Name: healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish
Uploaded: 2018-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish at JoVE.com

우리 양 LourdesCarreon G 탄 메 다카 시설을 유지 하는 그녀의 도움 및 안토니 Peltier 설명 그림에 대 한 감사 합니다. 이 작품은 노르웨이의 연구 위원회, 보조금 번호 244461 (양식 프로그램) 및 248828 (디지털 라이프 노르웨이 프로그램)와 NMBU에 의해 투자 되었다.

처리 하는 모든 동물 생명 과학의 고 승인된 수 사관의 감독 하에 간호와 노르웨이 대학에서 연구 동물의 복지에 대 한 권고에 따라 수행 되었다.
1입니다. 기기 및 솔루션의 준비
참고: 모든 솔루션 살 균 해야 합니다. 주의 산도를 신중 하 게 공부 종의 extracellular 환경에 적응 해야 합니다 모든 솔루션의 osmolality (osmol/kg 물) 주어져야 한다. pH와 osmolality 조정 되어야 한다 pH 미터, 어는 점 osmometer 등 정밀 전자 장비와 각각.
<ol><li>
확인 없이 캘리포니아2 + 여분-셀룰러 솔루션의 500 mL (Ca2 + 무료 EC): 150 mM NaCl, KCl, 1.3 m m MgCl2, 5mm 4mm 포도 당, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>4.38 g의 NaCl, KCl, MgCl2, 360.32 mg의 포도 당 및 초순의 450 ml HEPES의 1.19 g 61.89 mg 186.37 mg 해산 (0.055 미국 / 25 ° C에서 cm, 18.2 MOhm 저항력) H2O 자석 교 반기를 사용 하 여 유리 비 커에.</li>
		<li>NaOH와 7.75에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>500 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 합니다. 500 mL까지 초순 H2O로 부피 플라스 크를 채우십시오.</li>
		<li>osmolality 측정 하기 전에 솔루션을 믹스. 마 니 톨과 290-300 mOsm을 조정 합니다. 필터 물 진공 시스템 및 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
여분-셀룰러 솔루션 (EC)의 500 mL 확인: 150 mM NaCl, 5 m m KCl, 2mm CaCl2, 1.3 m m MgCl2, 포도 당 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>NaCl의 4.38 g, KCl의 186.37 mg, CaCl2의 147.01 mg, MgCl2의 61.89 mg, 360.32 밀리 그램의 포도 당 및 초순 H2O 자석 교 반기를 사용 하 여 유리 비 커에는 450 ml에서 HEPES의 1.19 g 용 해.</li>
		<li>NaOH와 7.75에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>500 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 합니다. 500 mL까지 초순 H2O로 부피 플라스 크를 채우십시오.</li>
		<li>osmolality 측정 하기 전에 솔루션을 믹스. 마 니 톨과 290-300 mOsm을 조정 합니다. 필터 물 진공 시스템 및 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA와 EC)으로 여분-셀룰러 솔루션의 500 mL 확인: 150 mM NaCl, 5 m m KCl, 2mm CaCl2, 1.3 m m MgCl2, 포도 당 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>NaCl의 4.38 g, KCl의 186.37 mg, CaCl2의 147.01 mg, MgCl2의 61.89 mg, 360.32 밀리 그램의 포도 당 및 초순 H2O 자석 교 반기를 사용 하 여 유리 비 커에는 450 ml에서 HEPES의 1.19 g 용 해.</li>
		<li>NaOH와 7.75에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>500 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 합니다. 500 mL까지 초순 H2O로 부피 플라스 크를 채우십시오.</li>
		<li>osmolality 측정 하기 전에 솔루션을 믹스. 마 니 톨과 290-300 mOsm을 조정 합니다. 필터 물 진공 시스템 및 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독. 50 mg BSA를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포내 솔루션 (IC)의 250 mL 확인: 110mm 코, 20 m KCl, 10mm Hepes, m 20 m m 자당.
	<ol>
<li>1.54 g 코, KCl의 327.75 mg, HEPES의 595.75 mg 및 초순 H2O 자석 교 반기를 사용 하 여 유리 비 커에 450 mL에 자당의 1.712 g 용 해.</li>
		<li>(N-morpholino) 탄 sulfonic (MES) 산 7.2에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>250 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 합니다. 250 mL까지 초순 H2O로 부피 플라스 크를 채우십시오.</li>
		<li>osmolality 측정 하기 전에 솔루션을 믹스. 280-290 mOsm (EC 보다 낮은 10 mOsm) 자당으로 조정 됩니다. 필터 물 진공 시스템 및 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>캘리포니아2 + 및 BSA 무료 EC 2% 낮은 녹는 agarose 용액 100 mL를 만들기 (캘리포니아2 + 의 100 mL에 낮은 녹는 agarose의 2 세대 무료 EC). 전자 레인지를 사용 하 여 녹이 고 40 ° c.에 물 욕조에 녹아 agarose를 배치 그것은 진정 하자 조직에 사용 하기 전에 40 ° C를 도달할 때까지. 참고: EC, 캘리포니아2 + 무료 EC 저장 될 수 있습니다 4 ° C에서 몇 주 면 살 균 및 IC 솔루션-20 ° C에서 몇 달 동안. Agarose 4 ° C에서 1 주 동안 저장 될 수 있다 고 짧게 microwaving에 의해 3-5 시간을 다시 사용할 수 있습니다. 과도 한 재사용 agarose 및 소금 농도 품질의 증발 및 이어질 것입니다.</li>
	<li>
한 다리를 만들:
	<ol>
<li>열 (마약과) 2 m m 외부 직경 7.5 m m 긴 붕 규 산 유리 모 세관 그리고 안쪽 직경 (아이디) 1.16 m m는 초점에 분 젠 버너를 사용 하 여 지점 약 1/3 한쪽에서 유리 구 부를 시작할 때까지. 불꽃에서 유리를 제거 하 고 유리 (그림 2A) 약 120도의 각도 벤드를 허용.</li>
		<li>포도 당, 전자 레인지를 사용 하 여 없이 하 고는 agarose는 액체 채우기 미리 만든된 유리 주입구를 사용 하 여 모 세관 액체 유리의 끝 중 하나를 삽입 하 고 몇 분 동안 대기에 의해 강제로 하는 동안 정상적인 ec 2 %agar 녹여. 포도 당 없이 EC에서 4 ° C에서 사용까지 다리를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적당 한 피 펫 끌어당기는 사람을 사용 하 여 필 라 멘 트 패치 펫으로 붕 규 산 유리를 준비 합니다. 원하는 전극 저항을 얻기 위해 피 펫 끌어당기는 설명서를 참조 하십시오. 참고: 피펫으로의 테이퍼 가능한 한 짧게 해야 합니다. 짧은 피 펫 테이퍼 당기 단계 4-6을 사용 하 여 이루어집니다. 전극 저항 셀 크기에 따라 2, 6 m ω 사이 이어야 한다.</li>
	<li>
피하기 위해 패치 클램프 실험 동안 조직 운동의 borate 버퍼에서 polyethylenimine (페이)의 0.1%와 녹음 실의 표면 코트.
	<ol>
<li>Borate 버퍼 (25 m m)의 500 mL를 준비:<ol>
<li>나2B4O710 H2O 450 ml에서의 초순 H2O 자석 교 반기를 사용 하 여 유리 비 커에 4.768 g을 분해.</li>
			<li>HCl와 8.4에 pH를 조정 합니다.</li>
			<li>500 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 합니다. 500 mL과 0.2 µ m 필터 소독 물 진공 시스템을 사용 하 여 솔루션까지 초순 H2O로 부피 플라스 크를 채우십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>최종 사용을 위한 10 µ L borate 버퍼의 100 µ L에서 재고 솔루션 1%의 희석으로 페이 (49 mL 25mm borate 버퍼에 1 mL 50% 페이)와 0.1% 페이 희석 1% 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>슬라이스 소유자의 유리에 0.1% 페이의 2 개 mL를 추가 하 고 1 분 동안 품 어 코팅을 하자. 짧게 초순 H2O의 5 mL로 두 번 유리 세척 그리고 사용까지 건조 공기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
암포 B 솔루션을 준비 합니다.
	<ol>
<li>빛 으로부터 보호 1 mL 튜브에 50 µ L 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 암포 B 가루 3 mg를 용 해 하 여 60 mg/mL 재고 솔루션을 확인 합니다. 30 최대 속도로 소용돌이 s와 15 분 균질 sonicate. -20 ° C에서 3-5 튜브에 aliquots를 저장 하 고 하루 한 약 수를 사용 합니다. 참고: 경우 암포 B 재고 솔루션은 명확 하 고 노란색 색 하지만 밀키 (여전히 노란색) 15-20 분 쥡니다 후 확인 새로운 재고 솔루션.</li>
		<li>10 mL 용량 보다 더 깨끗 한 유리 비 커에 IC의 2 개 mL를 pipetting으로 암포 b IC 솔루션을 확인 합니다. 피 펫 솔루션으로 암포 B 재고 솔루션의 8 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 혼합. 사용까지 얼음에 알루미늄 호 일 및 장소 비 커를 포장 하 고 그것에 게 모든 3 h를 갱신.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 해 부 및 Vibratome와 슬라이스
<ol><li>해 부, 전에 해 부 도구 준비 등 날카로운 하나 하나의 강한 집게가 위. 에탄올 (조직 홀더, 브러시, 집게) 도구를 청소 하 고는 사용 해 부 목적 으로만 고정된 조직 접촉 결코 다는 것을 확인. 오염을 피하기 위하여 별도 상자에 그들을 유지.</li>
	<li>1 분에 대 한 차가운 얼음 물에 물고기 안락사</li>
	<li>
후속 단계에 따라 신속 하 게 날카로운 집게 (를 사용 하 여 더 이상 3 분)와 메 다카 뇌와 뇌를 해 부.
	<ol>
<li>물고기와 함께 들고 강한 집게 심각한 눈 뒤에 2 개의 시 신경이 위로 while 또는 날카로운 집게.</li>
		<li>강력한 집게로 단계적으로 두개골 뼈를 파괴 함으로써 뒷부분에서 앞쪽 측면 두개골의 등 쪽 부분을 엽니다.</li>
		<li>강력한 집게로 한쪽에 두개골을 벗기다.</li>
		<li>심한이 위 또는 날카로운 집게와 척수.</li>
		<li>부드럽게, 척수는 집게로 잡아, 앞쪽에 후부에서 뇌를 플립 하 고 접시는 차가운 캘리포니아2 + 무료 적와 장소</li>
	</ol>
</li>
	<li>액체 agarose와 1.5-2 cm3 금속 몰드를 얼음에 그것을 배치.</li>
	<li>바로 전에 agarose 굳은 (약 25-30 ° C)에서 부드럽게 뇌 척수는 집게로 잡아, 괜 찮 아 요 종이의 조각으로 겸 건조와 agarose에 조직을 넣어. EC는 조직 주위 왼쪽의 흔적을 희석 하 고 조직 찾으시는 agarose 견고까지 몇 초 동안 얼음에 형을 하자 agarose는 신속 하 게 혼합. 참고: 그것은 빨리이 단계에 대 한 필수적입니다. agarose은 신속 하 게 얼음에 의해 금속 금형 냉각으로 굳은 것 이다.</li>
	<li>메스 칼 날 조직을 포함 하는 agarose의 정사각형 블록을 트림 하 고 수술 (무 독성) 접착제를 사용 하 여 vibratome 견본 홀더에 접착제.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 캘리포니아2 + 무료 적으로 표본 (뇌-뇌 하 수 체) 홀더를 받는 vibratome의 베트를 채우기</li>
	<li>vibratome로 견본 홀더를 놓고는 단면에 대 한 높은 주파수와 낮은 속도 사용 하 여 150 µ m의 parasagittal 섹션을 agarose 블록을 잘라. 선택한 섹션을 수집 하 고 차가운 캘리포니아2 + 무료 적의 3 mL와 패치 클램프 기록 챔버에 배치</li>
	<li>조직 섹션에 그리드 하프 (그림 2B)를 놓습니다. 참고: 하프 것 이다 코팅 함께 조직 안정화 및 패치 클램프 기록 하는 동안 이동에서 그것을 방지.</li>
	<li>거문고 자리에 후에, 캘리포니아2 + 일반 EC 및 BSA에 Ca2 + 무료 EC 매체를 변경 합니다. 10 분에 대 한 조직의 나머지를 보자.</li>
</ol>3. 천공 패치 클램프 및 Electrophysiological 녹음
<ol><li>실험을 시작 하기 전에 다음 단계에 의해 전극 와이어 염화는: 첫째, 좋은 샌드 페이퍼 (p180)을 사용 하 여 실버 와이어 전극을 청소. 둘째, 2 mL, 70% 에탄올으로 씻어. 셋째, 2 mL, 10 분 동안 2-5% 염소에에서 와이어를 찍어. 마지막으로, 린스 2 mL, 초순 H2o.</li>
	<li>10 X 목표를 사용 하 여 대상 영역 (뇌) 현미경 단계 뇌-뇌 하 수 체 조각으로 녹음 실 에서도 찾아서 40 X 목표를 사용 하 여 셀을 검사 합니다. 참고: 성공적으로 준비 되 면 거의 라운드 셀 표시 되어야 합니다. 이러한 둥근 세포는 조직에서 분리는 일반적으로 손상 된 세포입니다.</li>
	<li>2% 한 천의 다리를 통해 접지 전극을 EC 욕조에 놓습니다.</li>
	<li>40 X 목표를 사용 하 여 건강 한 세포를 찾습니다. 참고: 건강 한 셀 해야 될 단단히 조직 조각에 연결 된 및 하지 고 조각에서 분리.</li>
	<li>전압 클램프 (VC;에 앰프를 설정 그림 4A 포인트 1) 모드. 오픈 인감 테스트 창과 언론 목욕 구성 (그림 4B 포인트 1과 2. 5 mV 펄스를 사용 하 여 피 펫 저항 (그림 4B 포인트 3) 모니터링.</li>
	<li>백필 암포 b 마이크로 필러 주사기를 사용 하 여 IC 솔루션을 추가 하기 전에 항진균 무료 IC 솔루션 패치 피 펫의 끝 ( 그림 3참조).</li>
	<li>1 mL 주사기를 사용 하 여 패치 피 펫에 약간 긍정적인 공기 압력을 추가 합니다. 참고: 이것은 팁의 오염을 방지 하는 패치 피 펫에서 작은 액체 흐름.</li>
	<li>일단 목욕, 패치 피펫은 저항을 평가 하 고 아무 입자 (그림 4C) 피 펫의 끝에 연결 된 ㄴ 다는 것을 확인 키를 누릅니다. 참고: 테이프의 작은 조각은 비디오 녹화 형태 보기의 필드를 표시 하는 모니터에 부착 되어. 이것은의 위치 셀 기준으로 패치 피펫으로 쉽게 때 목표 하지 셀에 초점을 맞추고 있습니다.</li>
	<li>Micromanipulators를 사용 하 여 셀 아래로 패치 피 펫 가이드. 참고: 피펫으로 작은 입자는 피 펫의 끝에 연결 된 수를 찾아 깨끗 한는 다는 것을 확인 하십시오. 저항에 급격 한 변화는 피 펫 팁에 갇혀 입자의 결과 영향을 수도 있습니다.</li>
	<li>때 몇 가지 피 펫을 재조정 미크론 셀 위에 그림 5와 같이 피 펫의 끝 셀 셀의 중간에서 1/3를 터치 것입니다. 셀을 만질 때 압력을 놓고 인감을 만들기 위해 부드러운 흡입을 적용. 참고: 패치 피 펫에서 시간 성공적인 목욕을 입력 인감을 가능한 한 짧게 유지 되어야 한다. 1-1.5 분 이상 목욕으로 피 펫 누설의 끝을 도달 하는 암포 B를 피하기 위하여.</li>
	<li>즉시 패치 클램프 소프트웨어 (그림 4 D 포인트 1) 패치 창으로 전환 하 고-50,-60 mV (그림 4D 포인트 2) 사이의 지주 잠재력 합니다. 제로 아웃 빠른 정전 용량 유리 피 펫 (그림 4D 점 3)으로 구성.</li>
	<li>패치 클램프 소프트웨어 (4E 그림 포인트 1과 2)에 셀 창으로 전환 하 고 액세스 저항, Ra, 창에 표시 됩니다 모니터링을 시작 합니다. 충분 한 액세스 후 앰프 소프트웨어 (4E 그림 포인트 3)에서 막 용량 밖으로 0. 참고: 충분 한 액세스 10 ~ 30 분 (4E 그림 포인트 2) 걸릴 수 있습니다. 현재 클램프 녹음에 대 한 좋은 액세스 20 M 미만 이어야 합니다.</li>
	<li>전류 클램프, IC, 앰프 소프트웨어 창 (그림 4 층 포인트 1)에서 전환 합니다. 3.12은 같은 값을 앰프 소프트웨어 (4 층 그림 포인트 2, 3) -클램프 창에서 빠른 용량 성 전류를 조정 합니다. 막 잠재력 (4 층 그림 포인트 1)를 확인 합니다. 참고: 중요 한 것은, 막 잠재력은 얕은 경우 (-35 위의 일반적인 mV) 세포를 손상 될 수 있습니다. 녹음/녹화를 취소 하 고 새 셀을 찾을.</li>
	<li>건강 한 세포를 찾는 후 (막-40 아래 잠재적으로 조직에 단단히 부착 된 mV), 제조 업체의 프로토콜 33,34에 설명된대로 실험 녹음을 시작.</li>
</ol>

<ol>
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뇌-뇌 하 수 체 조각에 패치 클램프 기법을 사용 하 여 electrophysiological 녹음 주의 최적화가 필요 합니다. 특히 teleosts에서에서 라이브 셀 조사 수행을 위한 최적화 되 프로토콜 대부분 포유류 시스템 기반 프로토콜을 사용 하 여 발행물의 제한 됩니다. 이와 관련, 그것은 중요 한 사실을 pH 및 osmolality 같은 여러 생리 적 매개 변수 종류가 뿐만 아니라 종속, 하지만 또한 매우 여부 유기 체에 살고 땅에...

뇌 하 수 체는 척추 동물 시상 아래 위치 하 고 광학 chiasm에 후부 키 내 분 비 기관 이다. 그것은 생성 하 고 특정 세포 유형에서 6 ~ 8 호르몬을 secretes. 뇌 하 수 체 호르몬 두뇌와 주변 장기 사이의 중간을 구성 하며 다양 한 성장, 재생산, 그리고 항상성의 규칙을 포함 하 여 필수적인 생리 적 프로세스를 드라이브 합니다. 유사한 신경 세포는 뇌 하 수 체의 내 분 비 세포는 활동 전위를 자발적으로 발사 하는 기능으로 전기 고르기 1. 이 활동 전위의 역할은 종속 셀. 포유류의 뇌 하 수 체의 여러 세포 유형에서 활동 전위 수 상승 세포내 캘리포니아2 + 2호르몬 지속적인된 출시에 대 한 충분 합니다. 또한,는 뇌 세포 3,4,,56막 잠재력에 영향을 미치는 뇌에서 stimulatory와 금지 정보를 받습니다. 일반적으로, 물질로 입력은 흥분을 증가 하 고 자주 세포내 상점에서 캘리포니아2 + 의 출시를 포함 뿐만 아니라 발사 주파수 7증가. 셀 이온 채널 구성 활용 방법과 뇌에서 이러한 입력된 신호에 맞게 이해 이해 호르몬 합성 및 릴리스의 열쇠입니다.
패치 클램프 기술 Sakmann 및 정치학자 8,,910 에 의해 1970 년대 후반에 개발 되었고 더 해 밀 11, 개선 셀 electrophysiological 속성의 상세한 조사를 허용 하 고 단일 이온 채널 아래로 또한, 기술은 공부 하는 전류와 전압에 대 한 사용할 수 있습니다. 오늘, 패치 클램핑 셀의 electrophysiological 속성을 측정 하기 위한 황금 표준입니다. 단단한 물개 패치 클램프 기술의 4 개의 주요 구성 되어 개발된 11; 셀 연결 된 내부, 외부 아웃을 전체 셀 패치. 3 첫 번째 구성 단일 이온 채널 수사를 위해 일반적으로 사용 됩니다. 4, 다음 셀 연결 구성에 대 한 세포 막에 구멍 하위 대기 압력을 사용 하 여 이루어집니다. 이 구성에는 또한 12전체 세포 이온 채널 구성의 조사 수 있습니다. 그러나,이 기술의 한 가지 제한 세포질 분자는 패치 피 펫 솔루션 13 그림 1(A), 따라서 공부 셀의 전기 및 생리 적인 응답에 영향을 미치는 희석 하는. 사실, 그 분자의 일부 신호 변환 또는 다른 이온 채널의 규칙에서 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 이 방지 하려면 린다 우와 페르난데스 14 방법을 개발 기 공 형성 화합물 패치 피 펫에 추가 됩니다. 셀 연결 된 구성에 따라 화합물 패치 아래 플라즈마 막으로 통합 하 고 천천히 cytosol (그림 1B)와 전기 접촉을 만드는 막 구멍. Nystatin 15 와 암포 B 16, 같은 여러 다른 antifungals 또는 사포닌 베타-escin 17,18 같은 계면 활성 제를 사용할 수 있습니다. 이러한 화합물 생성 여러차례 양이온 및 Cl- 고분자 및 캘리포니아2 + 15와 같은 더 큰 이온의 cytosolic 레벨을 유지 하면서는 cytosol와 패치 피펫으로 사이 보급 수 있도록 충분히 큰 모 공 16.
구멍이 패치를 사용 하 여의 전에 잠재적으로 높은 직렬 저항입니다. 직렬 저항 (Rs) 또는 액세스 저항 결합 된 저항 지상 기준으로 패치 피 펫 이다. 패치 클램프 기록 하는 동안 Rs 막 저항 병행에서 될 것입니다 (Rm). Rm 그리고 Rs 전압 분배기로 병렬 작업에. 높은 Rs, 전압 기록에서 오류를 주는 Rs 이상 떨어질 것 이다. 오류 기록 큰 해류와 더 큰 될 것입니다. 또한, 전압 분배기 주파수 의존 따라서 시간적 해상도 영향을 미치는 로우-패스 필터 만들기 이기도 합니다. 사실상 구멍이 패치 항상 수 없습니다 크고 빠른 해류의 같은 전압 문이 나+ 전류 (에 대 한 자세한 읽기 참조 19참조). 또한, Rs 패치 클램프 기록, 다시 기록 된 전류에 변화를 선도 하는 동안 달라질 수 있습니다. 따라서, 가양성 Rs 약물 응용 프로그램 하는 동안 변경 하는 경우에 발생할 수 있습니다.
슬라이스 조직에 전기 생리학 20뇌 뉴런의 electrophysiological 특성 연구 앤더슨 연구소에 의해 처음 도입 되었다. 기술은 더 그대로 환경에서 세포-세포 통신 및 셀 회로 서 단일 셀의 상세한 수사에 대 한 방법을 포장. 뇌 조각을 만들기 위한 유사한 기술 Guérineau 그 외 여러분 에 의해 1998 년에 도입 되었다 그러나 21., 그것은 그의 뇌-뇌 하 수 체 슬라이스 준비 teleost 22패치 클램프 연구 성공적으로 사용 되었다 2005 년 전에. 이 연구에서 저자는 또한 구멍이 패치 클램프 기록의 사용을 보고 했다. 그러나, 지금까지, 대부분의 뇌 세포의 electrophysiological 조사 실시 되었습니다 포유류, 그리고 teleost 물고기 1,,222,23 포함 하 여 다른 척추 동물의 소수에서 . Teleosts에 거의 모든 연구에 수행 기본 해리 셀 24,25,26,,2728,29,30 .
현재 신문에서 우리 모델 물고기 메 다카에서 건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각의 준비를 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 접근 기본 천연된 세포 배양에 비해 몇 가지 장점을 나타냅니다. 첫째, 세포 해리 세포 문화 조건에 비해 상대적으로 보존된 환경에 기록 됩니다. 둘째, 슬라이스 준비 공부는 해리 셀 문화 조건에 불가능-셀 통신 22, 중재 하는 간접 경로 수 있습니다. 또한, 기 공 형성 요원으로 암포 b 천공된 전체 셀 패치 클램프 기법을 사용 하 여 얻은 조직 조각에 electrophysiological 녹음을 수행 하는 방법을 보여 줍니다.
메 다카는 작은 민물고기 아시아, 주로 일본에서 발견 이다. 메 다카의 유전학, 발생 학, 생리학 광범위 하 게 연구 100 년 31, 그리고 그것은 많은 실험실에서 일반적으로 사용 되 연구 모델. 이 종이에 특별 한 중요성의 teleost 물고기에 시상 하 부-뇌 하 수 체 복합물의 독특한 형태학 조직 이다: 포유류와 조류 hypothalamic 뉴런 릴리스 그들의 신경-호르몬 뇌 하 수 체 내 분 비 세포를 조절 하는 반면 중간 예 하의 포털 시스템으로 hypothalamic 뉴런 teleost 물고기 32에서 뇌 하 수 체의 내 분 비 세포의 직접적인 긴장 투영이입니다. 따라서, 물고기, 잘 보존 된 뇌-뇌 하 수 체 네트워크에 뇌 세포와 특히 어떻게 뇌 세포의 electrophysiological 특성을 조사할 수 있는 특별 한 중요성의 이다 신중 하 게 실시 뇌-뇌 하 수 체 부 러 뜨 리 그들의 흥분을 제어 함으로써 캘리포니아2 + 항상성.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgical glue</td><td>WPI</td><td>VETBOND</td><td>3M Vetbond Tissue Adhesive</td></tr><tr><td>Stainless steel blades</td><td>Campden Instruments</td><td>752-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>metal molds</td><td>SAKURA</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>steel harp</td><td>Warner instruments</td><td>64-1417</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure LMP agarose</td><td>invitrogen</td><td>166520-100</td><td></td></tr><tr><td>patch pipettes</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-110-10HP</td><td>Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm</td></tr><tr><td>Microscope Slicescope</td><td>Scientifica</td><td>pro6000</td><td></td></tr><tr><td>P-Clamp10</td><td>Molecular Devices</td><td>#1-2500-0180</td><td>sofware</td></tr><tr><td>Digitizer Digidata 1550A1</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1550</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td></td></tr><tr><td>GnRH</td><td>Bachem</td><td>4108604</td><td>H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>amphotericin B</td><td>SIGMA</td><td>A9528</td><td>pore-forming antibiotic</td></tr><tr><td>polyethylenimine&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P3143</td><td>50% PEI solution</td></tr><tr><td>microfiler syringe</td><td>WPI</td><td>MF28/g67-5</td><td></td></tr><tr><td>glass for the agar bridge</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF200-116-15</td><td>Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished</td></tr><tr><td>Micro-Manager software</td><td></td><td></td><td>Open Source Microscopy Software</td></tr><tr><td>optiMOS sCMOS camera</td><td>Qimaging</td><td>&amp;nbsp;01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td></td></tr><tr><td>sonicator</td><td>Elma</td><td>D-7700 singen</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SiGMA</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SiGMA</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SiGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>SiGMA</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SiGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SiGMA</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SiGMA</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>SiGMA</td><td>63565</td><td></td></tr><tr><td>MES-acid</td><td>SIGMA</td><td>M0895</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish

뇌 세포의 electrophysiological 조사 다 척 추가 있는 종, 하지만 거의 teleost 물고기에 실시 되었습니다. 이 중, 분명 대다수 해리 1 차 셀에 수행 되었습니다. 어떻게 teleost 뇌 세포에 대 한 우리의 이해를 개선, 더 많은 생물학 관련 환경에서 작동,이 프로토콜에는 작은 민물고기 메 다카 (Oryzias latipes)를 사용 하 여 가능한 뇌-뇌 하 수 체 슬라이스를 준비 하는 방법을 보여 줍니다. 뇌-뇌 하 수 체 조각 만들기, pH 및 모든 솔루션의 osmolality 25 ~ 28 ° c.에 사는 민물 물고기의 체액에서 발견 하는 값을 조정 했다 조각 준비, 다음 프로토콜 electrophysiological 녹음 천공된 전체 셀 패치-클램프 기술을 사용 하 여 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 패치 클램프 기술 전례 없는 시간적 해상도와 감도, 단일 이온 채널 아래로 그대로 전체 세포에서 전기적 특성의 조사를 수 있도록 강력한 도구입니다. 세포내 환경 그대로에서 패치 피 펫 전극 솔루션에 의해 희석되는 cytosol에서 규제 요소를 방지를 유지에 구멍이 패치는 고유 합니다. 대조적으로, 전통적인 전체 셀 녹화를 수행할 때 메 다카 뇌 세포 신속 하 게 활동 전위를 발사 하는 그들의 기능을 잃고 관찰 되었다. 다양 한 기 공 기술을 사용할 수 있는, 중이 프로토콜 암포 B. 살 균 제를 사용 하 여 패치 막의 천공을 달성 하는 방법을 보여 줍니다.

이 프로토콜 어디 대상 세포 (Lh 생산 gonadotropes) 한 메 다카 유전자 변형 라인 [Tg (lhb-hrGfpII)]를 사용 하 여 뇌 하 수 체 (gonadotrope) 셀에서 안정적인 electrophysiological 녹음을 달성 하는 방법의 단계 프로토콜을 보여 줍니다. 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시 됩니다.
처음, electrophysiological 조사 전체 셀 구성을 사용 하 여 실시 ?...

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Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

설명 하는 최적화 된 프로토콜을 electrophysiological 녹음으로 패치 클램프 기술을 사용 하 여 뇌 세포의 뒤에 가능한 뇌-뇌 하 수 체 조직을 조각, teleost 물고기 메 다카 (Oryzias latipes)를 사용 하 여 만들기는 구멍이 패치 구성입니다.

건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각 Teleost 물고기에 뇌 세포의 Electrophysiological 조사에 대 한

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

healthy-brain-pituitary-slices-for-electrophysiological

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.7K 조회수.  Norwegian University of Life Sciences. 설명 하는 최적화 된 프로토콜을 electrophysiological 녹음으로 패치 클램프 기술을 사용 하 여 뇌 세포의 뒤에 가능한 뇌-뇌 하 수 체 조직을 조각, teleost 물고기 메 다카 (Oryzias latipes)를 사용 하 여 만들기는 구멍이 패치 구성입니다.

비디오: Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

Branchial ionocytes (ICs) are the functional units for ionic regulation in fish. In adults, they are found on the filamental and lamellar epithelia of the gill where they transport ions such as Na+, Cl- and Ca2+ via a variety of ion channels, pumps and exchangers. The teleost gill is extrinsically innervated by the facial (VI), glossopharyngeal (IX) and vagus (X) nerves. The IX and X nerves are also the extrinsic source of branchial IC innervation. Here, two techniques used to study the innervation, proliferation and distribution of ICs are described: a time differential staining technique and a full bilateral gill denervation technique. Briefly, goldfish are exposed to a vital mitochondrion-specific dye (e.g., MitoTracker Red) which labels (red fluorescence) pre-existing ICs. Fish were either allowed to recover for 3 - 5 days or immediately underwent a full bilateral gill denervation. After 3 - 5 days of recovery, the gills are harvested and fixed for immunohistochemistry. The tissue is then stained with an &#945;-5 primary antibody (targets Na+/K+ ATPase containing cells) in conjunction with a secondary antibody that labels all (both new and pre-existing) ICs green. Using confocal imaging, it was demonstrated that pre-existing ICs appear yellow (labelled with both a viable mitochondrion-specific dye and &#945;-5) and new ICs appear green (labelled with &#945;-5 only). Both techniques used in tandem can be applied to study the innervation, proliferation and distribution of ICs on the gill filament when fish are exposed to environmental challenges.

This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.

전체 양자 간 길 탈 신경과 결합 시간 차등 염색 기술은 물고기에 Ionocytes을 연구하기 위해

Branchial ionocytes (ICs) are the functional units for ionic regulation in fish. In adults, they are found on the filamental and lamellar epithelia of the ...

연구

발생학

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

신경과학

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

애벌레의 Zebrafish의 Forebrain Electrophysiological 기록

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

형질 전환 생선의 본래 뇌에서 발견 뉴런의 전기적 활동을 기록

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

자유롭게 수영 약하게 전기 생선의 장기 행동 추적

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

온전한 성인 Zebrafish의의 뇌에 전기 생리학 기록

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one of the first organs to start functioning during development. Mechanisms of blood vessel formation have become a subject of high scientific and clinical interest. In adults however, it is difficult to visualize the vasculature in most living animals due to their localization deep within other tissues. Nevertheless, visualization of blood vessels remains important for several studies such as endocrinology and neurobiology. While several transgenic lines have been developed in zebrafish, with blood vessels directly visualized through expression of fluorescent proteins, no such tools exist for other teleost species. Using medaka (Oryzias latipes) as a model, the current protocol presents a quick and direct technique to label blood vessels in brain and pituitary by perfusing through the heart with fixative containing DiI. This protocol allows improvement of our understanding on how brain and pituitary cells interact with blood vasculature in whole tissue or thick tissue slices.

The article describes a quick protocol for labeling blood vessels in a teleost fish by cardiac perfusion of DiI diluted in fixative, using medaka (Oryzias latipes) as a model and focusing on brain and pituitary tissue.

텔 레 Ost 뇌와 뇌 하 수 체에 있는 혈관의 라벨링은 DiI와 함께 심장 관류를 사용 하 여

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

생체공학

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled environment. Despite vast differences in the physiology between mammals and fish, primary cell culture protocols from fish are often based on mammalian culture conditions, often with only minor modifications. The environmental differences affect not only body temperature, but also blood serum parameters such as osmolality, pH, and pH buffer capacity. As cell culture media and similar working solutions are meant to mimic characteristics of the extracellular fluid and/or blood serum to which a cell is adapted, it is crucial that these parameters are adjusted specifically to the animal in question.
The current protocol describes optimized primary culture conditions for medaka (Oryzias latipes). The protocol provides detailed steps on how to isolate and maintain healthy dissociated pituitary cells for more than one week and includes the following steps: 1. the adjustment of the osmolality to the values found in medaka blood plasma, 2. the adjustment of the incubation temperature to normal medaka temperature (here in the aquarium facility), and 3. the adjustment of the pH and bicarbonate buffer to values comparable to other fish species living at similar temperatures. The results presented using the described protocol promote physiologically meaningful results for medaka and can be used as a reference guide by scientists making primary cell cultures from other non-mammalian species.

Here we describe a protocol to prepare and maintain primary pituitary cell cultures from medaka (Oryzias latipes). The optimized conditions in this protocol take important parameters such as temperature, osmolality, and pH into consideration by mimicking the physiological conditions of the fish, thereby enabling physiologically more meaningful results.

물고기 Pituitaries에서 높은-품질 기본 세포 배양의 준비

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain activity from freely moving fish would advance research on the neural basis of fish behavior considerably. Moreover, precise control of the recording location in the brain is critical to studying coordinated neural activity across regions in fish brain. Here, we present a technique that records wirelessly from the brain of freely swimming fish while controlling for the depth of the recording location. The system is based on a neural logger associated with a novel water-compatible implant that can adjust the recording location by microdrive-controlled tetrodes. The capabilities of the system are illustrated through recordings from the telencephalon of goldfish.

A novel wireless technique for recording extracellular neural signals from the brain of freely swimming goldfish is presented. The recording device is composed of two tetrodes, a microdrive, a neural data logger, and a waterproof case. All parts are custom-made except for the data logger and its connector.

자유롭게 수영 물고기에서 이동 식 Tetrodes에 의해 뉴런의 무선 전기 생리적 기록

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...

건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각 Teleost 물고기에 뇌 세포의 Electrophysiological 조사에 대 한

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

전체 양자 간 길 탈 신경과 결합 시간 차등 염색 기술은 물고기에 Ionocytes을 연구하기 위해

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA^{2 + 영상}

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

애벌레의 Zebrafish의 Forebrain Electrophysiological 기록

형질 전환 생선의 본래 뇌에서 발견 뉴런의 전기적 활동을 기록

자유롭게 수영 약하게 전기 생선의 장기 행동 추적

온전한 성인 Zebrafish의의 뇌에 전기 생리학 기록

텔 레 Ost 뇌와 뇌 하 수 체에 있는 혈관의 라벨링은 DiI와 함께 심장 관류를 사용 하 여

물고기 Pituitaries에서 높은-품질 기본 세포 배양의 준비

자유롭게 수영 물고기에서 이동 식 Tetrodes에 의해 뉴런의 무선 전기 생리적 기록

건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각 Teleost 물고기에 뇌 세포의 Electrophysiological 조사에 대 한

요약

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전체 양자 간 길 탈 신경과 결합 시간 차등 염색 기술은 물고기에 Ionocytes을 연구하기 위해

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 + 영상

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

애벌레의 Zebrafish의 Forebrain Electrophysiological 기록

형질 전환 생선의 본래 뇌에서 발견 뉴런의 전기적 활동을 기록

자유롭게 수영 약하게 전기 생선의 장기 행동 추적

온전한 성인 Zebrafish의의 뇌에 전기 생리학 기록

텔 레 Ost 뇌와 뇌 하 수 체에 있는 혈관의 라벨링은 DiI와 함께 심장 관류를 사용 하 여

물고기 Pituitaries에서 높은-품질 기본 세포 배양의 준비

자유롭게 수영 물고기에서 이동 식 Tetrodes에 의해 뉴런의 무선 전기 생리적 기록

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA^{2 + 영상}