이 작품은 캐나다 연구소의 건강 연구 (148808 148792)에 의해 지원 되었다, SE는 심 혼 및 치기 기초, 온타리오 주정부 사무실, 십 센트의 3 월, 피터 Munk 심장 연구에 대 한 테드 로저스 센터에서 직원 수상에 의해 지원 되었다 심장 센터입니다. XCC는 CIHR 밴팅 화목을 보유 하고있다. 라 심 혼 & 치기/리처드 Lewar 재학 수상 보유 하고있다.

윤리 성명:이 프로토콜을 검토 하 고 대학 건강 네트워크 (토론토, 캐나다)에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 동물 관리에 캐나다 위원회 준수 하 고.
1. 버퍼 준비
<ol><li>HBB 버퍼 (행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS), 2% 열 비활성화 소 혈 청, 0.2% 소 혈 청 알 부 민)을 준비 합니다. 열 10 mL 비활성화 둔감 한 혈 청 및 HBSS의 500 ml 소 혈 청 알 부 민 1 g 추가 합니다. 필터는 0.2 µ m 필터를 통해 소독 및 4 ° c.에 저장</li>
	<li>FACS 버퍼를 준비 (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 2% 열 소 혈 청, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA, pH 8.0) 비활성화). 10 mL 열 비활성화 둔감 한 혈 청 및 PBS의 500 mL에 0.5 M EDTA의 1 mL를 추가 합니다. 필터는 0.2 µ m 필터를 통해 소독 및 4 ° c.에 저장 참고: 솔루션을 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 1 개월.</li>
</ol>2. 순환 하는 백혈구의 라벨
<ol><li>Aseptically 200 µ L/마우스의 최종 주입 볼륨에 대 한 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS)에 희석 하는 항 체의 1 µ g와 반대로 마우스 CD45 주입을 준비 합니다. 28.5 G 인슐린 주사기에 볼륨을 로드 하 고 멀리 빛 유지. 참고: 사용 하 여 두 개의 서로 다른 형광 색소 표시 안티 CD45 항 체 intracardiac 얼룩에서 혈관 내 (i.v. 관리 통해 스테인드) 차별화 (소화 후 스테인드, 4 단계 참조).</li>
	<li>
전 5 분 동안 적 열 램프에 꼬리를 노출 하 여 쥐 (8-12 주 이전) 따뜻한. 주의: 동물을 과열 하지 마십시오. 안전한 거리에서 램프를 유지 (> 30 cm).<ol>
<li>적절 한 장치를 사용 하 여 sternal 위치에서 동물을 제 지. 색인과 중간 손가락으로 꼬리의 기지와 엄지 및 손가락으로 꼬리의 중반 원심 지역 immobilizing 함으로써 비 지배적인 손 가진 꼬리 안정 고. 주의: 피부를 뽑아 수로 꼬리의 끝에 너무 많은 힘을 적용 되지 않습니다. 정 맥으로 향하도록 경사와 바늘을 삽입 합니다. 그것은 정 맥을 펑크 쉽게 병렬 항상 정 맥 바늘을 유지. 참고: 피가 주사기를 입력 발생할 수 있습니다 및 좋은 주입의 표시 이다. 90도 각도로 바늘을 절곡 i.v. 관리 용이 하 게 수 있습니다. 안전 사무실 확인으로 벤딩 바늘 위험을 나타낼 수 있습니다.</li>
		<li>200 µ L을 꼬리 정 맥에 정 맥 주사. 유체 흐름을 쉽게 하 고 일시적으로 혈관을 선택을 취소 해야 합니다. 주의: 저항을 충족 하는 경우에 액체를 강요 하지 마십시오. 이 바늘의 방치의 표시 이다.</li>
		<li>고통 없이 마우스 euthanizing 전에 5 분 동안 순환 항 체를 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 심장 분리 및 소화
<ol><li>
CO2 를 사용 하 여 마우스를 안락사 또는 다른 제도 허용된 안락사 절차.
	<ol>
<li>CO2 안락사에 대 한 CO2 챔버에 마우스 놓고 (즉, 챔버 10 L, 2 L/min에서 칠 경우) 분당 챔버 볼륨의 20%를 채우기 비율을 설정 합니다. 호흡이 정지 될 때까지 2 분 및 모니터 마우스에 대 한 실행 합니다.</li>
		<li>CO2 를 종료 하 고 추가 1-2 분 호흡 챔버를 열기 전에 정지 했습니다 확인에 대 한 마우스를 두고 고 마우스는 마우스 처리를 진행 하기 전에 죽은 것인지 발가락 핀치를 수행.</li>
	</ol>
</li>
	<li>70% 에탄올과 마우스 스프레이입니다. 복 부에 피부를 들어올리고 흉 골까지 엉덩이의 수준에서 시작 하 여 복 부 정중 선 따라 절단 하 여 마우스를 해 부 합니다. 복 부를 열고 노출 막 간 이동 합니다.</li>
	<li>
폐와 심장 puncturing 되지 않도록 주의 하면서 중간의 양쪽에 횡 경 막, 다음 갈비뼈를 잘라.
	<ol>
<li>노출 마음 필 링으로 다시 갈비뼈, 다음 컷된 먼저 왼쪽된 심 방 뒤 오른쪽 심 방. 주의: 심 방,이 기관에 포함 된 혈액을 내 뿜 기의 효율성을 줄일 수로 동맥 또는 정 맥, 부상 보장을 자를 때 주의 사용 합니다.</li>
		<li>21g 바늘으로 장착 되어 60 mL 주사기를 사용 하 여 차가운 PBS와 차가운 PBS의 15-20 mL와 하트 perfuse 부드럽게 집게와 심장의 기본을 파악 하 고 꼭대기 근처 좌 심 실에 바늘을 삽입. 우 심 실에서 절차를 반복 합니다. 적절 한 주입 흰색 폐 창백한 간 결과. 참고: 관류 수행 되어야 한다 안락사 후 5 분 이내 순환 세포와 관심의 장기를 오염 시킬 수 있는 혈액 응고를 피하기 위하여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
심장의 기지 겸 자 잡고 부드럽게 올려 심장 다음 pericardial 자루, 대동맥 및 혈관, 주요 폐 동맥을 절단 하 여 마음을 분리 합니다.
	<ol>
<li>부드럽게 보풀 깨끗 한 종이 타월에 엄지와 집게 손가락 사이의 마음을 잡고 마음을 청소 하 고 겸 심 방 및 주요 동맥 및 정 맥 및 어떤 다른 오염 물질의 잔재 해 내. 참고:는 심 방 전체를 제거 하 고 전혀 다른 조직, 혈관, 폐 등이 조직 그들의 자신의 거주 면역 세포를가지고 있는지 확인 합니다. 폐 특히 인구가 큰 면역 세포는 그 심근의 작은 인구를 마스크할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
차가운 PBS의 50 µ L 5 cm 플라스틱 접시에 마음을 놓습니다.
	<ol>
<li>보이는 아무 조각이 있다 그리고 그것이 부드러운 일관성 때까지 곡선된 해가 위를 사용 하 여 마음을 말하다. 참고: 조직 손실을 최소화 하기 위해 자르고 동안 접시의 포함 된 영역에서 마음을 유지 하려고 합니다.</li>
		<li>Thetrituratedheart 조직 2 mL microcentrifuge 튜브와 함께 800 µ L 찬 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM)으로 곡선된 집게를 사용 하 여 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
나, 60 U/mL hyaluronidase 유형 I-S의, 그리고 DNase의 60 U/mL 450 U/mL ofcollagenase 추가-각 샘플을.
	<ol>
<li>45-60 분 50 rpm에서 락 통에 37 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
소화, 짧게 소용돌이 샘플 후 (20 s) 즉시 샘플 4 ° c.에 계속 하 얼음에 장소
	<ol>
<li>1 mL pipettor를 사용 하 여 플라스틱 샘플 아래로 조직 샘플 균질 및 피 펫 팁을 방해할 하지 않습니다 때까지. 참고: 플라스틱을 특정 한 횟수를 정의 재현성을 증가할 수 있습니다. 마음은 최적의 소화 되지, 심근의 조각 피펫으로 방해 수 있습니다. 부드럽게 microcentrifuge 튜브에 대 한 피 펫 팁을 연 삭 균질 직물의 더 큰 조각을 하는 데 도움이 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
미리 젖은 차가운 HBB의 1 mL 50 mL 원뿔 튜브에 40 µ m 셀 스 트레이너.
	<ol>
<li>무 균된 샘플 필터에 추가 하 고 차가운 HBB의 12-14 mL를 천천히 붓는 의해 통해 세척.</li>
		<li>전송 필터링 이라는 15 mL 원뿔 튜브 샘플 및 4 ° c.에 계속</li>
	</ol>
</li>
	<li>
4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기 샘플 상쾌한에서 발음.
	<ol>
<li>각 샘플에 염화 염화 칼륨 (ACK) 세포의 용 해 버퍼의 1 mL을 추가 하 여 붉은 혈액 세포를 lyse. Vortexing에 의해 샘플을 resuspend 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>세포의 용 해 완료 되 면 추가 5-8 mL의 차가운 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 혈을 중지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>400 x gfor 4 ° c.에서 5 분에 샘플을 원심 상쾌한에서 발음.</li>
	<li>각 샘플을 microcentrifuge 이라는 1.5 mL 튜브에 FACS 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기까지 2 h 4 ° c.에 저장 된 샘플</li>
</ol>4. flow Cytometry 얼룩이 지 고 분석
<ol><li>
4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기 샘플
	<ol>
<li>일반적인 항 체 바인딩을 줄이기 위해 희석 1: 100 안티-CD16/CD32 및 Monocyte 차단 (1:20) 샘플 당 50 µ L FACS에 대 한 회계 ( 재료의 표참조). 15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>샘플 당 FACS의 50 µ L에 대 한 항 체 희석 (각 항 체에 대 한 1: 250) 회계를 준비 합니다. 참고: 생존 염료를 포함할 수 있습니다 항 체 칵테일에 죽은 세포를 제외 하기 위하여. 또는, 사용 (그림 1C 와 D) 흐름 분석에 의해 작은 크기 제외 될 수 있습니다.</li>
		<li>세척, 없이 항 체 각각 샘플링 하 고 믹스 마스터 믹스의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>어둠 속에서 30 분 동안 4 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세척 하 고 샘플 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 각 샘플에 600 µ L FACS를 추가</li>
	<li>상쾌한 오프 aspirate와 300 µ L FACS에 펠 릿을 resuspend. 어둠 속에서 4 ° C에서 샘플을 유지. 참고: DAPI, 등 일부 생존 염료, cytometry를 실행 하기 전에 10 분 이내 얼룩이 필요 합니다.</li>
	<li>Cytometry 분석 ( 그림 1 및 2참조) 다음 3 h 이내. 더 이상 시간이 필요, 단기 고정 낮은 농도 paraformaldehyde를 사용 하 여 경우 (0.5-1 %PBS) 얼룩을 보존 하는 것이 좋습니다. 참고: 그것은 좋습니다 흐름 cytometer의 응용의 방해를 방지 하기 위해 시작 흐름 cytometry 분석 전에 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 샘플을 필터링 할.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

저자는 공개 없다.

심근 염증, 또는 심근 염, 가장 심혈 관 질환의 기능입니다. 그러나, 심근 질병이 아닌 상태에서 자체 면역 구성 요소 없는 아니다. 정상 상태 동안 많은 면역 세포에는 심근 있으며 유지 보수 및 보호의 필수적인 역할. 셀의 이러한 다양 한 인구 특성 것 없었을이 프로토콜에서 제시 하는 것과 같은 방법 없이 불가능 하다.
심근의 기계 및 효소 소화의 조합 분석, 흐름 cytometry 또...

심근 긴장 또는 부상, 허 혈 성 등 (국 소 빈 혈 reperfusion 또는 심근 경색)의 다른 형태와 비-허 혈 성 고혈압 (심근 염), 아니라 회복 및 보호, 염증 세포의 모집 홍보 병원 성 속성입니다. 1891, 빠르면 Romberg 처음 발진 티 푸 스, 성 홍 열1감염 환자의 심근에 세포 침투의 존재를 설명. 그러나, 심장 면역 세포의 상세한 연구 고급 immunophenotyping 기술 개발이 필요합니다. 그 결과, 최근에 우리가 안정 상태 동안 필수적인 유지 관리 역할을 가진 면역 세포의 다양 한 인구는 심근 내에 있는 이해 하기 시작 했습니다.
조직학, 되었으며 여전히 염증 동안 심장 면역 세포의 특성을 가장 일반적인 방법입니다. 그러나, 조직학 나타내는 유용한 진단 도구, 심장 면역 세포의 연구에 사용 중요 한 제한이 있다. 심근에 있는 면역 세포 총 세포의 아주 작은 비율을 대표 하 고 비례적으로 엄청난 공간에 더 많거나 적은 고르게 배포 됩니다. 마찬가지로, 여러 형태의 심장 염증, 바이러스 성 심근 염 등 염증의 초점 패턴을 표시합니다. 이 의미는 심장의 면역 시스템의 정확한 분석 종종 조직학 샘플링, 바이어스를 줄이기 위해 비용을 증가 시키기의 더 높은 학위를 필요로 합니다. 또한, 조직학 매우 제한 된 양의 셀 식별 (예: 매개 변수 개수)에 유용한 정보를 제공합니다. 여러 식 마커 (를 포함 하 여 표면 마커, 녹음 방송 요인 또는 분 비 분자)의 사용을 필요로 하는 셀의 하위 집합의 증가 수, cytometry immunophenotyping를 위한 가장 강력한 도구 자체를 설립 했다 저가 및 높은 처리량
Immunophenotyping 기술의 사용은 세포의 많은 수의 단일 세포 분석에 대 한 허용 하는 효율적인 소화 프로토콜의 개발에 밀접 하 게 의존. 세포 추출의 철저 한 프로토콜의 개발 심장 면역학의 연구 기회의 새로운 창을 열었습니다. 소화, cytometry 및 transcriptomics의 조합을 통해 대 식 세포와 수지상 세포에에서의 주요 인구 특징된2,3되었습니다. 정상 상태 동안 심장 면역 세포의 가장 풍부한 인구는 CD64+MerTK+ 세포, 더 분할 될 수 있다는 CCR2 또는 CD11c2의 그들의 표정에 따라. CCR2+ 세포 성인 골 수 조에서 발생 한 반면 대부분 CCR2의 MHC-II에 대 한 높은 또는 낮은 수준의 표현할 수,- 대 식 세포는 태아 근원의 주로 이다. 대 식 세포 수리4 부상 또는 안정 상태에서 전기 연결6 을 지 원하는 동안 파편5 의 제거 등의 주요 기능을 수행 합니다. 다른 형태의 염증 동안 Ly6C안녕하세요 MHC-IIlo CD64int monocytes의 중요 한 유입 발생는 나중에 Ly6C안녕하세요 CCR2 차별화+ 세포2,7 . 현저 하 게 더 작고, 그러나 중요 한, 인구에서 건강 한 개인의 심근 세포의 수지상 세포8,9로 구성 된다. 심장 기존의 DCs (cDCs)의 두 가지 주요 하위 집합을 최근 특징 되었습니다: cDC1 (CD103+ Dc)와 cDC2 (CD11b+ Dc). DCs 감염8 에 대 한 방어에 중요 한 역할을 재생 하지만 또한 심근 경색9중 특히 염증, 동안 자기 부상을 홍보할 수 있습니다.
여기, 우리가 마우스 심근에서 가능한 심장 면역 세포의 분리에 대 한 간단한 방법을 설명합니다. 메서드를 사용 하면 단일 셀 서 스 분석, 또는 추가 정화, 교류 cytometry 정렬 또는 자석 구슬 농축 수를 얻기 위하여 셀 스 트레이너 여과와 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다. Extravascular 심근 세포의 정확한 측정 심장 microvasculature의 혈 류에서 가능한 오염 물질을 제거 하기 위해 심장 관류를 필요 합니다. 또한, 우리는 더 심근 세포 Galkina 외. 프로토콜10에 따라 혈관 내 오염 물질에서 차별화 하는 데 사용할 수 있는 면역 세포의 혈관 내 라벨의 단계는 선택 사항 제시. 마지막으로, 우리는 주요 대 식 세포 및 cDC 모집단을 식별 하는 기본적인 흐름 cytometry 분석을 제시.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Wisent</td><td>311-511-CL</td><td>1x HBSS</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>BioShop</td><td>EDT111</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filter , 0.2 &amp;micro;m Filtropur V50</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.001</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1/2 1 cc insulin syringe</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>60 mL syringe</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>from Clostridium histolyticum</td></tr><tr><td>Hyaluronidase type I-S</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma</td><td>D4513</td><td>from bovine pancreas</td></tr><tr><td>Cell strainer, 40 &amp;micro;m Nylon</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td><td>Lonza</td><td>10-546E</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101222</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td><td>Biolegend</td><td>128025</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD103</td><td>Biolegend</td><td>121414</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>PE anti-mouse Ly-6G</td><td>Biolegend</td><td>127607</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td><td>Biolegend</td><td>116422</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td><td>Biolegend</td><td>139315</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-mouse CD45</td><td>Biolegend</td><td>103113</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td><td>Biolegend</td><td>103132</td><td>1:40 dilution</td></tr><tr><td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>True-Stain Monocyte Blocker</td><td>Biolegend</td><td>426101</td><td>1:20 dilution</td></tr><tr><td>FlowJo V10</td><td>TreeStar Inc</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr><tr><td>Mouse: Batf3-/-</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX: 013755</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

면역 체계가 건강 한 심장의 필수적인 구성 요소입니다. 심근은 정상 상태와 다른 형태의 염증 동안 기능 구획과 다른 면역 세포 하위 집합의 풍부한 인구에 게 가정. 최근까지 연구에서에서 면역 세포의 현미경의 사용을 요구 하거나 심한 염증 동안 충분 한 감도 제공 하지만 하지 못했습니다 자신 있게 제대로 개발된 소화 프로토콜 식별 작은-하지만 키-인구 정상 상태 동안 셀입니다. 여기, 우리는 간단한 방법 결합 효소 (콜라, hyaluronidase DNAse)와 기계적 소화 murine 마음 앞에 작은 차별화에 놓여있는지 분류 항 체의 혈관 내 관리의 논의 하지만 피할 수 없는 혈관 내 세포 오염 물질입니다. 이 방법은 생성 식별 형질, 정량화, cytometry에 의해 분석 하거나 더 형광 활성화 된 세포 분류와 마그네틱 비드 분리 정화 수 있는 분리 가능한 세포의 현 탁 액 transcriptional 분석 또는 생체 외에서 연구. 우리는 주요 대 식 세포와 수지상 세포 인구 중심의 차별화 하는 단계별 흐름 cytometric 분석의 예를 포함 합니다. 중간 크기의 실험 (10 마음)에 대 한 절차의 완료는 2-3 h를 요구 한다.

날짜 하려면, 좋은 방법 cardiomyocytes 같은 다른 심장 세포 구성 요소에서 면역 세포를 분리 설계 되었습니다. 따라서, cytometry에 의해 심장 단일 세포 현 탁 액의 분석 단일 세포 및 작은 크기 제외 제어그림 1(A) 면역 세포 인구를 식별 하는 CD45와 미리 게이팅 필요 합니다. 또는, 생존 얼룩이 죽은 세포를 제외 하려면 수행할 수 있습니다. 소?...

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Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

절연 및 심장의 Extravascular 면역 세포의 식별

이 프로토콜 격리, 식별 하 고 안정 된 상태 또는 염증 동안 쥐의 심근에 있는 면역 세포를 계량 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 제공 합니다. 프로토콜은 cytometry에 의해 더 분석 될 수 있는 단일 세포 현 탁 액의 세대에 대 한 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

isolation-identification-extravascular-immune-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.5K 조회수.  University Health Network (UHN). 이 프로토콜 격리, 식별 하 고 안정 된 상태 또는 염증 동안 쥐의 심근에 있는 면역 세포를 계량 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 제공 합니다. 프로토콜은 cytometry에 의해 더 분석 될 수 있는 단일 세포 현 탁 액의 세대에 대 한 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다.

비디오: Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

심장 기능 면역 세포의 분리

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

발생학

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

절연 및 Endomyocardial Bioptic 샘플의 Arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 중간 엽 기질 세포의 특성

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers을 사용하여 뇌와 심장에있는자가 반응 CD4 T 세포의 제자리 탐지에

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. Consequently, these two cell populations play unique roles in cardiac diseases. Current studies involving isolated endothelial cells investigate cell populations consisting of both EECs and CECs. This protocol outlines a method to independently isolate these two cell populations for cell-specific characterization. Following the collection of the left and right ventricular free wall, endothelial cells from the outer surface and inner surface are separately liberated using a digestion buffer solution. The sequential digestion of the outer surface and the inner endocardial layer retained separation of the two endothelial cell populations. The separate isolation of EECs and CECs is further verified through the identification of markers specific to each population. Based on previously published single cell RNA profiling in the mouse heart, the Npr3, Hapln1, and Cdh11 gene expression is unique to EECs; while Fabp4, Mgll, and Cd36 gene expression is unique to CECs. qPCR data revealed enriched expression of these characteristic markers in their respective samples, indicating successful EEC and CEC isolation, as well as maintenance of cell phenotype, enabling further cell-specific functional analysis.

We present a protocol for the isolation of endocardial and coronary endothelial cells from rat hearts through sequential tissue digestion in a digestion buffer, cell collection from recurrent centrifuge cycles, and cell purification using anti-rat CD31 microbeads.

쥐 심장의 심실 무료 벽에서 내심 내피 및 관상 내피 세포의 격리

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative responses after cardiac injury. How various subsets of macrophages orchestrate the immune responses after cardiac injury is an active area of research. Presented here is a simple protocol that our lab performs routinely, for the extraction of macrophages from mouse and human myocardium specimens obtained from healthy and diseased individuals. Briefly, this protocol involves enzymatic digestion of cardiac tissue to generate a single cell suspension, followed by antibody staining, and flow cytometry. This technique is suitable for functional assays performed on sorted cells as well as bulk and single cell RNA sequencing. A major advantage of this protocol is its simplicity, minimal day to day variation and wide applicability allowing investigation of macrophage heterogeneity across various mouse models and human disease entities.

Presented here is a protocol to isolate various subsets of macrophages and other non-immune cells from human and mouse myocardium by preparing a single cell suspension through enzymatic digestion. Gating schemes for flow cytometry based identification and characterization of isolated macrophages are also presented.

인간과 마우스 심근 표본에서 대식세포 하위 세트 및 기질 세포의 분리

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. However, the literature reports contrasting data on the prevalence of myocardial B-cells. B-cells have been reported to be both among the most prevalent immune cells in the rodent heart or to be present, but at a markedly lower prevalence than myeloid cells, or to be quite rare. Similarly, several groups have described that the number of myocardial B-cells increases after acute ischemic myocardial injury, but one group reported no changes in the number of B-cells of the injured myocardium. Implementation of a shared, reproducible method to assess the prevalence of myocardial B-cells is critical to harmonize observations from different research groups and thus promote the advancement of the study of B-cell myocardial interactions. Based on our experience, the seemingly contrasting observations reported in the literature likely stem from the fact that murine myocardial B-cells are mostly intravascular and connected to the microvascular endothelium. Therefore, the number of B-cells recovered from a murine heart is exquisitely sensitive to the perfusion conditions used to clean the organ and to the method of digestion used. Here we report an optimized protocol that accounts for these two critical variables in a specific way. This protocol empowers reproducible, flow cytometry-based analysis of the number of murine myocardial B-cells and allows researchers to distinguish extravascular vs. intravascular myocardial B-cells.

Here we report a protocol for the quantification and differentiation of myocardial B-lymphocytes based on their location in the intravascular or endothelial space using flow cytometry.

유세포분석 기반 심근 B 세포의 정량화 및 분석

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

쥐 동방과 방실 결절에서 상주 심장 대 식세포의 분리 및 배양

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

의학

Revealing Murine Pulmonary Veins Myocardial Architecture

Microdissection and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial fibrillation (AF). PVs contain myocardial sleeves (MS) composed of cardiomyocytes. MS are implicated in the initiation and maintenance of AF, as they preserve similarities to the cardiac working myocardium, including the ability to generate ectopic electrical impulses. Rodents are widely used and may represent excellent animal models to study the pulmonary vein myocardium since cardiomyocytes are widely present all over the vessel wall. However, precise microdissection and preparation of murine PVs is challenging due to the small organ size and intricate anatomy.
We demonstrate a microscopy-guided microdissection protocol for isolating the murine left atrium (LA) together with the PVs. Immunofluorescence staining using cardiac Troponin-T (cTNT) and connexin 43 (Cx43) antibodies is performed to visualize the LA and PVs in full length. Imaging at 10x and 40x magnification provides a comprehensive view of the PV structure as well as detailed insights into the myocardial architecture, particularly highlighting the presence of connexin 43 within the MS.

저자 스포트라이트: Developing a Translational Model for Atrial Fibrillation Research Across Species(종 간 심방세동 연구를 위한 중개 모델 개발) 

This protocol demonstrates microscopy-guided isolation and immunofluorescence staining of murine pulmonary veins. We prepare tissue samples containing the left atrium, pulmonary veins, and the corresponding lungs and stain them for cardiac Troponin T and Connexin 43.

쥐 폐 정맥에서 심근 슬리브의 미세 해부 및 면역형광 염색

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial ...

절연 및 심장의 Extravascular 면역 세포의 식별

요약

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심장 기능 면역 세포의 분리

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

절연 및 Endomyocardial Bioptic 샘플의 Arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 중간 엽 기질 세포의 특성

주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers을 사용하여 뇌와 심장에있는자가 반응 CD4 T 세포의 제자리 탐지에

쥐 심장의 심실 무료 벽에서 내심 내피 및 관상 내피 세포의 격리

인간과 마우스 심근 표본에서 대식세포 하위 세트 및 기질 세포의 분리

유세포분석 기반 심근 B 세포의 정량화 및 분석

쥐 동방과 방실 결절에서 상주 심장 대 식세포의 분리 및 배양

쥐 폐 정맥에서 심근 슬리브의 미세 해부 및 면역형광 염색

쥐 폐 정맥에서 심근 슬리브의 미세 해부 및 면역형광 염색