אנו מודים Jolanta Chmielowiec לדיון מועיל לגבי פרוטוקול ו כתב היד. אנו מודים גם בנג'מין Arenkiel לגישה מיקרוסקופ קונפוקלי. עבודה זו נתמכה על ידי NIH (P30-DK079638 ל מ ב) ו- T32HL092332-13 M.A.S. ו מ ב מקנייר רפואי לקרן (מ ב), ליבת קונאפוקלית רוחני BCM, מרכז מחקר התפתחותיות (NIH U54 HD083092 מ יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי של הילד בריאות והתפתחות האדם).

כל הניסויים המתוארים בשיטה זו אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של ביילור לרפואה.
1. הכנת העכבר מתחלקים היום 10.5 אבות הלבלב
הערה: פרוטוקול זה לא צריך להיות בעקבות בתנאים סטריליים עד שלב 2, אולם זה אופטימלי לחטא כלי ניתוח, לרסס עם אתנול 70% לפני השימוש.
<ol><li>כדי להגדיר עבור ניתוח, למלא דלי קרח ומניחים מכולה של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) בתוך הקרח. נקה שני שקצהו בסדר. מלקחיים ומספריים הקרע עם 70% אתנול. מיכל עם פחות שלושה בורוסיליקט נימי שוכן בסמוך לאזור לנתיחה, צינורות, על פיפטה בפה, מצית, ומסונן 1,000 טיפים פיפטה µL.<ol>
<li>להכין לפחות 1 מ"ל של 1.25 מ"ג/מ"ל dispase קר סטיריליים למהול במים ולשתות, מקום הבאר השנייה של צלחת טוב 12 על קרח. להכניס PBS הראשונה, השלישית, הרביעית בארות 12 טוב צלחת. מקום 1 מ"ל של 0.05% טריפסין ב mL 1.5 צינור על קרח. לחמם של חממה חזק כדי 37 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>המתת חסד e10.5 עכברים בהריון-מתוזמן בהתאם להנחיות IACUC. לרסס את הבטן עם 70% אתנול כדי לנקות את האזור לפני ביצוע בצורת V חתך באזור איברי המין של העכבר באמצעות מלקחיים ומספריים ולהמשיך אותו עד הסרעפת. הערה: הופעת פקק בנרתיק בתוך פרוטוקול זה מציינת היום 0.5. באמצעות 5 - 6 בת עכברים, עלייה במשקל של יותר מ 2 g פועלת כאמצעי משני של הספגה מוצלחת.<ol>
<li>בזהירות לסלק את הרחם על ידי ביצוע חתך על החלקים לרוחב מעייניו של הרחם, מושך את האיבר כלפי מעלה מן העכבר, ובעקבות החתך עד באזור איבר המין לפני חוזר בצד הנגדי. מקום זה 10 ס מ צלחת פטרי עם PBS קר. הערה: זה אפשרי להשיג organoids של תאים e11.5 הפומבית, אולם בניגוד pancreatoids e10.5, organoids אלה עדיין לא מאופיינים ובכך עשויים לא לשמור את היכולת להבדיל לתוך כל שלוש שושלות הלבלב הגדולות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ אור לנתיחה, מניחים על צלחת פטרי ופתח בזהירות את רקמת הרחם על ידי הצבת שני מלקחיים בין כל העובר קילוף רקמות מן שק החלמון. העברת העוברים על ידי האוחז שק החלמון בעדינות עם מלקחיים, במקום 10 ס מ פטרי טריים PBS קר. מניחים על צלחת פטרי על קרח. הערה: חשוב heedfully להסיר את העוברים, רצוי ויתוחזקו שק החלמון, כמו הסרת כוחני יכול למשוך את חבל הטבור, לקרוע טישו של העובר ולחשוף את השלמות. המבנית.</li>
	<li>במקום מספר PBS טיפות על מכסה פטרי 10 ס מ. להשתמש אלה טיפות להעביר את העובר במהלך ניתוח כמו רקמות extraembryonic יוסרו כדי להבטיח ניראות. להעביר את העובר טיפה PBS ולהסיר בעדינות שק החלמון באמצעות מלקחיים, בעוד העוברים הנותרים נשאר PBS על קרח (איור 1א'). הסר את הראש לפני העברת העובר טיפה PBS חדש באמצעות מלקחיים להגיש בקלות ראש העובר, לא נזק לרקמת (איור 1B). הערה: הרקמה ייתכן שתצטרך להעביר בתדירות גבוהה יותר טיפות PBS צח מזו המתוארת כאן, בהתאם לאטימות של הנוזל.<ol>
<li>בטיפה PBS חדשים, להסיר בלוטות forelimb באמצעות מלקחיים (איור 1B). להכניס מלקחיים בתוך הפתח שבו האיבר באד היה נוכח ונפרק בעדינות רק הרקמה החיצוני ביותר anteriorly (איור 1B). סיבוב העובר וחזור לכיוון אחורי, ועוצרים ניצן hindlimb. בשלב זה, מערכת העיכול צריך להיות גלוי (איור 1B).</li>
		<li>האזור האחורי של מערכת העיכול יש עיקול קטן (איור 1F). הכנס מלקחיים מאחורי העיקול הזה הפתח בין האזור בעמוד השדרה של קיר הגוף של מערכת העיכול. ניתוק של מערכת העיכול, עובד לאט כלפי מעלה עד האזור הקדמי ביותר איפה אזור הלב מתחבר (איור 1B-E). אופציונלי: להסיר את הלב הקדמוני ניצנים כבד מהאזורים הגחון של מערכת העיכול, להשאיר רק את הצינור בטן רציף. בפעמים הראשונות פרוטוקול זה מבוצע שיהיה קל יותר לעזוב את הלב והכבד כמו ציוני הגחון עד המורפולוגיה של מערכת העיכול ואת ניצן הלבלב הגבי הם יותר מוכר (איור 1C ו- D ).</li>
		<li>העברה של מערכת העיכול ה-droplet PBS טריים.</li>
		<li>לקחת מלקחיים בעדינות לצבוט את הרקמה מתחת באיבו בולטות המעי, להרים מעט את הרקמה החיצונית את (איור 1D-F). הערה: ניצן הלבלב הגבי ממוקם בין הקיבה והמעי (איור 1C-G). ניצן הלבלב מתחת צריך להיראות כמו מבנה עגול, הכפתוריים (איור 1G).</li>
		<li>במקום מלקחיים איפה הניצן מתחבר המעי, קמצוץ כלפי מעלה כדי לשחרר את הניצן (איור 1G). רחץ פעם אחת בתוך בועה PBS חדש לפני העברת הניצן לתוך הבאר הראשונה של צלחת טוב 12 ב- PBS קר על קרח. חזור עד ניצנים כל שנאסף עוברי והניח בתוך הבאר הראשונה של צלחת טוב 12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>המקום ה-12 מגישים גם במיקרוסקופ אור לנתיחה. לספור את מספר בלוטות הלבלב בהצלחה גזור מאוחר יותר לחשב את יחס פיצול.<ol>
<li>המקום מסוננים 1,000 µL פיפטה עצה לתוך פיפטה בפה עם צינור קפילרי מצורף. להבה לעקר את צינור קפילרי וליצור עיקול בצינור כדי להקל על השימוש. להשתמש את נימי כדי להעביר ניצנים הפתרון השני dispase קר טוב המכיל למשך 2 דקות לפני העברת הבאר השלישית תסיים נקי (איור 1G). הערה: בעת העברת ניצנים dispase PBS, להימנע מלגעת הרקמה עד הקצה של הצינור נימי. אם הרקמה נתקע על קצה הצינור, פיפטה למעלה ולמטה או לנער בפתרון PBS נקי עד השתחררו.</li>
		<li>פיפטה ניצנים למעלה ולמטה, ולהעביר אל הבאר הרביעית עם PBS נקי. לבסוף, באמצעות העברת המכשיר נימי ניצנים כדי ברכבת התחתית 1.5 mL עם 0.05% טריפסין. למקם את הצינור שייקר 37 oC מראש ומחוממת ומנערים במהירות של 1,500 סל ד במשך 4 דקות.</li>
		<li>מערבולת במשך כ 10 s ואז מיד למקם את הצינור צנטריפוגה ספין בשביל 5 דקות ב- 200 g. להסיר את הכל אלא כ 50 µL של פתרון בזהירות כדי לא להפריע את התאים centrifuged (איור 1G).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. חלופה מועדפת אבות כדי ליצור Pancreatoids culturing
הערה: הבאות צריכה להתבצע באווירה סטרילית בשכונה תרביות רקמה רגיל, באמצעות הליכים סטנדרטיים סטרילי.
<ol><li>עבור כל ניצן אסף, להוסיף 400 µL organogenesis מדיה16,17 (טבלה 1) התאים centrifuged. דופק מערבולת שלוש פעמים, µL צלחת 100 לכל טוב של קובץ מצורף נמוך 96 טוב צלחת, פיצול ניצנים ביחס של 1:4 (איור 1G).</li>
	<li>בדוק תחת המיקרוסקופ לדמיין חלופה מועדפת תאים באופן חופשי צף (איור 1H). מקם את המנה תרבות חממה 37 oC עם 5% CO2 על כיסא נדנדה במהירות בינונית.</li>
	<li>עקוב אחר ההתקדמות של pancreatoids מדי יום. להחליף 100 µL של מדיה טריים כל 3 ימים, מדיה pipetting בקפידה תחת בקרה מיקרוסקופית בשכונה כדי להסיר תוך השארת pancreatoid הבאר. לחלופין, טרי 100 µL של התקשורת ניתן להוסיף באר חדשה ו pancreatoid מועברים באמצעות בורוסיליקט קפילר המצורפת פיפטה בפה, 1000 µL מסונן פיפטה עצה.</li>
</ol>3. עיבוד Pancreatoids עבור הדמיה Immunofluorescent
<ol><li>כדי לעבד pancreatoids לתמונות immunofluorescent, יש להכין תחילה 4% paraformaldehyde/PBS, pH7.4 (PFA) פתרון. במקום 50 µL של 4% PFA בבארות של 96 ובכן צלחת.<ol>
<li>באמצעות צינורות קפילר בורוסיליקט פיפטה בפה עם קצה פיפטה המסוננות 1,000 µL, להעביר pancreatoids בינוני תרבות לוקח מדיה קטנה ככל האפשר לתוך הבאר טריים עם 4% מחברים. ממוקם על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.</li>
		<li>להעביר pancreatoids מ- 4% PFA לבאר עם µL 100 ל- PBS טריים, רוק בטמפרטורת החדר במשך 5-10 דק חוזר עבור סכום של שלושה שוטף PBS טריים. הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן, עם pancreatoids המאוחסן µL 100 ל- PBS ב 4 oC עד לשבוע אחד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור הדמיה wholemount (מומלץ אם הם מתאימים, חלופית הגישה בסעיף 3.3. ואת מיקרוסקופ ב- 3.4.), להעביר מהערוץ סרום חמור 5% µL 50 ב- PBS 1 x עם חומר ניקוי nonionic 0.1% (PBST) כדי לחסום. סלע בן לילה בבית 4 oC או לחילופין במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.<ol>
<li>להעביר pancreatoids באר חדשה המכילה נוגדנים העיקרי מעורבבת עם µL 50 של נסיוב חמור 5% 1 x PBST. הסלע בצורה אופטימלית, 24 שעות בבית 4 oC (לפחות 12 שעות אבל עד 36 שעות). הערה: נוגדנים המופיעים בטבלה של חומרים נגד Chga (1: 100), DBA (1:400), Vim (1:400), Pdx1 (1: 100) מתאימים wholemount מכתימה; נוגדנים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה.</li>
		<li>העברת pancreatoids לבאר, המכיל 100 µL של PBST טריים לשטוף את סלע במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של שלושה שוטף PBST טריים.</li>
		<li>להעביר pancreatoids באר חדשה המכילה נוגדנים משניים מעורבבת עם µL 50 של נסיוב חמור 5% 1 x PBST. להגן על הבסיס מפני האור ולמקם 4 oC, נדנדה עבור בצורה אופטימלית 24 שעות (לפחות 12 שעות אבל עד 36 שעות). הערה: כל נוגדנים משניים המופיעים counterstain גרעיני הטבלה של חומרים , דאפי מתאימים wholemount מכתים.</li>
		<li>להעביר pancreatoids באר חדשה המכילה 100 µL 1 x PBST ורוק בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות חוזר עבור סכום של שלושה שוטף 1 x PBST. בכביסה השלישי והאחרון, להוסיף 300 ננומטר דאפי.</li>
		<li>לבסוף, למקם את µL 100 של PBS ונקייה בחנות 4 oC מוגן מפני אור במשך שבוע לפני הדמיה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, למרות התוצאות הטובות ביותר של הדמיה מיד לאחר מכתים. כדי למנוע תנועה של pancreatoids במהלך דימות אך למנוע ייבוש, למקם את כל pancreatoid droplet 20 µL ל- PBS. אם pancreatoids אינם נשארים עדיין, להפחית את נפח PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור מקטעים קפוא, להעביר pancreatoids מהערוץ בתוך 30% תמיסת סוכרוז למשך הלילה בבית 4 oC.<ol>
<li>הוסף מדיה ההטבעה בבועה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. בעזרת מלקחיים תחת בקרה מיקרוסקופית, משרים pancreatoids בדחיפה בעדינות דרך התקשורת ההטבעה מספר פעמים כדי להסיר שאריות סוכרוז לפני העברת גוש רקמה עם מדיה ההטבעה קפוא.</li>
		<li>מניחים את רקמת בלוק על קרח יבש עד קפואים והמקטע על cryostat ב 8 מיקרומטר. הערה: סעיפים שניתן לאחסן ב-80 oC או immunostained מיד.</li>
		<li>מאפשר מקטעים מ-80 oC להפשיר בטמפרטורת החדר במשך כ 5 דקות עד יבש. לצייר מחסום הידרופובי באמצעות העט pap הידרופובי סביב הרקמה ולחסום את השימוש סרום חמור 5% בדילול 1 x PBST למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להסיר מדיה ולהחליף מיד עם נוגדנים העיקרי מדולל 5% חמור בסרום מדולל ב- x 1 PBST לילה בבית 4 oC.</li>
		<li>הסר את הפתרון העיקרי ולשטוף רקמות שלוש פעמים עם 1 x PBST 10 דקות כל אחד. בעקבות זאת, הוספת נוגדנים משניים פתרון מדולל בנסיוב חמור 5% בדילול 1 x PBST לשעה בטמפרטורת החדר להגן על שקופיות מפני אור.</li>
		<li>הסר את הפתרון המשני ולשטוף שקופיות שלוש פעמים ב 1 x PBST 10 דקות כל אחד. בכביסה הסופי, להוסיף 300 ננומטר דאפי.</li>
		<li>להסיר מדיה ולהוסיף מדיה הרכבה של coverslip. חנות שקופיות מן האור 4 oC עד מוכן תמונה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. בידוד של RNA מ Pancreatoids לניתוח התעתיק
<ol><li>לאסוף את pancreatoids באמצעות נימי בורוסיליקט המצורפת פיפטה בפה עם מסוננים 1,000 µL פיפטה עצה בשביל בעקרות ומקום לתוך µL 500 של חומצה guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם פתרון צינור 1.5 מ. ב-80 oC או פנה/י מיד לבידוד RNA.</li>
	<li>לבידוד RNA, להפשיר דוגמאות על קרח במידת הצורך, להוסיף 100 µL של כלורופורם. מערבולת טוב והמקום ב 4 oC במשך 15 דקות מראש מגניב צנטריפוגה כדי 4 oC.<ol>
<li>מניחים צינורות לתוך צנטריפוגה, ספין בשביל 20 דקות ב g 12,000 בבית 4 oC.</li>
		<li>הסר בזהירות את צינורות כדי לא להפריע ההפרדה של שכבות. באמצעות פיפטה 200 µL, לאסוף את הפתרון ברור מימית ולמקם לתוך צינור 1.5 mL החדש, משאיר מאחור כמות קטנה אל מאגר חלבון לבן שכבה, שכבת ה-DNA ורוד. לא לגעת בקצה פיפטה לכל דבר בתהליך זה, אל תיגע דפנות הצינור 1.5 mL.</li>
		<li>להוסיף 500 µL של 100% אלכוהול איזופרופיל הצינור החדש המכילות את שכבה מימית ואת מערבולת. בסדר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, עוד על הקרח, או עבור מרבית המשקעים להשאיר למשך הלילה ב-20 oC.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 12,000 g למשך 15 דקות בבית 4 oC כדי הצניפה את הרנ א. הסר את אלכוהול איזופרופיל מבלי להפריע בגדר. הערה: כמו pancreatoids הם קטנים, סביר שבגדר לא יהיו גלויים.</li>
		<li>הוסף קר, 75% אתנול, היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. מקום בצנטריפוגה, ספין ב 9,000 g x 10 דקות בבית 4 oC. הסר את אתנול וביו -ספין למשך 2 דקות ב 9,000 x g.</li>
		<li>להשתמש על פיפטה 200 µL כדי להסיר כל אתנול שנותרו בצינור, ללא פנייה אל האזור שבגדר שוכן. להשאיר את הכיפה פתוח על המסך למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להבטיח אידוי של אתנול שיורית.</li>
		<li>Resuspend צנפה על ידי vortexing ב 20 µL של מים נקיים, ללא נוקלאז. אופציונלי: חום הרנ א-65 oC למשך 3 דקות ומיד להחזיר הקרח. RNA יכול להיות מאוחסן ב-80 oC או השתמשו מיד שעתוק במהופך, qPCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Akkerman, N., Defize, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dawn+of+the+organoid+era:+3D+tissue+and+organ+cultures+revolutionize+the+study+of+development,+disease,+and+regeneration.">Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration.</a> Bioessays. 39 (4), (2017).</li><li>Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+expressed+by+murine+embryonic+pancreatic+mesenchyme+enhance+generation+of+insulin-producing+cells+from+hESCs.">Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs.</a> Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).</li><li>Landsman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+mesenchyme+regulates+epithelial+organogenesis+throughout+development.">Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).</li><li>Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pancreatic+differentiation+by+signals+from+blood+vessels.">Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels.</a> Science. 294 (5542), 564-567 (2001).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+kidney+organoids+by+differentiation+of+human+pluripotent+cells+to+ureteric+bud+progenitor-like+cells.">The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Loftus, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinar+cell+apoptosis+in+Serpini2-deficient+mice+models+pancreatic+insufficiency.">Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency.</a> PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).</li><li>Kleeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pancreatitis.">Chronic pancreatitis.</a> Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).</li><li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+signals,+and+lineages+in+pancreas+development.">Genes, signals, and lineages in pancreas development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li><li>Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pancreas+organogenesis+from+dispersed+mouse+embryonic+progenitors.">In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro.">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).</li><li>Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic-stem-cell-derived+progenitors+by+organ-matched+mesenchyme.">Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme.</a> Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).</li><li>Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+pancreatoids+with+native+mesenchyme+develop+Insulin+producing+endocrine+cells.">Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).</li><li>Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+multiple+steps+of+pancreatic+differentiation.">Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).</li><li>Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factors+Nkx6.1+and+Nkx6.2+possess+equivalent+activities+in+promoting+beta-cell+fate+specification+in+Pdx1++pancreatic+progenitor+cells.">The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells.</a> Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).</li><li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+is+required+for+maintenance+of+the+pancreatic+progenitor+cell+pool.">SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).</li><li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transcriptional+regulator+Ptf1a+in+converting+intestinal+to+pancreatic+progenitors.">The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors.</a> Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).</li><li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li><li>Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+binding+sites+for+Dolichos+biflorus+agglutinin+at+the+apical+aspect+of+collecting+duct+cells+in+rat+kidney.">Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney.</a> Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).</li><li>Reichert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+genetic+manipulation+of+mouse+pancreatic+ductal+cells.">Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).</li><li>Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromogranins+A+and+B:+the+first+25+years+and+future+perspectives.">The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives.</a> Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).</li><li>Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+alpha-cell+dysfunction+in+diabetes.">Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes.</a> Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).</li><li>Del Prato, S., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-+and+alpha-cell+dysfunction+in+type+2+diabetes.">Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes.</a> Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).</li><li>Piciucchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocrine+pancreatic+insufficiency+in+diabetic+patients:+prevalence,+mechanisms,+and+treatment.">Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment.</a> International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).</li><li>Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+of+the+Exocrine+Pancreas+in+Type+1+Diabetes.">Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes.</a> Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).</li><li>Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+insufficiency+in+type+1+and+type+2+diabetics+of+Indian+origin.">Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin.</a> Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ההתקדמות של מודלים התרבות התא חיוני כראוי מודל פיתוח, לייצר סוגי תאים הרלוונטית קלינית, בדיקת תרופות יעילות או אפילו להשתלת לחולים. עם זאת, באופן מלאכותי recapitulating פיתוח בקערה הוא מאתגר כמו שאנחנו עדיין רחוק מלהיות הבנת המנגנונים של organogenesis, פיזיולוגיה ויוו. כך הם במבחנה התאים שנוצ...

המופקע על מנגנוני להתפתחות תקינה של הפיזיולוגיה הוא בעל חשיבות עליונה להבין מחלה אטיולוגיה ולטפח בסופו של דבר שיטות טיפול. בעוד culturing, המבדילים תאי גזע מאפשר ניתוח תפוקה גבוהה ומהירה של פיתוח, הוא מוגבל על ידי הגוף קיים הידע בנושא מנגנוני ויסות גורל, באופן מלאכותי recapitulates פיתוח יחסית מדינה הומוגנית, מימדי1,2. לא רק ויוו פיתוח מושפע השפעות חיצוני, עם סוגי תאים שונים נישה, וחשש מספקת paracrine אותות ותמיכה ארגונית כדי להנחות organogenesis, אלא הפונקציה של תאים אלה מסתמך גם על שלהם הסביבה עבור הדרכה3,4,5. לאור החשיבות של אלה סימנים חיצוניים, המגבלות של בידול פרוטוקולים, מהות מפרך ויוו העכבר מודלים, מערכות חדשות נדרשים לחקור השפעול של תהליכים התפתחותיים בסיסיים ופיזיולוגיה.
הופעתה של פרוטוקולים ליצירת תלת מימדי, מורכבים organoids מספק מערכת קונגרואנטי ונוח ללמוד organogenesis, פיזיולוגיה, יעילות התרופה ו פתוגנזה אפילו. הקמת organoids מאתר עבור מערכות שונות כגון הקיבה6 ו המעי7 הרחיבו את ההבנה שלנו של organogenesis, מתן כלי ללמוד המורכבות התפתחותית עם מגבלות מועטות יותר מאשר ויוו ומודלים במבחנה . עקב ההתפתחויות הללו בתוך תא צורב מאתר היווצרות, כניסתו של אדם pluripotent גזע תאים אנושיים מעיים8, רשתית9, כליות10,11, מוחי12 organoids הופקו, ואת זה רפרטואר מוגבל רק על-ידי הידע הקיים לגבי מנגנוני התפתחות.
עניין מיוחד הוא הדור של הלבלב organoids, כמו מספר עצום של מחלות המכות סוגי התאים בלבלב, כולל תאים acinar וצינורות אי ספיקה הלבלב אקסוקרינית13, acinar תאי לבלב14ו תאי ביתא סוכרת15. רכישת ידע לגבי הפיתוח של סוגי התאים הללו יכול לסייע להבנת הפתולוגיה שלהם, גם, משמשים כפלטפורמה אישית והתרופות הקרנה או השתלת. בעבר, Greggio. ואח פיתח שיטה ליצירת organoids הלבלב מאתר זה מסכם את הדברים ויוו מורפוגנזה ולפתח מבנים מאורגנים, תלת מימדי, מתחם המורכב וכל השברים תא אפיתל הלבלב סוגי16,17. זהו צעד חשוב בשטח הלבלב, במיוחד כמו עשיית תאים במבחנה ניתן לאפשר חקירה הביולוגי של התפתחות תאי בטא. עם זאת, המחסור תאים אנדוקריני שהוקמה ב פרוטוקול זה אלא אם כן organoids היו מושתלים לתוך רקמות, איפה הנישה יכול אינטראקציה ולספק רמזים הדרכה17. מזנכימה מהווה את החלק הגדול ביותר של הגומחה, בכבדות כעוטפת האפיתל מתפתח מן בשלבים המוקדמים של organogenesis כדי בשלבים מאוחרים יותר, כולל delamination האנדוקרינית ובידול3,4, 18. האינטראקציה של מזנכימה הקל המתפתח עדיין דוגמה נוספת של איתות חיצוני ואת החשיבות של שמירה על ויוו המורכבות הסלולר ללמוד organogenesis.
כאן, אנו נתאר כיצד לייצר organoids הלבלב תלת מימדי, הנקרא pancreatoids, מ e10.5 הפומבית מאתר אבות הלבלב. Pancreatoids אלה שומרים על מזנכימה מקורית, בעצמם בתנאים לתרשים ולהפיק כל סוגי תאי הלבלב העיקריים, כולל מספר חזקים של תאי הבטא האנדוקרינית19. גישה זו היא המתאימה ביותר עבור הניתוח של פיתוח האנדוקרינית, כמו פרוטוקולים הקודמים חוסר בידול האנדוקרינית חזקים. עם זאת, המשתמשים בפרוטוקול עבור organoids הלבלב כפי שתואר על ידי Greggio et al. מתאים יותר לניתוח של הסתעפות אפיתל הלבלב, מורפוגנזה, בתור הסתעפות יותר מוגבל ב- pancreatoids.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>BarnStead NanoPure Nuclease-free water</td><td>ThermoFisher</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Capillary Tubes</td><td>Sutter Instruments</td><td>GB1007515</td><td>O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Repellent 96-Well Microplate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>U-bottom</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233306</td><td></td></tr><tr><td>Chromogranin-A antibody</td><td>Abcam</td><td>ab15160</td><td></td></tr><tr><td>Compact, Modular Stereo Microscope M60</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10310</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counter Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>ThermoFisher</td><td>957000L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidine-2&#039;-phenylindole-dihydrochloride)</td><td>Roche</td><td>10 236 276 001</td><td>Powder</td></tr><tr><td>DBA antibody</td><td>Vector Lab</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, Powder</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip</td></tr><tr><td>EGF (Epidermal growth factor)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri Cycle CO2 Incubators</td><td>ThermoFisher</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>OB10001</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>INSM1 Antibody</td><td>Santa Cruz BioTechnology</td><td>sc-271408</td><td>Polyclonal Mouse IgG</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>a4164</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia Isoflurane, USP</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Antibody</td><td>Dako</td><td>A056401</td><td>Polyclonal Guinea Pig</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universal</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>KaryoMax</td><td>10575090</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442615</td><td></td></tr><tr><td>Mouse C-Peptide ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-CPTMS-E01</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-INSMSU-E01</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Microtome Blades</td><td>ThermoFisher</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pdx1 antibody</td><td>DSHB</td><td>F6A11</td><td>Monoclonal Mouse MIgG1</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td><td>VWR</td><td>15160-157</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>1.5mL Capacity</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-10 Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-Acidic</td><td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human R-Spondin I Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>4546-RS</td><td></td></tr><tr><td>BenchRocker 2D</td><td>Benchmark</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose 500g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-401</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604039</td><td>(1x), no Phenol Red</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Invitrogen</td><td>15250061</td><td>For cell counting slides</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Phenol Red</td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment 24-Well Plate</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well</td><td>Corning</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin Antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5733</td><td>Polyclonal Chicken IgY</td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>BioExpres</td><td>S-7350-1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochloride</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1254</td><td>Also known as ROCK inhibitor</td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of scaffold-free, three-dimensional insulin expressing pancreatoids from mouse pancreatic progenitors in vitro

הלבלב הוא שאיבר מורכב מורכב רבים לסוגי תאים שונים לעבוד יחד כדי לווסת הומאוסטזיס הגלוקוז הדם והעיכול. סוגי תאים אלה כוללים מפריש אנזימים תאים acinar, מערכת ductal arborized אחראי להובלה של אנזימי התאים האנדוקריניים במעיים, הורמונים.
בטא-תאים אנדוקריני הם סוג התא היחיד בגוף המייצרים אינסולין כדי להוריד את רמות הגלוקוז בדם. סוכרת, מחלה המאופיינת על ידי לאובדן או את תפקוד תאי בטא-מגיע לממדים של מגיפה. לכן חיוני להקים פרוטוקולים כדי לחקור את התפתחות תאי בטא יכול לשמש לסינון למטרות להפיק את התרופה ואת מבוססת תא הרפוי. בעוד חקירה ניסויית של פיתוח העכבר הוא חיוני, אין ויוו מחקרים הם מפרך ולגזול. תאים בתרבית מספקים פלטפורמה נוחה יותר להקרנה; עם זאת, הם אינם מסוגלים לשמור על גיוון הסלולר, ארגון אדריכלי, אינטראקציות סלולרי נמצאו ויוו. לכן חיוני לפתח כלים חדשים לחקור organogenesis הלבלב ופיזיולוגיה.
תאים אפיתל הלבלב לפתח בשיתוף הדוק עם מזנכימה מראשית organogenesis תאים לארגן, להבדיל לתוך האיבר למבוגרים מורכבות, כשיר מבחינה פיזיולוגית. הלבלב מזנכימה מספק אותות חשוב לפיתוח האנדוקרינית, שרבים מהם אינם מובנים היטב, ולכן קשה לסכם במהלך התרבות במבחנה . כאן, אנו מתארים את פרוטוקול organoids תלת מימדי, תאי עכבר מורכבים תרבות לשמור מזנכימה, הנקרא pancreatoids. ניצן הלבלב מאתר e10.5 גזור, חלופה מועדפת, תרבותי בסביבה נטולת לגרדום. אלו צפים תאים בעצמם עם מזנכימה עוטף את pancreatoid המתפתח ומספר תאי הבטא האנדוקרינית לפתח את acinar, את התאים צינור חזקים. מערכת זו ניתן ללמוד את האינטראקציות תא-תא תא גורל נחישות הארגון מבניים, מורפוגנזה, במהלך organogenesis, או על סמים, מולקולה קטנה, או בדיקה גנטית.

ניתוח זהיר של העכבר עוברי-e10.5 מן הקרן הרחם אמור להניב העוברים תקינים ב- PBS עבור ניתוח נוסף (איור 1א'). מערכת העיכול ניתן להסיר ביעילות של העובר (איור 1B), המתיר הבחנה של ניצן הלבלב הגבי בצומת של המעי, הקיבה (איור 1</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro at JoVE.com

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר אינסולין לבטא 3D מאתר pancreatoids בין לתרשים e10.5 הפומבית אבות הלבלב מזנכימה המשויך את...

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

generation-scaffold-free-three-dimensional-insulin-expressing

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

9.0K Views.  Baylor College of Medicine. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר אינסולין לבטא 3D מאתר pancreatoids בין לתרשים e10.5 הפומבית אבות הלבלב מזנכימה המשויך את...

Video: Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of pancreatic progenitor cells that can be used for the study of and future treatment of diabetes. This article outlines a four-stage differentiation protocol designed to generate pancreatic progenitor cells from human embryonic stem cells (hESCs). This protocol can be applied to a number of human pluripotent stem cell (hPSC) lines. The approach taken to generate pancreatic progenitor cells is to differentiate hESCs to accurately model key stages of pancreatic development. This begins with the induction of the definitive endoderm, which is achieved by culturing the cells in the presence of Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and CHIR990210. Further differentiation and patterning with Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) and Dorsomorphin generates cells resembling the posterior foregut. The addition of Retinoic Acid, NOGGIN, SANT-1 and FGF10 differentiates posterior foregut cells into cells characteristic of pancreatic endoderm. Finally, the combination of Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamide and NOGGIN leads to the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ cells. Flow cytometry is performed to confirm the expression of specific markers at key stages of pancreatic development. The PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors at the end of stage 4 are capable of generating mature &#946; cells upon transplantation into immunodeficient mice and can be further differentiated to generate insulin-producing cells in vitro. Thus, the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors, as demonstrated in this protocol, is of great importance as it provides a platform to study human pancreatic development in vitro and provides a source of cells with the potential of differentiating to &#946; cells that could eventually be used for the treatment of diabetes.

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Here we describe a 4-stage protocol to differentiate human embryonic stem cells to NKX6-1+ pancreatic progenitors in vitro. This protocol can be applied to a variety of human pluripotent stem cell lines.

בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; אבות הלבלב

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human developmental processes. Stepwise directed differentiation that recapitulates developmental processes is one of the major ways to generate pancreatic cells including pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) pancreatic progenitor cells. Conventional protocols initiate the differentiation with small colonies shortly after the passage. However, in the state of colonies or aggregates, cells are prone to heterogeneities, which might hamper the differentiation to PDX1+ cells. Here, we present a detailed protocol to differentiate hPSCs into PDX1+ cells. The protocol consists of four steps and initiates the differentiation by seeding dissociated single cells. The induction of SOX17+ definitive endoderm cells was followed by the expression of two primitive gut tube markers, HNF1&#946; and HNF4&#945;, and eventual differentiation into PDX1+ cells. The present protocol provides easy handling and may improve and stabilize the differentiation efficiency of some hPSC lines that were previously found to differentiate inefficiently into endodermal lineages or PDX1+ cells.

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Here, we present a detailed protocol to differentiate human pluripotent stem cells (hPSCs) into pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) cells for the generation of pancreatic lineages based on the non-colony type monolayer growth of dissociated single cells. This method is suitable for producing homogenous hPSC-derived cells, genetic manipulation and screening.

יעיל הדור של הלבלב/תריסריון גנים Homeobox חלבון 1+ אבות הלבלב במעי הקדמי/אחורי של hPSCs בתרבויות אדהזיה

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

פיגום נתמך השתלת איים בשומן השומן האפידידימלי של עכברים סוכרתית

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Bioengineering

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to diabetes. hPSC-derived insulin-secreting cells can be generated for cell therapy and disease modeling,&#160;however,&#160;with limited efficiency and functional properties. hPSC-derived pancreatic progenitors that are precursors to beta cells and other endocrine cells, when co-express the two transcription factors PDX1 and NKX6.1, specify the progenitors to functional, insulin-secreting beta cells both in vitro and in vivo. hPSC-derived pancreatic progenitors are currently used for cell therapy in type 1 diabetes patients as part of clinical trials. However, current procedures do not generate a high proportion of NKX6.1 and pancreatic progenitors, leading to co-generation of non-functional endocrine cells and few glucose-responsive, insulin-secreting cells. This work thus developed an enhanced protocol for generating hPSC-derived pancreatic progenitors that maximize the co-expression of PDX1 and NKX6.1 in a 2D monolayer. The factors such as cell density, availability of fresh matrix, and dissociation of hPSC-derived endodermal cells are modulated that augmented PDX1 and NKX6.1 levels in the generated pancreatic progenitors and minimized commitment to alternate hepatic lineage. The study highlights that manipulating the cell&#39;s physical environment during in vitro differentiation can impact lineage specification and gene expression. Therefore, the current optimized protocol facilitates the scalable generation of PDX1 and NKX6.1 co-expressing progenitors for cell therapy and disease modeling.

The present protocol describes an enhanced method to increase the co-expression of PDX1 and NKX6.1 transcription factors in pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) in planar monolayers. This is achieved by replenishing the fresh matrix, manipulating cell density, and dissociating the endodermal cells.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים למבשרי תאי בטא בלבלב במערכת תרבית דו-ממדית

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לצברי איים מייצרי אינסולין

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

Assay כמותי עבור אינסולין להביע המושבה יוצרי אבות

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Biology

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

רקמת הלבלב הנגזר מטריקס Bioink עבור הדפסת 3D Cell לאדן רקמות הלבלב בנייה

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

במבחנה הלבלב Organogenesis ממפוזר אבות עכבר עובריים

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video