Name: healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish
Uploaded: 2018-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish at JoVE.com

Wir danken Frau LourdesCarreon G Tan für ihre Hilfe, die Aufrechterhaltung der Medaka Anlage und Anthony Peltier für die anschaulichen Zahlen. Diese Arbeit wurde von NMBU und der Forschung Rat von Norwegen, Grantnummern 244461 (Aquakultur-Programm) und 248828 (Digitalleben Norwegen-Programm) finanziert.

Alle Tier Handhabung wurde entsprechend den Empfehlungen für die Pflege und das Wohlergehen der Versuchstiere an der Norwegian University Life Sciences und unter der Aufsicht der autorisierte Ermittler durchgeführt.
1. Vorbereitung der Instrumente und Lösungen
Hinweis: Alle Lösungen sollten steril sein. Sorgfältige Augenmerk auf den pH-Wert und die Osmolalität (Osmol/kg Wasser) aller Lösungen, die sorgfältig die extrazellulären Umwelt der untersuchten Arten angepasst werden sollte. pH-Wert und Osmolalität sollte mit präzisen elektronischen Geräten wie pH-Meter und Gefrierpunkt XR angepasst werden.
<ol><li>
500 mL der extrazellulären Lösung ohne Ca2 + zu machen (Ca2 + gratis EG): 150 mM NaCl, KCl, 1,3 mM MgCl2, 5 mM 4 mM Glukose, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Lösen Sie 4,38 g NaCl, 186,37 mg KCl, MgCl2, 360,32 mg Glucose und 1,19 g HEPES in 450 mL hochreinen 61,89 mg (0,055 uS / cm bei 25 ° C, der Widerstand von 18,2 MOhm) H2O in ein Becherglas mit einem magnetischen Rührer.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit NaOH.</li>
		<li>Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL.</li>
		<li>Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 290 – 300 mOsm mit Mannit. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
500 mL der extrazellulären Lösung (EG) zu machen: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM Glukose, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Lösen Sie 4,38 g NaCl, 186,37 mg KCl, 147,01 mg CaCl2, 61,89 mg MgCl2, 360,32 mg Glucose und 1,19 g HEPES in 450 mL hochreines H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit NaOH.</li>
		<li>Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL.</li>
		<li>Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 290 – 300 mOsm mit Mannit. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
500 mL der extrazellulären Lösung mit 0,1 % Rinderserumalbumin (EG mit BSA) zu machen: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM Glukose, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Lösen Sie 4,38 g NaCl, 186,37 mg KCl, 147,01 mg CaCl2, 61,89 mg MgCl2, 360,32 mg Glucose und 1,19 g HEPES in 450 mL hochreines H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit NaOH.</li>
		<li>Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL.</li>
		<li>Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 290 – 300 mOsm mit Mannit. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter. Fügen Sie 50 mg BSA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
250 mL der intrazellulären Lösung (IC) zu machen: 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, 20 mM Saccharose.
	<ol>
<li>Lösen Sie 1,54 g KOH, KCl 327,75 mg, 595,75 mg HEPES und 1,712 g Saccharose in 450 mL hochreines H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2 mit (N-Morpholino) Ethan Sulfo (MES) Säure.</li>
		<li>Übertragen Sie die Lösung in einem 250 mL volumetrischen Kolben. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 250 mL.</li>
		<li>Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 280 – 290 mOsm (niedriger als EG 10 mOsm) mit Saccharose. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Machen Sie 100 mL 2 % niedrig schmelzende Agarose-Lösung in Ca2 + und BSA frei EG (2 g niedrig schmelzende Agarose in 100 mL Ca2 + gratis EG). Lösen Sie mit Hilfe einer Mikrowelle auf und legen Sie die geschmolzene Agarose in einem Wasserbad bei 40 ° C. Lassen Sie sie abkühlen, bis 40 ° C vor dem Gebrauch auf das Gewebe erreicht. Hinweis: EG, Ca2 + kostenlose EG bei 4 ° C für mehrere Wochen, wenn steril und IC-Lösungen bei-20 ° C, für mehrere Monate gelagert werden kann. Agarose pro Woche bei 4 ° C gelagert werden und durch kurz Mikrowelle 3 – 5 Mal wiederverwendet werden kann. Übermäßige Wiederverwendung führt zur Verdunstung und Veränderung der Agarose und Salzkonzentration und Qualität.</li>
	<li>
Agar-Brücke zu machen:
	<ol>
<li>Erhitzen Sie 7,5 mm lange Borosilikatglas Kapillaren mit Außendurchmesser (Außendurchmesser) 2 mm und Innendurchmesser (ID) 1,16 mm mit dem Bunsenbrenner auf einen fokalen Punkt ca. 1/3 von einem Ende bis das Glas beginnt zu beugen. Entfernen Sie das Glas von der Flamme und lassen Sie das Glas mit einem Winkel von etwa 120 Grad (Abb. 2A) beugen.</li>
		<li>Schmelzen Sie 2 % Agar in normalen EG ohne Glukose mit Hilfe einer Mikrowelle, und während die Agarose Flüssigkeit zu füllen ist das vorgefertigte Glas-Kapillare mit Kapillarität zwingt, indem eines der Enden des Glases in die Flüssigkeit und warten einige Minuten. Brücken bis zur Verwendung bei 4 ° C im EG ohne Glukose zu speichern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Borosilikatglas mit Glühfaden Patch Pipetten mit einem geeigneten Pipette Abzieher vor. Finden Sie die Pipette Puller Handbuch der gewünschten elektrodenwiderstand zu erhalten. Hinweis: Die Verjüngung der Pipette sollte so kurz wie möglich sein. Kurze Pipette Kegel wird mit 4 – 6 ziehende Schritte erreicht. Der elektrodenwiderstand sollte zwischen 2 und 6 MΩ je nach Größe der Zellen.</li>
	<li>
Zur Vermeidung von Bewegung des Gewebes während der Patch-Clamp-Experimenten Mantel der Oberfläche der Aufnahme Kammer mit 0,1 % der Polyethylenimine (PEI) in Borat-Puffer.
	<ol>
<li>Bereiten Sie 500 mL Borat Puffer (25 mM):<ol>
<li>Lösen Sie 4,768 g Na2B4O710 H2O in 450 mL von hochreinen H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.</li>
			<li>PH-Wert auf 8,4 mit HCl anpassen.</li>
			<li>Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL und 0,2 µm-Filter die Lösung mit Wasser Vakuumsystem sterilisieren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Endnutzung eine 1 %-Stammlösung von PEI (1 mL 50 % PEI auf 49 mL 25 mM Borat Puffer) und eine 0,1 % PEI Verdünnung durch Verdünnung 10 µL der Stammlösung 1 % in 100 µL Puffer Borat vorbereiten.</li>
		<li>2 mL 0,1 % PEI auf dem Glas des Inhabers Scheibe und lassen Sie die Beschichtung für 1 Minute inkubieren. Dann kurz waschen Sie das Glas zweimal mit 5 mL des hochreinen H2O und lassen Sie Luft bis zum Gebrauch trocknen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amphotericin B Lösungen vorzubereiten.
	<ol>
<li>Machen Sie 60 mg/mL Stammlösung durch Auflösen von 3 mg Amphotericin B Pulver in 50 µL Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in einer 1-mL-Tube vor Licht geschützt werden. Strudel mit der maximalen Geschwindigkeit für 30 s und für 15 min zum Homogenisieren beschallen. Speichern Sie Aliquote in 3 – 5 Röhrchen bei-20 ° C und verwenden Sie einer Teilprobe pro Tag. Hinweis: Wenn Vorratslösung Amphotericin B nicht klar und gelb ist Farbe, sondern milchig (noch gelb) nach 15 – 20 min. Beschallung stellen eine neue Stammlösung.</li>
		<li>Machen Sie IC-Lösung mit Amphotericin B durch pipettieren 2 mL des IC in ein sauberes Glasgefäß mit mehr als 10 mL Fassungsvermögen. 8 µL der Stammlösung Amphotericin B in die Pipette Lösung und Mischen von pipettieren. Wickeln Sie das Becherglas mit Aluminiumfolie und Platz auf dem Eis bis zur Verwendung und erneuern Sie alle 3 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Präparation und Schneiden mit Vibratome
<ol><li>Bereiten Sie die Dissektion Werkzeuge vor sezieren, darunter eine scharfe und eine starke Zange mit einer Schere. Reinigen Sie die Werkzeuge (Gewebe-Halter, Bürste, Zange) mit Ethanol und stellen Sie sicher, dass sie nur zu Zwecken der Dissektion und nie in Kontakt mit festen Gewebe verwendet werden. Halten sie in einem separaten Feld zur Vermeidung von Kontaminationen.</li>
	<li>Den Fisch in kaltem Eiswasser für 1 min einschläfern.</li>
	<li>
Befolgen Sie die nachfolgenden Schritte aus, um schnell die Medaka Gehirn und Hypophyse mit scharfen Zangen zergliedern (verwenden Sie nicht mehr als 3 min).
	<ol>
<li>Halten die Fische mit der starken Zange schwere die beiden Sehnerven hinter den Augen mit einer Schere oder Pinzette scharf.</li>
		<li>Öffnen Sie die dorsalen Teil des Schädels aus der hinteren an der vorderen Seite durch Brechen der Schädelknochen Schritt für Schritt mit starker Zange.</li>
		<li>Der Schädel auf der einen Seite mit starker Zange abziehen.</li>
		<li>Schwere des Rückenmarks mit einer Schere oder scharfen Zange.</li>
		<li>Sanft, das Rückenmark mit der Zange greifen, das Gehirn vom hinteren zum vorderen flip und legen Sie sie in eine Schüssel mit eiskaltem Ca2 + Kostenlose ec</li>
	</ol>
</li>
	<li>Füllen Sie eine 1,5 – 2 cm3 Metallform mit flüssige Agarose und legen Sie es auf dem Eis.</li>
	<li>Kurz bevor die Agarose (bei ca. 25 – 30 ° C) erstarrt, sanft greifen Sie das Gehirn durch das Rückenmark mit der Zange, trocknen Sie die Zange mit einem Stück feines Papier und legen Sie das Gewebe in der Agarose. Mischen Sie schnell die Agarose um die Spuren der EG Links rund um das Gewebe zu verdünnen und das Gewebe zu orientieren und lassen die Form auf dem Eis für ein paar Sekunden bis die Agarose härtet. Anmerkung: Es ist wichtig für diesen Schritt schnell sein. Die Agarose erstarrt schnell wie die Metallform durch das Eis abgekühlt ist.</li>
	<li>Schneiden Sie ein Quadrat von Agarose, enthält das Gewebe mit einer Skalpellklinge und Vibratome Probenhalter mit Chirurgie (ungiftig) Kleber aufkleben.</li>
	<li>Füllen Sie die Küvette der Vibratome erhalten (Gehirn-Hypophyse) Probenhalter mit eiskalten Ca2 + kostenlose EG.</li>
	<li>Probenhalter in der Vibratome und schneiden Sie die Agarose-Block um parasagittalen Abschnitte von 150 µm, mit hoher Frequenz und niedriger Drehzahl für den Schnitt zu machen. Sammeln Sie die ausgewählten Abschnitte zu und legen Sie sie in die Patch-Clamp-Aufnahme-Kammer mit 3 mL eiskaltes Ca2 + kostenlose EG</li>
	<li>Legen Sie die Raster-Harfe (Abbildung 2B) auf dem Gewebe. Hinweis: Die Harfe wird zusammen mit der Beschichtung stabilisieren das Gewebe und verhindern, dass es während der Patch-Clamp-Aufnahmen bewegt.</li>
	<li>Nachdem die Harfe vorhanden ist, ändern Sie die Ca2 + freie EG Mitte in der normalen EG mit Ca2 + und BSA. Lassen Sie die Gewebe 10 min ruhen.</li>
</ol>(3) perforiert, Patch-Clamp und elektrophysiologische Aufnahmen
<ol><li>Vor Beginn des Experiments, Chlorid Silber Draht Elektroden mit den folgenden Schritten: zunächst ein feines Schleifpapier (p180) verwenden, um die Silberdraht-Elektroden reinigen. Zweitens mit 2 mL 70 % igem Ethanol spülen. Drittens: Tauchen Sie die Drähte in 2 mL, 2 – 5 % Chlor für 10 min. Zu guter Letzt spülen Sie mit 2 mL, hochreine H2O.</li>
	<li>Legen Sie die Aufnahme Kammer mit der Gehirn-Hypophysen-Scheibe in den Mikroskoptisch und suchen Sie den Zielbereich (Hypophyse) mit 10 X-Objektiv und Inspizieren Sie die Zellen mit 40 X Objektiv. Hinweis: Wenn die Vorbereitung erfolgreich ist, sollte sehr wenige Rundzellen sichtbar sein. Diese Runde Zellen sind in der Regel beschädigte Zellen, die aus dem Gewebe lösen werden.</li>
	<li>Legen Sie die Erdung Elektrode durch die 2 % Agar-Brücke in das EG-Bad.</li>
	<li>Suchen Sie eine gesunde Zelle mit 40 X Objektiv. Hinweis: Eine gesunde Zelle sollte fest an das Gewebe Slice und nicht aufgerundet und losgelöst von der Scheibe.</li>
	<li>Einstellen des Verstärkers in Voltage-Clamp (VC; Abbildung 4A Nummer 1) Modus. Offenen testen die Dichtung Fenster und drücken Sie das Bad Konfiguration (Abbildung 4 b Punkt 1 und 2. Nutzen Sie ein 5-mV Pulse Pipette Widerstand (Abbildung 4 b Ziffer 3) zu überwachen.</li>
	<li>Abgleich der Patch PIPETTENSPITZE mit Antimykotika kostenlose IC-Lösung vor dem Hinzufügen der IC-Lösung mit Amphotericin B mit einer Mikro-Füller-Spritze (siehe Abbildung 3).</li>
	<li>Fügen Sie einen leicht positiver Luftdruck in der Patch-Pipette mit 1 mL Spritze. Hinweis: Dadurch wird eine kleine Flüssigkeitsstrom aus der Patch-Pipette, die Vermeidung von Kontaminationen der Spitze.</li>
	<li>Einmal in der Badewanne, bewerten Sie den Patch Pipette Widerstand zu und stellen Sie sicher, dass keine Partikel an der Spitze der Pipette (Abbildung 4) verbunden sind. Hinweis: Ein kleines Stück Klebeband ist auf den Monitor Anzeige der video-Aufnahme-Form das Sichtfeld angebracht. Dies macht die Positionierung der Patch Pipette relativ Zelle einfacher wenn das Ziel nicht auf die Zelle richtet.</li>
	<li>Führen Sie die Patch-Pipette auf die Zelle mit Mikromanipulatoren. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Pipette ist sauber von der Suche nach kleinen Teilchen, die an der Spitze der Pipette angebracht haben können. Plötzliche Änderungen im Widerstand möglicherweise auch eine Folge der Partikel in der Pipettenspitze stecken.</li>
	<li>Passen Sie die Pipette, wenn wenige Mikrometer über der Zelle damit die Spitze der Pipette die Zelle 1/3 von der Mitte der Zelle, berühren wird, wie in Abbildung 5dargestellt. Wenn die Zelle berühren, lassen Sie den Druck und gelten Sie die sanfte Saugwirkung um eine Dichtung zu machen. Hinweis: Die Zeit aus der Patch-Pipette betritt das Bad zu einem erfolgreichen Dichtung sollte so kurz wie möglich gehalten werden. Nicht mehr als 1 – 1,5 min zur Vermeidung von Amphotericin B erreichen die Spitze der Pipette und Leck in die Wanne.</li>
	<li>Sofort wechseln Sie zum Fenster " Patch " in der Patch-Clamp-Software (Abbildung 4 D Punkt 1) und haben Sie eine Holding Potential zwischen-50 und-60 mV (Abbildung 4 Punkt 2). NULL heraus aus der Glaspipette (Abbildung 4 Punkt 3) die schnelle Kapazität zusammensetzt.</li>
	<li>Wechseln Sie in die Zelle -Fenster in Patch-Clamp-Software (Abbildung 4E Punkt 1 und 2) und starten Sie die Überwachung Zugang Widerstand, Ra, erscheint im Fenster. NULL, die Kapazität der Membran in der Verstärker-Software (Abbildung 4E Punkt 3) nach ausreichender Zugang. Hinweis: Ausreichender Zugang dauert 10 bis 30 min (Abbildung 4E Punkt 2). Ein guter Zugang zur aktuellen Klemme Aufnahmen sollte unter 20 M liegen.</li>
	<li>Wechseln Sie zur zangenstromwandler, IC, in Verstärker Software-Fenster (Abbildung 4F Punkt 1). Passen Sie die schnell-kapazitive Ströme im Fenster Klemme der Verstärker Software (Abbildung 4F Punkt 2 und 3) auf den gleichen Wert wie in 3.12. Überprüfen Sie die Membran Potenzial (Abbildung 4F Punkt 1). Hinweis: Wichtig ist, wenn das Membranpotential seicht ist (typische über-35 mV) die Zelle beschädigt werden. Die Aufnahme abbrechen und eine neue Zelle zu finden.</li>
	<li>Nach der Suche nach einer gesunden Zelle (fest des Gewebes mit Membranpotential unter-40 mV), beginnen die experimentelle Aufnahmen wie in des Herstellers Protokoll 33,34.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben

Elektrophysiologische Aufnahmen mit der Patch-Clamp-Technik auf Gehirn-Hypophysen Scheiben benötigen sorgfältige Optimierung. Gut optimierte Protokolle für Leben-Zelle Untersuchungen insbesondere umkonstruiert beschränken sich die meisten Publikationen mit Protokollen auf Basis von Säugetier-Systemen. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, die Tatsache, dass mehrere physiologische Parameter wie pH-Wert und Osmolalität kennen nicht nur Arten angewiesen, aber auch sehr stark abhängig ob der betreffende Organismus le...

Die Hypophyse ist ein wichtiger endokrine Organ bei Wirbeltieren unterhalb des Hypothalamus und posterior, die Optik Chiasmus. Es produziert und sondert sechs bis acht Hormone aus der spezifischen Zelltypen. Hypophyse Hormone bilden ein Zwischenprodukt zwischen Gehirn und periphere Organe und fahren zahlreiche essentielle physiologische Prozesse einschließlich Wachstum, Fortpflanzung und Regelung der Homöostase. Ähnlich wie bei Neuronen, endokrinen Zellen der Hypophyse sind elektrisch erregbare mit der Fähigkeit, spontan Aktionspotentiale abzufeuern 1. Die Rolle der diese Aktionspotentiale ist Zelle angewiesen. In verschiedenen Zelltypen der Säugetier-Hypophyse können Aktionspotentiale der intrazellulären Ca2 + ausreichend für ein verzögerter Freisetzung des Hormons 2erheben. Darüber hinaus erhält die Hypophyse stimulierende und hemmende Informationen aus dem Gehirn, das das Membrane Potential der Zellen 3,4,5,6betrifft. In der Regel stimulierende Eingang erhöht die Erregbarkeit und oft beinhaltet die Freisetzung von Ca2 + von intrazellulären speichern sowie erhöhte Frequenz 7feuern. Verstehen, wie die Zelle nutzt die Ionen-Kanal-Komposition und passt sich diese Signale aus dem Gehirn ist Schlüssel zum Verständnis der hormonsynthese und Freigabe.
Die Patch-Clamp-Technik wurde in den späten 1970er Jahren von Sakmann und Neher 8,9,10 entwickelt und weiter verbessert, indem Hamill 11, und ermöglicht detaillierte Untersuchungen der elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen bis auf einzelne Ionenkanäle. Darüber hinaus kann die Technik verwendet werden, für das Studium von Strom und Spannung. Patch-Klemmung ist heute der Goldstandard für die Messung von elektrophysiologischer Eigenschaften der Zelle. Vier wichtige Konfigurationen von dicht-Patch-Clamp-Technik wurden entwickelten 11; der Zelle angebracht, Inside-Out, die außen-Out und die gesamte Zelle Patch. Die drei ersten Konfigurationen sind in der Regel für einzelne Ionen-Kanal Untersuchungen verwendet. Für die vierte, von der Zelle-attached Konfiguration wird ein Loch in der Zellmembran mit Sub-atmosphärischen Druck hergestellt. Diese Konfiguration ermöglicht auch Untersuchungen der Ionen-Kanal Zusammensetzung der ganzen Zelle 12. Eine Einschränkung dieser Technik ist jedoch, dass zytoplasmatischen Moleküle durch den Patch Pipette Lösung 13 (Abb. 1A), was sich auf die elektrische und physiologischen Reaktionen der untersuchten Zellen verdünnt werden. In der Tat können einige von diesen Molekülen eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion des Signals oder bei der Regulierung der verschiedenen Ionenkanäle spielen. Um dies zu vermeiden, Lindau und Fernandez 14 eine Methode entwickelt, wo eine Pore-forming Verbindung zu den Patch-Pipette hinzugefügt. Im Anschluss an die Zelle-attached Konfiguration wird die Verbindung in der Plasmamembran unter den Patch integrieren und langsam Perforieren die Membran Erstellung elektrischen Kontakt mit dem Zytosol (Abbildung 1B). Mehrere verschiedene Antimykotika wie Nystatin 15 und Amphotericin B 16oder Tenside wie Saponin Beta-Aescin 17,18 können verwendet werden. Diese Verbindungen erstellen Poren groß genug, um monovalente kationen und Cl– Diffusion zwischen dem Cytosol und die Patch-Pipette unter Beibehaltung der cytosolischen Ebenen von Makromolekülen und größeren Ionen wie Ca2 + 15zu ermöglichen, 16.
Die Herausforderung der Verwendung von perforierten Patch ist der potenziell hohen Reihenwiderstand. Vorwiderstand (R-s) oder Zugang Widerstand ist der Gesamtwiderstand über die Patch-Pipette im Verhältnis zum Boden. Während Patch-Clamp-Aufnahmen, die R-s werden parallel mit Membran-Widerstand (Rm). Rm und Rs in Parallele Arbeit als Spannungsteiler. Mit dem hohen R-s, fällt die Spannung über die R-s geben Fehler in den Aufnahmen. Der Fehler wird mit größeren Strömungen erfasst größer geworden. Darüber hinaus ist der Spannungsteiler auch frequenzabhängig einen Tiefpass-Filter, was sich auf die zeitliche Auflösung zu schaffen. In der Tat kann der perforierten Patch nicht immer zulassen Aufnahmen von großen und schnellen Strömungen wie die Spannung Na+ Strömungen Gated (für detaillierte Messwerte Referenz 19 Siehe) Rs kann auch während der Patch-Clamp-Aufnahmen, wieder führt zu Veränderungen in den aufgenommenen Strom variieren. So können Fehlalarme in Situationen auftreten wo Rs während der Zulassungsantrag ändert.
Die Elektrophysiologie auf das geschnittene Gewebe wurde erstmals von Andersen-Lab, elektrophysiologische Eigenschaften der Nervenzellen im Gehirn 20zu studieren. Die Technik ebnete den Weg für detaillierte Untersuchungen der Einzelzellen sowie Zellezelle Kommunikation und Zelle Schaltungen in einem mehr intakten Umwelt. Eine ähnliche Technik für die Herstellung von Hypophyse Scheiben wurde von Guérineau Et Al. 1998 eingeführt. 21. es war jedoch nicht vor 2005 wurde dieser Gehirn-Hypophysen Slice-Vorbereitung für Patch-Clamp-Studien in teleost 22erfolgreich eingesetzt. In dieser Studie berichteten die Autoren auch die Verwendung von perforierten Patch-Clamp-Aufnahmen. Allerdings wurden bei weitem die meisten elektrophysiologischen Untersuchungen der Hypophysen Zellen bei Säugetieren, und nur eine Handvoll anderer Wirbeltiere, einschließlich teleost Fische 1,2,22,23 durchgeführt . Im umkonstruiert wurden fast alle Studien am primären dissoziierten Zellen 24,25,26,27,28,29,30 durchgeführt. .
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Zubereitung von gesunden Gehirn-Hypophysen-Scheiben aus dem Modell Fisch Medaka. Der Ansatz stellt mehrere Vorteile im Vergleich zu primären dissoziierten Zellkulturen. Zuerst werden die Zellen in einer relativ geschützten Umgebung im Vergleich zu Zelle Kulturbedingungen getrennt erfasst. Zweitens erlauben Slice Vorbereitungen uns indirekte Wege vermittelt durch Zell-Zell-Kommunikation- 22, das ist nicht möglich in dissoziierten Zelle Kulturbedingungen zu untersuchen. Darüber hinaus führen wir elektrophysiologische Aufnahmen auf die erhaltenen Gewebe-Scheiben mit perforierten ganze Zelle Patch-Clamp-Technik mit Amphotericin B als die porenbildner durchzuführen.
Medaka ist eine kleine Süßwasserfische aus Asien, vor allem in Japan gefunden. Physiologie, Embryologie und Genetik von Medaka wurden für mehr als 100 Jahren 31ausgiebig untersucht, und es ist eine häufig verwendete Forschungsmodell in vielen Laboratorien. Für dieses Papier von besonderer Bedeutung ist die deutliche morphologische Organisation der Hypothalamus-Hypophysen-Komplex in teleost Fische: während in Säugetiere und Vögel der Hypothalamus Neuronen ihre Neuro-Hormone regulieren Hypophyse endokrine Zellen freigeben in das Portal die mediane Eminenz ist eine direkte nervöse Projektion des Hypothalamus Neuronen auf die endokrinen Zellen der Hypophyse in teleost Fische 32. Deshalb sorgfältig durchgeführte Gehirn-Hypophysen Schneiden von besonderer Bedeutung in Fisch, ermöglicht es uns, elektrophysiologische Eigenschaften der Hypophysen Zellen in einem gut erhaltenen Gehirn-Hypophysen-Netzwerk und insbesondere wie Hypophysen Zellen untersuchen Steuern Sie ihre Erregbarkeit und damit Ca2 + Homöostase.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgical glue</td><td>WPI</td><td>VETBOND</td><td>3M Vetbond Tissue Adhesive</td></tr><tr><td>Stainless steel blades</td><td>Campden Instruments</td><td>752-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>metal molds</td><td>SAKURA</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>steel harp</td><td>Warner instruments</td><td>64-1417</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure LMP agarose</td><td>invitrogen</td><td>166520-100</td><td></td></tr><tr><td>patch pipettes</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-110-10HP</td><td>Borosilicate with filament O.D.:1.5 mm, I.D.:1.10 mm</td></tr><tr><td>Microscope Slicescope</td><td>Scientifica</td><td>pro6000</td><td></td></tr><tr><td>P-Clamp10</td><td>Molecular Devices</td><td>#1-2500-0180</td><td>sofware</td></tr><tr><td>Digitizer Digidata 1550A1</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1550</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td></td></tr><tr><td>GnRH</td><td>Bachem</td><td>4108604</td><td>H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>amphotericin B</td><td>SIGMA</td><td>A9528</td><td>pore-forming antibiotic</td></tr><tr><td>polyethylenimine&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P3143</td><td>50% PEI solution</td></tr><tr><td>microfiler syringe</td><td>WPI</td><td>MF28/g67-5</td><td></td></tr><tr><td>glass for the agar bridge</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF200-116-15</td><td>Borosilicate with filament O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm Fire polished</td></tr><tr><td>Micro-Manager software</td><td></td><td></td><td>Open Source Microscopy Software</td></tr><tr><td>optiMOS sCMOS camera</td><td>Qimaging</td><td>&amp;nbsp;01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td></td></tr><tr><td>sonicator</td><td>Elma</td><td>D-7700 singen</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SiGMA</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SiGMA</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SiGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>SiGMA</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SiGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SiGMA</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SiGMA</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>SiGMA</td><td>63565</td><td></td></tr><tr><td>MES-acid</td><td>SIGMA</td><td>M0895</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish

Elektrophysiologische Untersuchungen der Hypophysen Zellen wurden in zahlreichen Wirbeltierarten, aber nur sehr wenige in den teleost Fischen durchgeführt. Unter diesen sind die klare Mehrheit an dissoziierten Primärzellen durchgeführt worden. Um zu einem besseren Verständnis der wie teleost Hypophysen Zellen, in einem mehr biologisch relevante Umfeld Verhalten, veranschaulicht dieses Protokolls lebensfähige Gehirn-Hypophysen-Scheiben mit kleinen Süßwasserfische Medaka (Oryzias Latipes) vorzubereiten. Machen die Gehirn-Hypophysen-Scheiben, wurden pH-Wert und Osmolalität aller Lösungen auf Werte in Körperflüssigkeiten von Süßwasserfischen Leben bei 25 bis 28 ° c eingestellt Nach Vorbereitung der Scheibe veranschaulicht das Protokoll führen elektrophysiologische Aufnahmen mit perforierten ganze Zelle Patch-Clamp-Technik. Die Patch-Clamp-Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, mit noch nie da gewesenen zeitlicher Auflösung und Empfindlichkeit, so dass die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von intakten ganze Zellen bis auf einzelne Ionenkanäle. Perforierten Patch ist einzigartig, da es hält die intrazelluläre Umwelt intakt zu verhindern, dass sich regulatorische Elemente in das Zytosol durch die Patch-Pipette-Elektrode-Lösung verdünnt wird. Im Gegensatz dazu wurde bei der gesamten Zelle Bauform es beobachtet, dass Medaka Hypophysen Zellen schnell ihre Fähigkeit verlieren, Aktionspotentiale abzufeuern. Unter den verschiedenen Perforation-Techniken veranschaulicht dieses Protokoll zu Perforation der gepatchten Membran mit Fungizid Amphotericin b.

Dieses Protokoll zeigt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll wie zuverlässige elektrophysiologische Aufnahmen aus Zellen der Hypophyse (Gonadotrope), mit einer Medaka transgene Linie [Tg (Lhb- HrGfpII)], wo Zellen das Ziel (Gonadotropine Lh-Produktion) mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP) beschriftet sind.
Zunächst wurden die elektrophysiologischen Untersuchungen mit ganz-Zell Konfiguration durchgeführt. Jedoch wur...

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Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Der Artikel beschreibt eine optimierte Protokoll für machen lebensfähigen Gehirn-Hypophysen Gewebe Scheiben schneiden, mit den teleost Fische Medaka (Oryzias Latipes), gefolgt von elektrophysiologischen Aufzeichnungen von Hypophysen Zellen mithilfe der Patch-Clamp-Technik mit der perforierten Patch Konfiguration.

Gesundes Gehirn-Hypophysen-Scheiben für Elektrophysiologische Untersuchungen der Hypophysen Zellen in Teleost Fische

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

healthy-brain-pituitary-slices-for-electrophysiological

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.7K Aufrufe.  Norwegian University of Life Sciences. Der Artikel beschreibt eine optimierte Protokoll für machen lebensfähigen Gehirn-Hypophysen Gewebe Scheiben schneiden, mit den teleost Fische Medaka (Oryzias Latipes), gefolgt von elektrophysiologischen Aufzeichnungen von Hypophysen Zellen mithilfe der Patch-Clamp-Technik mit der perforierten Patch Konfiguration.

Serie: Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

Branchial ionocytes (ICs) are the functional units for ionic regulation in fish. In adults, they are found on the filamental and lamellar epithelia of the gill where they transport ions such as Na+, Cl- and Ca2+ via a variety of ion channels, pumps and exchangers. The teleost gill is extrinsically innervated by the facial (VI), glossopharyngeal (IX) and vagus (X) nerves. The IX and X nerves are also the extrinsic source of branchial IC innervation. Here, two techniques used to study the innervation, proliferation and distribution of ICs are described: a time differential staining technique and a full bilateral gill denervation technique. Briefly, goldfish are exposed to a vital mitochondrion-specific dye (e.g., MitoTracker Red) which labels (red fluorescence) pre-existing ICs. Fish were either allowed to recover for 3 - 5 days or immediately underwent a full bilateral gill denervation. After 3 - 5 days of recovery, the gills are harvested and fixed for immunohistochemistry. The tissue is then stained with an &#945;-5 primary antibody (targets Na+/K+ ATPase containing cells) in conjunction with a secondary antibody that labels all (both new and pre-existing) ICs green. Using confocal imaging, it was demonstrated that pre-existing ICs appear yellow (labelled with both a viable mitochondrion-specific dye and &#945;-5) and new ICs appear green (labelled with &#945;-5 only). Both techniques used in tandem can be applied to study the innervation, proliferation and distribution of ICs on the gill filament when fish are exposed to environmental challenges.

This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.

A Time Differential Maltechnik mit Full Bilaterale Gill Denervation Gekoppelt an Ionocytes in Fish Studieren

Branchial ionocytes (ICs) are the functional units for ionic regulation in fish. In adults, they are found on the filamental and lamellar epithelia of the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-Clamp Kapazitätsmessungen und Ca 2 + Imaging bei Single Nervenendigungen in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Neurowissenschaften

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Vorderhirn Elektrophysiologische Aufzeichnung im Larven Zebrafisch

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

Langfristige Verhaltens Verfolgung von Frei Schwimmen Schwach elektrische Fische

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one of the first organs to start functioning during development. Mechanisms of blood vessel formation have become a subject of high scientific and clinical interest. In adults however, it is difficult to visualize the vasculature in most living animals due to their localization deep within other tissues. Nevertheless, visualization of blood vessels remains important for several studies such as endocrinology and neurobiology. While several transgenic lines have been developed in zebrafish, with blood vessels directly visualized through expression of fluorescent proteins, no such tools exist for other teleost species. Using medaka (Oryzias latipes) as a model, the current protocol presents a quick and direct technique to label blood vessels in brain and pituitary by perfusing through the heart with fixative containing DiI. This protocol allows improvement of our understanding on how brain and pituitary cells interact with blood vasculature in whole tissue or thick tissue slices.

The article describes a quick protocol for labeling blood vessels in a teleost fish by cardiac perfusion of DiI diluted in fixative, using medaka (Oryzias latipes) as a model and focusing on brain and pituitary tissue.

Kennzeichnung von Blutgefäßen im Teleost Gehirn und Pituitary mit Herz-Perfusion mit einem DiI-Fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Biotechnik

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled environment. Despite vast differences in the physiology between mammals and fish, primary cell culture protocols from fish are often based on mammalian culture conditions, often with only minor modifications. The environmental differences affect not only body temperature, but also blood serum parameters such as osmolality, pH, and pH buffer capacity. As cell culture media and similar working solutions are meant to mimic characteristics of the extracellular fluid and/or blood serum to which a cell is adapted, it is crucial that these parameters are adjusted specifically to the animal in question.
The current protocol describes optimized primary culture conditions for medaka (Oryzias latipes). The protocol provides detailed steps on how to isolate and maintain healthy dissociated pituitary cells for more than one week and includes the following steps: 1. the adjustment of the osmolality to the values found in medaka blood plasma, 2. the adjustment of the incubation temperature to normal medaka temperature (here in the aquarium facility), and 3. the adjustment of the pH and bicarbonate buffer to values comparable to other fish species living at similar temperatures. The results presented using the described protocol promote physiologically meaningful results for medaka and can be used as a reference guide by scientists making primary cell cultures from other non-mammalian species.

Here we describe a protocol to prepare and maintain primary pituitary cell cultures from medaka (Oryzias latipes). The optimized conditions in this protocol take important parameters such as temperature, osmolality, and pH into consideration by mimicking the physiological conditions of the fish, thereby enabling physiologically more meaningful results.

Vorbereitung einer qualitativ hochwertigen Primärzelle Kultur von Fisch Hypophysen

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain activity from freely moving fish would advance research on the neural basis of fish behavior considerably. Moreover, precise control of the recording location in the brain is critical to studying coordinated neural activity across regions in fish brain. Here, we present a technique that records wirelessly from the brain of freely swimming fish while controlling for the depth of the recording location. The system is based on a neural logger associated with a novel water-compatible implant that can adjust the recording location by microdrive-controlled tetrodes. The capabilities of the system are illustrated through recordings from the telencephalon of goldfish.

A novel wireless technique for recording extracellular neural signals from the brain of freely swimming goldfish is presented. The recording device is composed of two tetrodes, a microdrive, a neural data logger, and a waterproof case. All parts are custom-made except for the data logger and its connector.

Drahtlose elektrophysiologische Aufzeichnung von Neuronen durch bewegliche Tetrodes in frei schwimmenden Fischen

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...