프로토콜 및 원고에 관한 유용한 토론에 감사 Jolanta Chmielowiec 하 고. 우리는 또한 confocal 현미경에 접근을 위한 벤자민 Arenkiel 감사합니다. 이 작품은 NIH (P30-DK079638 M.B.)와 T32HL092332-13 마스와 M.B., 맥 네 어 의료 재단 (M.B.), 및 BCM 지적 발달 장애 연구 센터에서 confocal 코어에 의해 지원 되었다 (NIH U54 HD083092는 유 니스에서 케네디 슈 라이버 국립 연구소의 건강 그리고 인간 발달).

이 방법에 설명 된 모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 베일 러 대학의 약에 의해 승인 되었다.
1. 마우스 배아 일 10.5 췌 장 창시자의 준비
그러나 참고:이 프로토콜 않습니다 필요가 없습니다 2 단계까지 무 균 조건 하에서 지켜질 해 부 도구를 소독 하 고 사용 하기 전에 70% 에탄올 스프레이에 최적입니다.
<ol><li>해 부에 대 한 설정, 얼음 양동이 얼음에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 컨테이너를 놓습니다. 두 개의 뾰족한 집게 및 해 부가 위 70% 에탄올으로 청소. 컨테이너를 3 개 이상 붕 모 세관 튜브, 입 피 펫, 라이터와 1000 µ L 피 펫 팁을 필터링 해 부 지역 근처 설정.<ol>
<li>1.25 mg/mL 찬 dispase에 얼음에 12 잘 플레이트의 두 번째 잘 소독된 물에 희석의 적어도 1 mL를 준비 합니다. 첫 번째, 세 번째 및 네 번째에서 PBS를 넣어 12의 우물 잘 접시. 0.05%의 장소 1 mL Trypsin 1.5 ml에서 튜브 얼음에. 미리 따뜻하게 37 oc.에 떨고 인큐베이터</li>
	</ol>
</li>
	<li>E10.5 타임-임신 쥐 IACUC 지침에 따라 안락사 복 부 지역 V 자형 절 개를 성 기 영역에서의 위와 집게를 사용 하 여 마우스를 하기 전에 청소 하 고 횡 경 막까지 계속 70% 에탄올 스프레이. 참고:이 프로토콜에 질 플러그의 모양을 하루 0.5를 나타냅니다. 5-6 주 오래 된 마우스를 사용 하 여 이상의 2 g의 체중 증가 성공적인 임신의 보조 수단으로 역할을 합니다.<ol>
<li>조심 스럽게 반대편에 반복 하기 전에 생식 기 지역으로 위쪽으로 마우스, 그리고이 절에 따라 장기를 당겨 자 궁의 맨 측면 부분에 절 개를 함으로써 자 궁을 삭제할. 10 cm 차가운 PBS와 페 트리 접시에에서 놓습니다. 그러나 참고: 그것은 e10.5 pancreatoids와 달리이 organoids 특징 되지 않습니다 및 따라서 모든 세 가지 주요 췌 장 혈통으로 분화 하는 능력을 유지 하지 않을 수 있습니다 e11.5 해리 셀에서 organoids를 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가벼운 해 부 현미경 페 트리 접시를 놓고 하 고 신중 하 게 각 태아 사이 두 집게 배치 하 노른자위 낭에서 조직을 박 리 하 여 자 궁 조직을 엽니다. 집게와 10cm 신선한, 페 트리 접시에서 부드럽게 노른자위 sac를 파악 하 여 배아를 전송 차가운 PBS. 얼음에 페 트리 접시를 놓습니다. 참고: 그것은 heedfully 강력한 제거 탯, 태아의 조직 고 구조적 무결성을 손상 시 키 지를 뽑을 수 선호 노른자위 낭 내에서 유지 하는 배아를 제거 하는 것이 중요.</li>
	<li>10 cm 배양 접시 뚜껑에 여러 PBS 방울을 배치 합니다. 이 방울을 사용 하 여 extraembryonic 조직 가시성을 보장 하기 위해 제거는 해 부 동안 배아를 전송. PBS 드롭 배아를 전송 하 고 나머지 배아 얼음 (그림 1A)에 PBS에 체류 하는 동안 집게를 사용 하 여 노 른 자 골목에서 부드럽게 제거 합니다. 가볍게 푸 하지 손상 조직 (그림 1B), 태아를 집게를 사용 하 여 새로운 PBS 드롭 배아를 이동 하기 전에 머리를 제거 합니다. 참고: 조직 액체의 불투명도 따라 여기서 설명한 것 보다 신선한 PBS 방울을 더 자주 전송 되도록 해야 합니다.<ol>
<li>새로운 PBS 드롭 forelimb 싹 집게 (그림 1B)를 사용 하 여 제거 합니다. 사지 새싹은 현재 오프닝으로 집게를 배치 하 고 부드럽게 anteriorly 가장 외부 조직만을 찢 어 (그림 1B). 배아를 회전 하 고 hindlimb 새싹에서 후부 방향으로 반복 합니다. 이 시점에서, 위장 표시 (그림 1B) 해야 합니다.</li>
		<li>위장의 후부 지역의 약간의 굴곡 (그림 1 층) 있다. 위장과 체 벽의 척추 지역 사이이 벤드 뒤에 집게를 삽입 합니다. 위장, 가장 앞쪽 영역 심장 지역 (그림 1B-E)를 연결 하는 곳에 도달할 때까지 천천히 위쪽으로 작업을 분리 합니다. 선택 사항: 원시 심장과 간 싹에서에서 제거만 연속 직감 튜브를 떠나 위 장관의 복 부 지역. 이 프로토콜을 수행 하는 처음 몇 번 그것은 두고 심장과 간 위장와 등 쪽 췌 장 새싹의 형태까지 복 부 랜드마크는 더 쉬울 수도 있습니다 (그림 1C 와 D 익숙한 ).</li>
		<li>신선한 PBS 물방울에 위장을 전송.</li>
		<li>집게를가지고 부드럽게 돌출 버드와 소장 아래 조직을 꼬 집 고 약간 들어올립니다 (그림 1D-F)을 외부 조직. 참고: 등 쪽 췌 장 새싹은 위장과 소장 (그림 1C G) 사이 있습니다. 아래 췌 장 새싹 라운드, 혹 구조 (그림 1G) 처럼 보이게 한다.</li>
		<li>꽃 봉 오리 핀치 위로 새싹 (그림 1G)을 완화 하 고 소장에 연결 집게에 놓습니다. 얼음에 차가운 PBS에 12 잘 플레이트의 첫 번째 우물에 꽃 봉 오리를 전송 하기 전에 새로운 PBS 거품에 한 번 씻어. 모든 새싹 및 배아에서 수집한 12 잘 플레이트의 첫 번째 우물에 배치 될 때까지 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가벼운 해 부 현미경 아래 12 잘 접시를 놓습니다. 성공적으로 나중에 분할 비율을 계산 해 부 췌 장 새싹의 수를 계산 합니다.<ol>
<li>장소는 모 세관 튜브 입 피 펫에 필터링 된 1000 µ L 피 펫 팁 첨부. 화 염 모 세관 튜브를 소독 하 고 사용의 용이성에 대 한 튜브에 벤드를 만듭니다. 모 세관을 사용 하 여 깨끗 한 PBS (그림 1G)와 세 번째 우물을 전송 하기 전에 2 분 동안 두 번째 잘 포함 하 찬 dispase 솔루션에 싹을 전송. 참고: 꽃 봉 오리를 dispase에서 PBS를 전송 하는 동안 조직 모 세관 튜브의 팁을 만지지 마십시오. 조직 관의 끝에 걸리면, 위쪽 및 아래쪽 플라스틱 또는 느슨하게 때까지 깨끗 한 PBS 솔루션에 흔들.</li>
		<li>꽃 봉 오리를 아래로, 플라스틱 그리고 깨끗 한 PBS 가진 4 잘 전송. 마지막으로, 0.05%는 1.5 mL 튜브에 새싹 모 세관 장치 전송 사용 하 여 트립 신. 미리 데워 진된 37 oC 셰이 커에 튜브를 놓고 4 분 1500 rpm에서 흔들어.</li>
		<li>약 10 소용돌이 s 다음 즉시 튜브에 배치는 원심 분리기와 200에서 5 분 동안 스핀 g. centrifuged 세포 (그림 1G)을 방해 하지로 조심 스럽게 솔루션의 모든 하지만 약 50 µ L를 제거.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 경작 Pancreatoids를 형성 하기 위하여 해리 창시자
참고: 다음는 표준 살 균 절차를 사용 하 여 표준 조직 문화 후드에 메 마른 분위기에서 수행 합니다.
<ol><li>수집 된 모든 새싹, centrifuged 셀 400 µ L organogenesis 미디어16,17 (표 1)를 추가 합니다. 펄스 소용돌이 세 번 하 고 플레이트 100 µ L 당 낮은 첨부 파일 96의 잘 잘 플레이트, 싹 (그림 1G) 1:4 비율로 분할.</li>
	<li>시각화를 해리 셀 (그림 1H)를 자유롭게 떠 현미경 아래에서 확인 하십시오. 중간 속도에서 로커에 5% CO2 와 37 oC 인큐베이터에서 문화 접시를 놓습니다.</li>
	<li>매일 pancreatoids의 진행 상황을 모니터링 합니다. 신선한 미디어 3 일 마다 미세한 제어 후드 우물에서 pancreatoid를 떠나 있는 동안 제거에 신중 하 게 pipetting 미디어의 100 µ L를 바꿉니다. 또는 신선한 100 µ L 미디어의 입 피 펫 및 1000 µ L에 연결 된 붕 규 산 세관 피 펫 팁 필터링 새로운 잘 사용 하 여 전송 하는 pancreatoid에 추가할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 처리 Pancreatoids Immunofluorescent 이미징
<ol><li>Immunofluorescent 이미지 pancreatoids를 처리 하려면 먼저 4 %paraformaldehyde / PBS, pH7.4 (PFA) 솔루션 준비 합니다. 4%의 장소 50 µ L PFA는 96의 우물에 잘 플레이트.<ol>
<li>Pancreatoids 4% 신선한 잘으로 가능한 작은 미디어를 복용 하는 문화 매체에서 전송 1000 µ L 필터링 된 피 펫 팁 붕 규 산 모 세관 튜브 및 입 피 펫을 사용 하 여, PFA. 15 분 동안 실내 온도에 로커에 설정 합니다.</li>
		<li>4%에서 pancreatoids 전송 3 신선한 PBS 세척의 총에 대 한 5-10 분 반복에 대 한 상 온에서 신선한 PBS의 100 µ L로 잘으로 PFA 바위. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지, 여기 4 oC에서 PBS의 100 µ L에 최대 1 주일까지 저장 하는 pancreatoids와.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wholemount 이미징 (경우 항 체는 섹션 3.3에에서 적합 한 대체 접근 권장. 그리고 3.4에서 현미경 검사 법.), PBS에서 블록을 0.1% 비 세제 (PBST)로 1 x PBS에서 50 µ L 5% 당나귀 혈 청으로 전송. 4 oC에서 하룻밤 바위 또는 양자 택일로 실 온에서 4 시간.<ol>
<li>1 혈 청 5% 당나귀의 50 µ L에 희석 하는 주 항 체를 포함 하는 새로운 우물을 pancreatoids 전송 x PBST. 4 oC에서 24 시간 (36 h까지 하지만 적어도 12 h)에 대 한 최적의 바위. 참고: 항 체 Chga (1: 100), DBA (1:400), Vim (1:400), 및 Pdx1에 대 한 재료의 테이블에 에서 나열 된 (1: 100) wholemount 얼룩;에 적합 다른 항 체 최적화가 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>Pancreatoids 신선한 PBST 세척 하 고 실 온에서 30 분 동안 바위의 100 µ L를 포함 하는 잘 전송. 3 신선한 PBST 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>1 혈 청 5% 당나귀의 50 µ L에 희석 2 차 항 체를 포함 하는 새로운 우물을 pancreatoids 전송 x PBST. 빛에서 접시를 보호 하 고 4 oC, 락을 최적으로 24 시간 (36 h까지 하지만 적어도 12 h)에. 참고: 테이블의 재료 와 DAPI 핵 counterstain에 나열 된 모든 이차 항 체는 wholemount 얼룩 적합 합니다.</li>
		<li>Pancreatoids x PBST와 바위 1에 3 개의 세척의 총 30 분 반복에 대 한 실 온에서 1의 100 µ L를 포함 하는 새로운 잘 전송 x PBST. 제 3의 그리고 마지막 세척에 추가 300 nM DAPI.</li>
		<li>마지막으로, 깨끗 한 PBS의 저장소 4 oC 최상의 결과 즉시 얼룩 후 영상에서 온 confocal 현미경 검사 법에 의해 이미징 하기 전에 주일에 대 한 빛에서 보호에서 100 µ L을 넣으십시오. 이미징 동안 pancreatoids의 움직임을 방지 하지만 밖으로 건조 방지, PBS의 20 µ L 방울에 각 pancreatoid를 놓습니다. Pancreatoids 아직도 남아 있지, PBS 볼륨을 줄일 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>냉동된 섹션에 대 한 pancreatoids에서에서 전송할 PBS 30% 자당 해결책 하룻밤에 4 o3.<ol>
<li>해 부 현미경 거품에서 포함 미디어를 추가 합니다. 미세한 제어 집게를 사용 하 여 부드럽게 밀어 포함 미디어를 통해 여러 번 냉동 포함 미디어 조직 블록을 전송 하기 전에 잔여 자당을 제거 하 여 pancreatoids를 담근 다.</li>
		<li>8 µ m에서 cryostat에 고정 될 때까지 드라이 아이스에 조직 블록 및 섹션을 놓습니다. 참고: 섹션 저장할 수 있습니다-80 oC 또는 immunostained에 즉시.</li>
		<li>섹션-80 oC 건조까지 약 5 분 동안 실 온에서 해 동 하실 수 있습니다. 소수 성 장벽을 조직과 5% 당나귀 혈 청 1에서 희석을 사용 하 여 블록 주위 소수 pap 펜을 사용 하 여 그리는 실 온에서 30 분 동안 x PBST.</li>
		<li>미디어를 제거 하 고 기본 항 체 5% 당나귀 혈 청 1 x PBST에서 4 o3. 하룻밤에 희석에 희석 즉시 바꿉니다</li>
		<li>기본 솔루션을 제거 하 고 씻어 조직 세 번 1 10 분 x PBST. 이것 다음, 이차 항 체 솔루션 5% 당나귀 혈 청 1에서 희석에 희석 추가 실 온에서 1 h x PBST 빛에서 슬라이드를 보호 하 고.</li>
		<li>보조 솔루션을 제거 하 고 1에 슬라이드 세 번 씻고 10 분 x PBST. 마지막 세척에 추가 300 nM DAPI.</li>
		<li>미디어를 제거 하 고 설치 미디어와는 coverslip 추가. 스토어 이미지 준비까지 멀리 빛 4 oC에에서 슬라이드.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 대 본 분석에 대 한 Pancreatoids에서 RNA의 격리
<ol><li>Pancreatoids 1.5 mL 튜브에 산 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-솔루션의 500 µ L로 불 임 및 장소에 대 한 필터링 된 1000 µ L 피 펫 팁 입 피 펫에 연결 된 붕 규 산 모 세관을 사용 하 여 수집 합니다. -80 oC에 저장 하거나 즉시 RNA 격리를 진행.</li>
	<li>RNA 격리에 대 한 필요한 경우 얼음 샘플을 해 동 하 고 클로 프롬의 100 µ L를 추가 합니다. 4 oC 15 분에 대 한 장소와 소용돌이 잘 미리 냉각 4 oc. 원심 분리기<ol>
<li>장소 튜브 원심 분리기 및 스핀 4 oc.에서 12000 g에서 20 분</li>
		<li>조심 스럽게 튜브 레이어 분리를 방해 하지 않는를 제거. 200 µ L 피 펫을 사용 하 여, 명확한 수성 해결책을 수집 하 고 흰색 단백질 층 및 분홍색 DNA 층에서 버퍼에 작은 금액을 뒤에 남겨두고 새로운 1.5 mL 튜브에 배치. 이 과정에서 아무것도 피 펫의 끝을 만지지 마십시오 하 고 1.5 mL 튜브의 벽을 만지지 마십시오.</li>
		<li>수성 층과 소용돌이 포함 하는 새 튜브를 100% 소 프로 파 놀의 500 µ L를 추가 합니다. 앉게 실 온에서 20 분, 얼음, 더 이상 또는 최대 강수량 하룻밤 사이에 두고-20 oc.</li>
		<li>4 oC를 작은 RNA에서 15 분 동안 12000 g에서 원심. 펠 릿을 방해 하지 않고는 소 프로 파 놀을 제거 합니다. 참고: pancreatoids는 작은, 그것은 가능성이 펠 릿 표시 되지 것입니다.</li>
		<li>감기, 75% 에탄올을 추가 하 고 여러 번 튜브를 반전. 원심 분리기에 놓고 에탄올과 9000 x g에서 2 분 동안 회전 4 oC. 제거에서 10 분 동안 9000 x g에서 회전 합니다.</li>
		<li>200 µ L 피 펫을 사용 하 여 지역에 거주 하는 펠 릿 하지 않고 튜브에 어떤 나머지 에탄올을 제거. 잔여 에탄올의 증발 되도록 실 온에서 5 ~ 10 분에 대 한 튜브에 뚜껑 열어 둡니다.</li>
		<li>깨끗 한, nuclease 무료 물 20 µ L에서 vortexing에 의해에 펠 릿을 resuspend. 선택 사항: 열 RNA 65 oC 3 분 하 고 즉시 얼음에 반환 합니다. RNA-80 oC에 저장 하거나 즉시 반전 녹음 방송 및 정량에 사용 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+is+required+for+maintenance+of+the+pancreatic+progenitor+cell+pool.">SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).</li><li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transcriptional+regulator+Ptf1a+in+converting+intestinal+to+pancreatic+progenitors.">The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors.</a> Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).</li><li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li><li>Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+binding+sites+for+Dolichos+biflorus+agglutinin+at+the+apical+aspect+of+collecting+duct+cells+in+rat+kidney.">Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney.</a> Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).</li><li>Reichert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+genetic+manipulation+of+mouse+pancreatic+ductal+cells.">Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).</li><li>Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromogranins+A+and+B:+the+first+25+years+and+future+perspectives.">The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives.</a> Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).</li><li>Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. 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A., Kumar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+insufficiency+in+type+1+and+type+2+diabetics+of+Indian+origin.">Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin.</a> Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

셀 문화 모델의 진행은 제대로 개발 모델, 임상 관련 세포 유형, 시험 약물 효능, 또는 심지어 이식 환자에 게 중요 합니다. 그러나, 인위적으로 업과 접시에 개발은 도전으로 우리는 여전히 organogenesis과 생리학의 메커니즘을 이해 멀리 vivo에서. 따라서 체 외에서 세포는 효율적으로 생성 된, 완전히 기능, 시간, 오랜 기간 동안 유지 될 또는 본문에 대 등 한 셀에서 다른 이상 항구 수 ?...

정상적인 개발 및 생리의 메커니즘을 묘사 하는 것은 질병 병 인을 이해 하 고 궁극적으로 치료 방법을 육성에 답해야 합니다. 배양 및 분화 줄기 세포 개발의 신속 하 고 높은 처리량 분석을 수 있습니다, 그것은 기존의 신체의 세포 운명 조절 메커니즘에 관한 지식에 의해 제한 됩니다 고 인위적으로 개발에이 상대적으로 균질 성, 2 차원 상태1,2. 뿐만 아니라 vivo에서 개발 틈새와 환경에서 서로 다른 세포 유형으로 외부 영향에 의해 영향을 받는 paracrine 신호 및 조직 지원 organogenesis, 가이드를 제공 하는 있지만 이러한 세포의 기능에 의존 하 고 또한 그들의 주변 지도3,,45. 이러한 외부 단서의 중요성, vivo에서 마우스 모델의 힘 드는 자연과 분화 프로토콜의 한계를 감안할 때, 새로운 시스템 기본 개발 프로세스 및 생리학을 실험적으로 조사 필요 합니다.
Organogenesis, 생리학, 약물 효능 및 심지어 pathogenesis. 을 편리 하 고 적합 한 시스템을 제공 하는 3 차원, 복잡 한 organoids를 생성 하는 프로토콜의 출현 대 위6 과 대 장7 다른 시스템 organogenesis에 대 한 우리의 이해를 확장 했다 murine organoids를 설립, 연구 개발 복잡성 vivo에서 보다 적게 제한 하는 도구를 제공 하 그리고 생체 외에서 모델입니다. Murine organoid이 진보 때문 형성과 인간 만능의 출현 줄기 세포, 인간의 장8, 망막9, 신장10,11, 그리고 대뇌12 organoids 생산 되어,이 레 퍼 토리만 개발 메커니즘에 관한 기존의 지식에 의해 제한 됩니다.
질병의 무수 한 재앙 다른 췌 장 세포 유형, 외 분 비 췌 장 불충분13,14, 췌 장 염 포상 세포에에서 포상 세포와 덕트를 포함 한 췌 장 organoids의 생성은 특별 한 관심의 고 15당뇨병 베타 세포입니다. 이러한 서로 다른 세포 유형의 개발에 관한 지식을 얻고 고 또한, 맞춤된 약물 검사 또는 이식에 대 한 플랫폼 역할을 할 수, 있습니다. 그들의 병 리를 이해에 도움이 수 있습니다. 이전, Greggio 외. 만들 murine 췌 장 organoids morphogenesis vivo에서 정리 하 고 모든 주요 췌 장 상피 세포의 구성 하는 조직, 3 차원, 복잡 한 구조를 개발 하는 방법 개발 유형16,17. 이것은 췌 장 분야에서 앞으로 중요 한 단계 이다, 특히 만드는 세포에 생체 외에서 베타 세포 개발의 생물 학적 조사를 설정할 수 있습니다. 그러나, 내 분 비 세포의 부족은 organoids 조직, 틈새 상호 작용 수 및 교육용 신호17제공으로 이식 했다 하지 않는 한이 프로토콜에서 형성 했다. 틈새 시장, 무 겁 게 내 분 비 박 등 차별화3,4, 후기에 organogenesis의 초기 단계에서 개발 상피를 뒤 덮 었의 가장 큰 부분을 구성 하는 mesenchyme 18. 개발 췌는 mesenchyme의 상호작용은 아직 외부 신호 및 생체 내에서 세포 복잡성을 유지의 중요성 organogenesis 연구의 또 다른 예.
여기, 우리는 3 차원 췌 장 organoids, pancreatoids, 해리 e10.5 murine 췌 장 창시자에서 불리를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 pancreatoids 네이티브 mesenchyme 유지, 부동성 조건에서 자기 조립 및 내 분 비 하는 베타 세포19의 강력한 수를 포함 한 모든 주요 췌 장 세포 종류를 생성. 이 방법은 이전 프로토콜 강력한 내 분 비 차별화 부족으로 내 분 비 발달의 분석을 위해 가장 적합 하다. 그러나, 췌 장 organoids에 대 한 프로토콜을 사용 하 여 Greggio 외. 췌 장의 상피 분기 및 morphogenesis의 분석에 대 한 더 적합에 의해 설명 된 대로 분기로 더 제한 됩니다 pancreatoids.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>BarnStead NanoPure Nuclease-free water</td><td>ThermoFisher</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Capillary Tubes</td><td>Sutter Instruments</td><td>GB1007515</td><td>O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Repellent 96-Well Microplate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>U-bottom</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233306</td><td></td></tr><tr><td>Chromogranin-A antibody</td><td>Abcam</td><td>ab15160</td><td></td></tr><tr><td>Compact, Modular Stereo Microscope M60</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10310</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counter Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>ThermoFisher</td><td>957000L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidine-2&#039;-phenylindole-dihydrochloride)</td><td>Roche</td><td>10 236 276 001</td><td>Powder</td></tr><tr><td>DBA antibody</td><td>Vector Lab</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, Powder</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip</td></tr><tr><td>EGF (Epidermal growth factor)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri Cycle CO2 Incubators</td><td>ThermoFisher</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>OB10001</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>INSM1 Antibody</td><td>Santa Cruz BioTechnology</td><td>sc-271408</td><td>Polyclonal Mouse IgG</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>a4164</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia Isoflurane, USP</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Antibody</td><td>Dako</td><td>A056401</td><td>Polyclonal Guinea Pig</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universal</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>KaryoMax</td><td>10575090</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442615</td><td></td></tr><tr><td>Mouse C-Peptide ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-CPTMS-E01</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-INSMSU-E01</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Microtome Blades</td><td>ThermoFisher</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pdx1 antibody</td><td>DSHB</td><td>F6A11</td><td>Monoclonal Mouse MIgG1</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td><td>VWR</td><td>15160-157</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>1.5mL Capacity</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-10 Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-Acidic</td><td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human R-Spondin I Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>4546-RS</td><td></td></tr><tr><td>BenchRocker 2D</td><td>Benchmark</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose 500g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-401</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604039</td><td>(1x), no Phenol Red</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Invitrogen</td><td>15250061</td><td>For cell counting slides</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Phenol Red</td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment 24-Well Plate</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well</td><td>Corning</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin Antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5733</td><td>Polyclonal Chicken IgY</td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>BioExpres</td><td>S-7350-1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochloride</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1254</td><td>Also known as ROCK inhibitor</td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of scaffold-free, three-dimensional insulin expressing pancreatoids from mouse pancreatic progenitors in vitro

췌 장 혈액 포도 당 항상성 및 소화를 함께 작동 하는 많은 다른 세포 유형의 구성 하는 복잡 한 기관 이다. 이 셀 형식 효소를 은닉 포상 세포는 arborized ductal 시스템 본질적인, 그리고 호르몬 생산 하는 내 분 비 세포에 효소의 수송에 대 한 책임을 포함합니다.
내 분 비 하는 베타 세포는 낮은 혈액 포도 당 수준에 인슐린을 생성 하는 본문에 유일한 셀 유형입니다. 당뇨병, 손실 또는 베타 세포의 기능 장애를 특징으로하는 질병 전염병 비율에 도달입니다. 따라서, 파생 약물 및 세포 기반 치료제 심사 목적으로 사용할 수 있는 베타 세포 개발 조사를 프로토콜을 확립 필수적 이다. 마우스 개발의 실험 조사는 필수, vivo에서 학문은 힘들고 시간이 많이 소요. 배양된 세포 검사;에 대 한 더 편리한 플랫폼을 제공 그러나, 그들은 세포 다양성, 건축, 조직과 세포 상호 작용 발견 유지할 수 없습니다 vivo에서. 따라서, 췌 장 organogenesis 및 생리학 조사 하는 새로운 도구를 개발 하는 것이 필수적입니다.
세포 구성 하 고 복잡 한, 순수 유능한 성인 기관으로 분화 췌 장 상피 세포는 organogenesis의 발병에서 mesenchyme와 가까운 협회에서 개발. 췌 장 mesenchyme 내 분 비 개발에 대 한 많은 이해 되지 않는다 잘 아직, 따라서 생체 외에서 문화 동안 정리 하기 어려운 중요 한 신호를 제공 합니다. 여기, 우리 유지 mesenchyme, pancreatoids 라고 하는 문화 3 차원, 셀룰러 복잡 한 마우스 organoids에 프로토콜을 설명 합니다. E10.5 murine 췌 장 새싹은 해 부, 해리, 및 비 계 없는 환경에서 경작. 이러한 셀을 떠 자기 mesenchyme 개발 pancreatoid 및 내 분 비 베타 세포에는 포상 및 덕트 세포 개발의 강력한 수 포와 함께 조립. 이 시스템은 organogenesis, 또는 약물 이나 작은 분자, 유전자 검사에 대 한 세포 운명 결정, 구조, 조직과 morphogenesis, 세포-세포 상호 작용을 공부 하 사용할 수 있습니다.

마우스 배아 자 궁 경적에서 e10.5에서의 주의 해 부 추가 해 부 (그림 1A)에 대 한 PBS에 손상 되지 않은 배아 항복 한다. 위장은 배아 (그림 1B), 내장 및 위 (그림 1C F)의 교차점에서 등 쪽 췌 장 새싹의 분별을 허용에서 효율적으로 제거할 수 있습니다. E10.5 췌 장 새싹 이?...

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Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

여기, 선물이 해리 했다 부동성 e10.5 췌 장 창시자와 관련된 mesenchyme 3D murine pancreatoids을 표현 하는 인슐린을 생성 하는 프로토콜.

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

generation-scaffold-free-three-dimensional-insulin-expressing

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

9.0K 조회수.  Baylor College of Medicine. 여기, 선물이 해리 했다 부동성 e10.5 췌 장 창시자와 관련된 mesenchyme 3D murine pancreatoids을 표현 하는 인슐린을 생성 하는 프로토콜.

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In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

연구

발생학

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of pancreatic progenitor cells that can be used for the study of and future treatment of diabetes. This article outlines a four-stage differentiation protocol designed to generate pancreatic progenitor cells from human embryonic stem cells (hESCs). This protocol can be applied to a number of human pluripotent stem cell (hPSC) lines. The approach taken to generate pancreatic progenitor cells is to differentiate hESCs to accurately model key stages of pancreatic development. This begins with the induction of the definitive endoderm, which is achieved by culturing the cells in the presence of Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and CHIR990210. Further differentiation and patterning with Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) and Dorsomorphin generates cells resembling the posterior foregut. The addition of Retinoic Acid, NOGGIN, SANT-1 and FGF10 differentiates posterior foregut cells into cells characteristic of pancreatic endoderm. Finally, the combination of Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamide and NOGGIN leads to the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ cells. Flow cytometry is performed to confirm the expression of specific markers at key stages of pancreatic development. The PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors at the end of stage 4 are capable of generating mature &#946; cells upon transplantation into immunodeficient mice and can be further differentiated to generate insulin-producing cells in vitro. Thus, the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors, as demonstrated in this protocol, is of great importance as it provides a platform to study human pancreatic development in vitro and provides a source of cells with the potential of differentiating to &#946; cells that could eventually be used for the treatment of diabetes.

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Here we describe a 4-stage protocol to differentiate human embryonic stem cells to NKX6-1+ pancreatic progenitors in vitro. This protocol can be applied to a variety of human pluripotent stem cell lines.

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human developmental processes. Stepwise directed differentiation that recapitulates developmental processes is one of the major ways to generate pancreatic cells including pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) pancreatic progenitor cells. Conventional protocols initiate the differentiation with small colonies shortly after the passage. However, in the state of colonies or aggregates, cells are prone to heterogeneities, which might hamper the differentiation to PDX1+ cells. Here, we present a detailed protocol to differentiate hPSCs into PDX1+ cells. The protocol consists of four steps and initiates the differentiation by seeding dissociated single cells. The induction of SOX17+ definitive endoderm cells was followed by the expression of two primitive gut tube markers, HNF1&#946; and HNF4&#945;, and eventual differentiation into PDX1+ cells. The present protocol provides easy handling and may improve and stabilize the differentiation efficiency of some hPSC lines that were previously found to differentiate inefficiently into endodermal lineages or PDX1+ cells.

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Here, we present a detailed protocol to differentiate human pluripotent stem cells (hPSCs) into pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) cells for the generation of pancreatic lineages based on the non-colony type monolayer growth of dissociated single cells. This method is suitable for producing homogenous hPSC-derived cells, genetic manipulation and screening.

효율적인 세대의 췌 장/십이지 Homeobox 단백질 1+ 뒤 Foregut/췌 장 창시자 접착 문화에 hPSCs에서

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

생체공학

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to diabetes. hPSC-derived insulin-secreting cells can be generated for cell therapy and disease modeling,&#160;however,&#160;with limited efficiency and functional properties. hPSC-derived pancreatic progenitors that are precursors to beta cells and other endocrine cells, when co-express the two transcription factors PDX1 and NKX6.1, specify the progenitors to functional, insulin-secreting beta cells both in vitro and in vivo. hPSC-derived pancreatic progenitors are currently used for cell therapy in type 1 diabetes patients as part of clinical trials. However, current procedures do not generate a high proportion of NKX6.1 and pancreatic progenitors, leading to co-generation of non-functional endocrine cells and few glucose-responsive, insulin-secreting cells. This work thus developed an enhanced protocol for generating hPSC-derived pancreatic progenitors that maximize the co-expression of PDX1 and NKX6.1 in a 2D monolayer. The factors such as cell density, availability of fresh matrix, and dissociation of hPSC-derived endodermal cells are modulated that augmented PDX1 and NKX6.1 levels in the generated pancreatic progenitors and minimized commitment to alternate hepatic lineage. The study highlights that manipulating the cell&#39;s physical environment during in vitro differentiation can impact lineage specification and gene expression. Therefore, the current optimized protocol facilitates the scalable generation of PDX1 and NKX6.1 co-expressing progenitors for cell therapy and disease modeling.

The present protocol describes an enhanced method to increase the co-expression of PDX1 and NKX6.1 transcription factors in pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) in planar monolayers. This is achieved by replenishing the fresh matrix, manipulating cell density, and dissociating the endodermal cells.

2D 배양 시스템에서 인간 만능줄기세포를 췌장 베타세포 전구체로 분화

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

인간 만능 줄기세포를 인슐린 생산 섬 클러스터로 분화(Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-producing Islet Clusters)

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

인슐린을 표현 콜로니를 형성 Progenitors에 대한 정량 분석

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

생물학

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

인쇄 3D 세포 -라덴 췌장 조직 구성을 인쇄를위한 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오 잉크

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

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