우리 임상 Hemostaseology 연구소 및 수혈 의학 기증자 혈액;를 제공 하기 위한 감사 합니다. 카르멘 Hässig 및 우수한 기술 지원에 대 한 코 라 호자. 우리 LifeAct mEGFP 구조를 생성 하기 위한 수정된 pMAX 벡터에 대 한 옌스 Rettig (자를란트 대학), 롤랜드 Wedlich-용 병 (뮌스터 대학) 원래 LifeAct-루비 구문 및 기독교 고물 (자를란트 대학) 감사 합니다. 이 프로젝트는 Sonderforschungsbereich 1027 (B.Q. 프로젝트 A2)와 894 (수소 프로젝트 a 1)에 의해 투자 되었다. 빛-시트 현미경 DFG에 의해 투자 되었다 (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

인간의 재료 (인간의 혈액 기증자 로부터 백혈구 감소 시스템 실)와 함께이 연구를 위해 실시 하는 연구 승인 지역 윤리 위원회 (16.4.2015 (84/15;에서 선언 교수 박사 Rettig Stürmer))와 해당 지침을 따릅니다.
1. 중화 콜라겐 솔루션의 준비 (500 µ L)
<ol><li>셀 문화 후드 무 균 1.5 mL 튜브에 냉장된 콜라겐 재고 솔루션 (10.4 mg/mL)의 400 µ L를 전송. 천천히의 50 µ L 냉장 10 x PBS (pH 7.0-7.3) 냉장된 콜라겐 재고 솔루션의 400 µ L 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 타일링 하 여 솔루션을 믹스. 참고: 1 부의 모든 단계는 셀 문화 후드 행해져야 한다.</li>
	<li>1.1에서 콜라겐 솔루션의 500 µ L로 0.1 M NaOH의 8 µ L를 추가 합니다. pH 7.2-7.6를 조정 하려면 PH 시험 지구를 사용 하 여 (pH 범위: 6-10) 혼합물의 pH 값을 확인 하. 참고: 볼륨 콜라겐의 다른 일괄 처리에 대 한 달라질 수 있습니다. NaOH 솔루션을 공기 방울을 피하기 위해 천천히 혼합 될 수 있다. 혼합물을 콜라겐 겔 화를 피하기 위해 얼음에 보관 한다.</li>
	<li>추가 2 µ L 살 균 ddH2O 500 µ L. 최종 볼륨을 잘 섞어 또는 및 저장이 콜라겐 솔루션 (8.32 mg/mL) 얼음에 4 ° C에서 사용까지. 참고:이 조건 하에서 중화 콜라겐 사용할 수 있습니다 24 h. 위해 Aliquots 공기 방울을 피하기 위해 권장 하지 않습니다.</li>
</ol>2. 샘플 준비 빛 시트 형광 현미경 검사 법 모 세관을 사용 하 여
<ol><li>앞에서 설명한 대로 붙일 원하는 기본 형광 염료15 또는 형광 단백질11 관심의 라이브 셀 라벨.</li>
	<li>1 × 106 셀의 셀 문화 후드 무 균 1.5 mL 튜브에 전송 합니다. 원심 8 분 삭제에 대 한 200 x g에 튜브는 상쾌한 고 문화 매체의 200 µ L에 펠 릿을 resuspend. 참고: 5 × 106 셀/mL의 셀 밀도 인간의 면역 세포 이동, 세포 독성 T 세포 (CTL)과 자연 킬러 (NK) 세포의 시각화에 대 한 것이 좋습니다.</li>
	<li>1.3에서 중화 콜라겐 솔루션의 85.9 µ L를 추가 합니다. 에 세포 현 탁 액 2.2에서. 그리고 제대로 2.5 mg/mL의 콜라겐 농도 도달 하는 혼합. 후드에 얼음에 셀/콜라겐 혼합을 둡니다. 참고: 콜라겐의 원하는 농도 N mg/mL 이면 가정의 볼륨 무력화 (200 µ L 세포 현 탁 액)에 대 한 콜라겐 솔루션 = 200 × N /(8.32-N)</li>
	<li>다음, 모 세관에 넣고 일치 플런저 (내부 직경 ~ 1 mm) 플런저는 모 세관에서 1 m m까지. 문화 매체 (그림 1A)로 담거 서 플런저를 젖은. 참고:이 단계는 모 세관 셀/콜라겐 혼합으로 감소 때 기포를 방지 하기 위해 도울 수 있었다. 모 세관 및 플런저 살 균 될 필요가 없습니다.</li>
	<li>2.3에서 셀/콜라겐 혼합으로 모 세관을 찍어. 천천히 다시 10-20 m m (그림 1B)에 대 한 플런저를 당겨. 70% 에탄올 스프레이 나머지 콜라겐 솔루션 제거를 적신 종이 타월로 모 세관의 외부 벽을 닦으십시오.</li>
	<li>5 mL 튜브의 내부 벽에 클레이 모델링 모 세관을 탑재 하 고 모 세관 (그림 1C)의 가장자리에 셀/콜라겐 혼합을 밀어.</li>
	<li>5% CO2 콜라겐 합 1 h 37 ° C에서 모 세관을 유지.</li>
	<li>5 mL 튜브를 배양 (약 1-2 mL)를 추가 합니다. 신중 하 게 약 3/4 매체 (그림 1D)에 걸려 콜라겐의 중간에 밖으로 생산 콜라겐 로드를 누릅니다.</li>
	<li>모 세관,이, 같은 매체를 가진 교원 질 막대 equilibrate 또 다른 30 분 5% CO2 와 37 ° C에서 유지. 참고: 나중에, 콜라겐 막대 수 수 철수 모 세관 그리고 경작에 더 사용 하기 전에 추가.</li>
</ol>3. 이미지 수집 빛 시트 현미경을 사용 하 여
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 샘플 챔버 어셈블리입니다.</li>
	<li>보육 및 현미경 시료 챔버 (라이브 셀 이미징만)에 대 한 37 ° C에가 열을 켭니다.</li>
	<li>시료 챔버에서 모 세관을 놓고 이미지 수집에 대 한 관심의 영역을 찾아 샘플을 찾습니다.</li>
	<li>해당 laser(s)를 활성화 합니다. 다음 설정을 설정: 레이저 전원, 노출 시간, 단계-z-스택, 시작 위치와 끝 위치 z-스택, 그리고 라이브 셀 이미징에 대 한 시간 간격의 크기. 참고: 예를 들어 그림 2 의 샘플은 몇 군데 모든 40 단계-1 µ m의 크기와 37 ℃에서 6 h s (총 두께: 538 µ m). 레이저 파워 노출 시간 30 양 x-y 방향에서 픽셀 크기의 1%는 0.23 µ m 이었다.</li>
	<li>이미지 수집을 시작 합니다.</li>
</ol>4. 자동 분석 추적
<ol><li>파일 변환기를 열고, 파일 추가 (*.ims) 소프트웨어 파일 형식으로 변환할 이미지 파일 선택을 클릭 합니다. 찾아보기 를 클릭 하 고 변환 된 파일을 저장할 폴더를 선택 합니다. 모든 시작을 클릭 합니다.</li>
	<li>분석 소프트웨어를 엽니다. 클릭 능가합니다. 파일 에 가십시오 오픈, 클릭 다음 이미징 파일 분석을 선택 합니다. 참고: 파일 크기가 큰 경우이 단계 시간을 걸릴 수 있습니다. 1 테라바이트 (TB) 보다 큰 파일 권장 하지 않습니다 하나의 실험에 대 한 프로세스와 같은 큰 파일은 매우 계산 용량 요구.</li>
	<li>새로운 관광 명소를 추가클릭 합니다. 프로세스 전체 이미지 마지막으로상자를 확인 하십시오. 다음을 클릭 합니다.</li>
	<li>입력 x 좌표와 y (픽셀)에 관심 영역을 정의 하. (시간 및 z 위치) 분석 프레임 수를 입력 합니다. 다음을 클릭 합니다.</li>
	<li>소스 채널의 드롭다운 목록에서 추적할 개체를 포함 하는 대상 채널을 선택 합니다. 입력 예상 xy 직경 (µ m). 다음을 클릭 합니다. 참고: 예상된 xy 직경 추적할 개체의 x-y 차원에서 평균 지름이입니다.</li>
	<li>품질을 클릭 합니다. 있는 셀 (개체)의 대부분은 포함 되어야 하는 임계값을 설정 합니다. 다음을 클릭 합니다.</li>
	<li>원하는 알고리즘 (회귀 모션 권장)을 선택 합니다. 입력 하는 최대 거리 (20 µ m 권장)와 최대 간격 크기 (3 또는 2 권장). 프로세스 전체 이미지를 마지막으로클릭 합니다. 참고: 최대 거리 와 최대 간격 크기 트랙 휴식 두 임계값은. 좀 더 구체적으로, 두 개의 연속 프레임에서 동일한 개체 사이의 거리 최대 거리를 초과 하는 때 나중 프레임에이 개체 간주 됩니다 새 개체로. 가끔 중, 같은 개체 수 있습니다 몇 프레임 사라지고 다시 나타난다. 이 경우에, 최대 간격 크기 내에서이 개체가 다시 나타납니다 경우에 그것은 동일한 개체도 간주 될 것 이다.</li>
	<li>필터 형식 을 클릭 하 고 원치 않는 트랙을 제외 하는 옵션을 선택 합니다. 참고:이 단계는 선택 사항입니다.</li>
	<li>다음 을 클릭 한 다음 마침을 클릭 합니다. 참고:이 단계는 일 컴퓨팅 성능에 따라 시간을 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>트랙 편집 을 클릭 하 고 올바른 드리프트를 선택 합니다. (변환 드리프트 권장) 적절 한 알고리즘을 선택 합니다. 원하는 결과 데이터 집합 크기 를 선택 합니다 (새 크기와 같은 현재 크기 권장). 확인을 클릭 합니다. 참고:이 단계는만 콜라겐 이미지 중 떠내려 때 필요한.</li>
	<li>통계 를 클릭 하 고 구성의 표시 통계 값 목록을선택 합니다. 관심의 옵션을 수출 (예: 좌표, 속도 및 등) 확인 하십시오. 확인을 클릭 합니다.</li>
	<li>파일 내보내기 모든 통계 를 클릭 하 고 파일 이름을 입력 합니다.</li>
</ol>5. 고정 및 면역 형광 콜라겐 매트릭스 셀의 얼룩
<ol><li>화학 후드 5 mL 튜브에 4 %paraformaldehyde (PFA, PBS)의 1000 µ L를 전송 합니다. 참고: PFA 실내 온도 균형 해야 합니다.</li>
	<li>2.9에서 생산 콜라겐과 모 세관을 찍어. PFA 솔루션으로 (대 한 ~ 5 m m) ( 그림 1C에서 같이) 클레이 모델링 5 mL 튜브의 내부 벽에는 모 세관을 탑재.</li>
	<li>PFA 솔루션 (그림 1D)에 매달려 콜라겐 로드의 절반 때까지 플런저를 살짝 누릅니다. 20 분 동안 실내 온도에 튜브를 유지.</li>
	<li>다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. 모 세관을 꺼내와 PFA 삭제.</li>
	<li>신선한 관으로 모 세관을 탑재 하 고 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 모 세관은 PBS에 몰입은 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>교원 질 막대의 절반은 솔루션에 매달려 때까지 플런저를 살짝 누릅니다. 클레이 모델링 내부 벽에는 모 세관을 탑재 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 실내 온도에 튜브를 유지.</li>
	<li>5.4를 반복 합니다. -또 다른 2 시간 동안 5.7입니다.</li>
	<li>다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. PBS를 삭제 합니다. 차단/permeabilization 버퍼 (PBS + 1 %BSA + 0.1% 비 이온 계면 활성 제)의 1-2 mL 튜브에 전송 하 고 5.6를 반복 합니다. 참고: BSA (1%) 5% 보조 Ab에서 발생 하는 동물의 혈 청으로 교체할 수 있습니다.</li>
	<li>30-60 분 동안 실내 온도에 튜브를 유지.</li>
	<li>다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. Permeabilization 버퍼를 삭제 합니다. 차단/permeabilization 버퍼에 1 차적인 항 체의 200-500 µ L를 전송 하 고 솔루션으로 막대를 퇴 학 시켜도.</li>
	<li>1 시간에 대 한 실 온에서 튜브를 유지.</li>
	<li>5.4에 설명 된 대로 3 번 PBST (PBS + 0.1-% 비 이온 계면 활성 제)와 함께 교원 질 막대를 씻어. -5.8입니다.</li>
	<li>실 온에서 1 h에 대 한 차단/permeabilization 버퍼에 이차 항 체에 막대를 품 어. 빛에서 그것을 유지.</li>
	<li>5.4에 설명 된 대로 콜라겐 로드 3 회 PBS로 세척. -5.8입니다.</li>
	<li>다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. PBS 영상까지 샘플을 하십시오.</li>
	<li>3에 설명 된 대로 샘플을 검사 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro?+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration.">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).</li><li>Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimensions+in+cell+migration.">Dimensions in cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).</li><li>Krummel, M. 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저자는 금융 또는 상업적 충돌의 관심을 선언합니다.

대부분 체 외에서 분석 vivo에서 세포, 면역 세포 특히 주로 3D microenvironment을 경험 하는 반면 2D 표면, 세포 배양 배지, 페 트리 접시 또는 coverslips, 예를에 밖으로 수행 됩니다. 증거를 신흥 면역 세포의 이동 패턴 2D 및 3D 시나리오17사이 다 보여줍니다. 또한, 종양 세포의 식을 프로필은 2D 및 3D 교양 조직18,,19<sup class...

마이그레이션에 대 한 대부분 지식 세포에서 온다 2D는 일반적으로 유리 또는 플라스틱 표면 문화/이미징의 실시는1,2,3, 실험 접시. 그러나, 생리 적인 시나리오 필요, 대부분의 경우, 3D microenvironment, 기질 (ECM) 결정적인 역할을 담당 합니다. ECM 뿐만 아니라 적절 한 세포 형태를 유지 하기 위해 3 차원 구조 에센셜을 제공 하지만 또한 생존 신호 또는 많은 셀4,5 의 최적의 기능에 대 한 방향 신호를 제공 합니다. 따라서, 3D 환경이입니다 더 나은 휴대 전화 기능 및 생리 적 컨텍스트를 반영 하는 더 나은 환경에서 동작을 식별 하는 데 필요한.
인간의 신체에서 대부분 세포 면역 세포 특히 3D 시나리오에서 그들의 기능을 발휘 한다. 예를 들어 활성화 된 T 세포 순찰 조직 대상 셀에 대 한 검색, naïve T 세포 마이그레이션 기간 동안 마이그레이션 모드와 기계는 해당 하는 extracellular 적응 그들의 동족 항 원 제시 세포에 대 한 검색에서 림프절을 통해 환경3,,67. 3D 콜라겐 젤 잘 설립 하 고 잘 특징이 3D 셀 문화 시스템8,,910로 널리 사용 되었습니다. 우리의 이전 작품에서는 기본 인간의 세포 높은 모바일 0.25% 콜라겐 기반 매트릭스11약 4.8 µ m/min의 평균 속도에 마이그레이션할. 골격의 재배치는 셀 마이그레이션12에서 핵심 역할을 한다. 세포 이동의 단일 모드에만 적용 되지 않습니다 아직 위치, microenvironment, cytokines, 혈 그라디언트, 특정 마이그레이션 동작 간에 전환할 수 및 extracellular 신호는 조정 보여주는 증거를 축적 된 여러 가지 방법 3에 철새 행동입니다.
안정적으로 면역 세포 기능 및 동작을 예를 들어 마이그레이션, 돌출 형성 또는 기공을 교통 분석을 그것 큰 장점은 신속 하 고 안정적인 방식으로 상대적으로 대용량 3D 이미지를 취득할 수 있을 것입니다. 3D 영상에 대 한 최근에 개발한 빛 시트 현미경 기술 (단일 평면 조명 현미경이 라고도 함)는 만족 스러운 솔루션13,14을 제공 합니다. 이미지 수집, 동안 얇은 정적 빛 시트 샘플을 밝히는 생성 됩니다. 초점 비행기에 이렇게에서 넓은 지역 비행기에서 세포를 영향을 주지 않고 동시에 조명 될 수 있습니다. 이 기능에는 크게 감소 표백 및 photocytotoxicity 높은 수집 속도를 수 있습니다. 이 문서에서 우리 주 인간의 면역 세포 빛 시트 현미경을 사용 하 여 시각화 하는 방법 및 마이그레이션 3D 시나리오에서를 분석 하는 방법을 설명 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibricol, bovine collagen solution</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>&#160;#5133-20ML</td>
			<td>Collagen matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M NaOH Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1091381000</td>
			<td>for neutralizing Fibricol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low melting agarose</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>32821-10GM</td>
			<td>Sample preparation in low c[Col]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11348D</td>
			<td>Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11132D</td>
			<td>Activation of CTL populations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant interleukin-2</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHC0023</td>
			<td>Stimulation of cultured CTL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary solution kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-30XX</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-PFN1 antibody, rabbit, IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab124904</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A22284</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Orange Plasma membrane Stain</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C10045</td>
			<td>Fluorescent cell label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-250mL</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>018774</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS Dulbecco&#39;s phopsphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418-100G</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat &#945; Rabbit 568, IgG, rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>IF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HeraSafe KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator HERACell 150i&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5418 and 5452</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039, 3123000020, 3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-444, 89079-436, 89079-452&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>&#160;62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries 50 &#181;L</td>
			<td>VWR (Brand)</td>
			<td>613-3373</td>
			<td>Zeiss LSFM sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger for capillaries</td>
			<td>VWR (Brand)</td>
			<td>BRND701934</td>
			<td>&#34;Stamps with Teflon tip&#34; LSFM sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MColorPhast pH stips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1095430001</td>
			<td>to test pH of neutralized Fibricol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Plastipak 1mL syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>Z230723&#160;ALDRICH</td>
			<td>Alternative sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7)</td>
			<td>Play-Doh</td>
			<td>N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris file converter</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>available at http://www.bitplane.com&#160;</td>
			<td>Convert imaging files to Imaris file format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>available at http://www.bitplane.com&#160;</td>
			<td>Analysis of 3D and 4D imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet microscopy for three-dimensional visualization of human immune cells

Vivo에서, 활성화, 확산, 그리고 모든 면역 세포의 기능 림프절 이나 조직에 예를 들어 3 차원 (3D) 환경에서 발생합니다. 최신, 대부분 체 외에 시스템 셀 문화 또는 coverslips와 같은 2 차원 (2D) 표면에 의존합니다. 최적의 모방 생리 조건에 생체 외에서우리는 간단한 3D 콜라겐 매트릭스를 활용합니다. 콜라겐은 세포 외 기질 (ECM)의 주요 구성 요소 중 하나입니다 그리고 3D 매트릭스 구성에 널리 사용 되 고 있다. 3D 영상에 대 한 최근에 개발한 빛 시트 현미경 기술 (단일 평면 조명 현미경이 라고도 함)는 높은 수집 속도, 큰 침투 깊이, 낮은 표백 및 photocytotoxicity 기능입니다. 또한, 빛 시트 현미경 장기 측정을 위해 특히 유리 하다. 여기 우리는 최적화 된 프로토콜 설정 하 고 인간의 면역 세포, 예를 들어 기본 인간의 세포 독성 T 세포 (CTL)을 처리 하는 방법을 설명 하 고 라이브 셀 이미징에 대 한 빛-시트 현미경과 사용에 대 한 3D 콜라겐 매트릭스에 자연 킬러 (NK) 세포와 고정된 샘플입니다. 이미지 수집 및 세포 이동의 분석을 위한 절차 되 게 됩니다. 특히 초점 중요 한 단계 및 샘플 준비 및 데이터 분석에 대 한 요소를 강조 하기 위해 제공 됩니다. 이 프로토콜은 3D 콜라겐 매트릭스에 현 탁 액 셀의 다른 종류에 대 한 고용 수 있습니다 하 고 면역 세포에 국한 되지 않습니다.

T 세포 마이그레이션 중 돌출 형성 걸 의존 하는 매우 역동적인 프로세스입니다. 기본 인간 CTL의 돌출 형성을 시각화 하려면 우리는 뚜렷이11전에 설명한 대로 CTL에 말라 골격을 mEGFP 융합 단백질 페. Transfection, 후에 1 일 셀 콜라겐 매트릭스에 포함 했다. 이미지 스택 인수 했다 모든 40 단계-빛-시트 현미경을 사용 하 여 37 ° C에서 1 µ m의 크기와 함께 s. 같?...

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Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

인간의 면역 세포의 3 차원 시각화를 위한 빛 시트 현미경

여기, 선물이 빛 시트 현미경을 사용 하 여 3 차원 (3D) 콜라겐 매트릭스에 포함 된 면역 세포를 시각화 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 또한 3d에서 셀 이동 추적 하는 방법 elaborates. 다른 유형의 3D 매트릭스에 현 탁 액 셀이이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

light-sheet-microscopy-for-three-dimensional-visualization-human

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K 조회수.  Saarland University. 여기, 선물이 빛 시트 현미경을 사용 하 여 3 차원 (3D) 콜라겐 매트릭스에 포함 된 면역 세포를 시각화 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 또한 3d에서 셀 이동 추적 하는 방법 elaborates. 다른 유형의 3D 매트릭스에 현 탁 액 셀이이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

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Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

연구

면역학 및 감염병학

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

지방 조직 면역 세포의 분리

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

이중 색깔 시간 게이트 자극 방출 고갈 (STED) Nanoscopy에 의한 면역 시냅스의 시각화

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease and treatment. It has the potential to predict therapeutic efficacy and identify novel therapeutic targets. Whole blood staining utilizes unmanipulated blood, which minimizes artifacts that can occur during sample preparation. However, whole blood staining must also be done on freshly collected blood to ensure the integrity of the sample. Additionally, it is best to prepare antibody cocktails on the same day to avoid potential instability of tandem-dyes and prevent reagent interaction between brilliant violet dyes. Therefore, whole blood staining requires careful standardization to control for intra and inter-experimental variability.
Here, we report deployment of an automated liquid handler equipped with a two-dimensional (2D) barcode reader into a standard process of making antibody cocktails for flow cytometry. Antibodies were transferred into 2D barcoded tubes arranged in a 96 well format and their contents compiled in a database. The liquid handler could then locate the source antibody vials by referencing antibody names within the database. Our method eliminated tedious coordination for positioning of source antibody tubes. It provided versatility allowing the user to easily change any number of details in the antibody dispensing process such as specific antibody to use, volume, and destination by modifying the database without rewriting the scripting in the software method for each assay.
A proof of concept experiment achieved outstanding inter and intra- assay precision, demonstrated by replicate preparation of an 11-color, 17-antibody flow cytometry assay. These methodologies increased overall throughput for flow cytometry assays and facilitated daily preparation of the complex antibody cocktails required for the detailed phenotypic characterization of freshly collected anticoagulated peripheral blood.

Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.

사람 말초 혈액의 Immunophenotypic 분석에 대한 항체 칵테일을 준비하는 반 자동화 된 접근

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with functional compartmentalization both during steady state and during different forms of inflammation. Until recently, the study of immune cells in the heart required the use of microscopy or poorly developed digestion protocols, which provided enough sensitivity during severe inflammation but were unable to confidently identify small &#8212; but key &#8212; populations of cells during steady state. Here, we discuss a simple method combining enzymatic (collagenase, hyaluronidase and DNAse) and mechanical digestion of murine hearts preceded by intravascular administration of fluorescently-labelled antibodies to differentiate small but unavoidable intravascular cell contaminants. This method generates a suspension of isolated viable cells that can be analyzed by flow cytometry for identification, phenotyping and quantification, or further purified with fluorescence-activated cell sorting or magnetic bead separation for transcriptional analysis or in vitro studies. We include an example of a step-by-step flow cytometric analysis to differentiate the key macrophage and dendritic cell populations of the heart. For a medium sized experiment (10 hearts) the completion of the procedure requires 2&#8211;3 h.

This protocol presents a simple and efficient method to isolate, identify and quantify immune cells residing in the myocardium of mice during steady state or inflammation. The protocol combines enzymatic and mechanical digestion for the generation of a single cell suspension that can be further analyzed by flow cytometry.

절연 및 심장의 Extravascular 면역 세포의 식별

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be affected by cell shape. Bacterial cells are three-dimensional (3D) objects, although they are rarely treated as such. Most microscopy techniques result in two-dimensional (2D) images leading to the loss of data pertaining to the actual 3D cell shape and localization of proteins. Certain shape parameters, such as Gaussian curvature (the product of the two principal curvatures), can only be measured in 3D because 2D images do not measure both principal curvatures. Additionally, not all cells lie flat when mounting and 2D imaging of curved cells may not accurately represent the shapes of these cells. Accurately measuring protein localization in 3D can help determine the spatial regulation and function of proteins. A forward convolution technique has been developed that uses the blurring function of the microscope to reconstruct 3D cell shapes and to accurately localize proteins. Here, a protocol for preparing and mounting samples for live cell imaging of bacteria in 3D both to reconstruct an accurate cell shape and to localize proteins is described. The method is based on simple sample preparation, fluorescent image acquisition, and MATLAB-based image processing. Many high-quality fluorescent microscopes can be simply modified to take these measurements. These cell reconstructions are computationally intensive and access to high-throughput computational resources is recommended, although not necessary. This method has been successfully applied to multiple bacterial species and mutants, fluorescent imaging modalities, and microscope manufacturers.

This protocol explains how to prepare and mount bacterial samples for live three-dimensional imaging and how to reconstruct the three-dimensional shape of E. coli from those images.

정확한 세포 표현과 정확한 단백질 국소화를 위한 세균 세포의 3차원 이미징

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...