 대 한 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 허용 단백질와 개별 동물에서 항복 하는 풍부한 microvessel 생산의 명확한 장점이 있습니다. 샘플은 다음 뇌 microvascular 내 피에 강력한 단백질 분석에 사용할 수 있습니다.

신선 하 게 고립 된 쥐 두뇌 Microvessels에서 막 샘플을 준비 하는 간단 하 고 재현할 수 방법

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic barrier tissue that responds to various pathophysiological and pharmacological stimuli. Such changes resulting ...

a-simple-reproducible-method-to-prepare-membrane-samples-from-freshly

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K 조회수.  University of Arizona, Tucson. 여기, 쥐 뇌 microvessels의 격리에 대 한 고 막 샘플의 준비에 대 한 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 허용 단백질와 개별 동물에서 항복 하는 풍부한 microvessel 생산의 명확한 장점이 있습니다. 샘플은 다음 뇌 microvascular 내 피에 강력한 단백질 분석에 사용할 수 있습니다.

비디오: A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended upon this work to develop a simple quantitative measure of forepaw dexterity that is sensitive to lateralized impairments and age-dependent changes. Rodents learn skillful forepaw and digit movements to manage thin pasta pieces, which they eagerly consume. We have previously described methods for quantifying vermicelli handling in rats and showed that the measures are very sensitive to forelimb impairments resulting from unilateral ischemic lesions, middle cerebral artery occlusions and unilateral striatal dopamine depletion [Allred, R.P., Adkins, D.L., Woodlee, M.T., Husbands, L.C., Maldonado M.A., Kane, J.R., Schallert, T. &amp; Jones, T.A. The Vermicelli Handling Test: a simple quantitative measure of dexterous forepaw function in rats. J. Neurosci. Methods 170, 229-244 (2008)]. Here we present a more detailed protocol for this test in rats and compare it with a newly developed version for mice, the Capellini Handling Test. Rats and mice are videotaped while handling short lengths of uncooked vermicelli or capellini pasta, respectively, with a camera positioned to optimize the view of paw movements. Slow motion video playback allows for the identification of forepaw adjustments, defined as any distinct removal and replacement of the paw, or of any number of digits, on the pasta piece after eating commences. Forepaw adjustments per piece are averaged over trials per each testing session. Repeated testing permits sensitive quantitative analysis of changes in forepaw dexterity over time. Protocols for pre-testing habituation and handling practice, as well as procedures for characterizing atypical handling patterns, are described. Because rats and mice perform the pasta handling tests slightly differently, species-specific differences in administration and scoring of these tests are highlighted. All animal use was in accordance with protocols approved by the University of Texas at Austin Animal Care and Use Committee.

The Vermicelli and Capellini Handling Tests of forepaw dexterity take advantage of the natural inclination of rodents to manipulate food items using skillful forepaw and digit movements. Animals are videotaped while handling short strands of uncooked dry pasta. Slow motion video playback allows for the quantification of forepaw adjustments.

베르 미 첼리와 Capellini 처리 시험 : 쥐 및 생쥐의 손재주가 앞발 기능의 단순 양적 측정

Previous characterizations of rodent eating behavior have revealed that they use coordinated forepaw movements to manipulate food pieces. We have extended ...

연구

신경과학

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

비 심실 플라스미드 주입 및 Electroporation에 의해 출생 후의 쥐 뇌에 유전자 전달

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain proper, that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis. The tissue harvested is suitable for biochemical and physiological analysis, and the MAV has been shown to be sensitive to damage produced by amphetamine and hyperthermia 1,2. As well, the major and minor cerebral vasculatures harvested in MAV are of potentially high interest when investigating concussive types of head trauma. The MAV dissected in this presentation consists of the pial and some of the arachnoid membrane (less dura) of the meninges and the major and minor cerebral surface vasculature. The choroid plexus dissected is the structure that resides in the lateral ventricles as described by Oldfield and McKinley3,4,5,6. The methods used for harvesting these two tissues also facilitate the harvesting of regional cortical tissue devoid of meninges and larger cerebral surface vasculature, and is compatible with harvesting other brain tissues such as striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. The dissection of the two tissues takes from 5 to 10 min total. The gene expression levels for the dissected MAV and choroid plexus, as shown and described in this presentation can be found at GSE23093 (MAV) and GSE29733 (choroid plexus) at the NCBI GEO repository. This data has been, and is being, used to help further understand the functioning of the MAV and choroid plexus and how neurotoxic events such as severe hyperthermia and AMPH adversely affect their function.

This video presentation shows a method of harvesting the two most important highly vascular structures that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis.

쥐의 뇌에서 뇌 표면 Vasculature 및 관련 Meninges의 해부 및 맥락막 얼기의 시각적 설명

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

에 vibratome 단면 마우스 망막 광 수용체의 문화를 준비하는 방법

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

마우스에 콜드 민감도 및 적응을 결정하기위한 간단하고 저렴한 방법

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

폐쇄 머리 외상성 뇌 손상을 입힐 수있는 방법<em&gt; 초파리</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.

MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.

miRNA의 뇌의 특정 최저 대한 정위 주입하는 간단한 대안

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

사용 보상 추구 행동의 변화를 측정하는 간단한 방법<em&gt; 노랑 초파리</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

신선 하 게 고립 된 쥐 두뇌 Microvessels에서 막 샘플을 준비 하는 간단 하 고 재현할 수 방법

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터