プロトコルおよび原稿に関する有用な議論ありがとう省 Jolanta Chmielowiec。また、ベンジャミン ・ Arenkiel は共焦点顕微鏡へのアクセスに感謝我々。この作品は NIH (P30 - M.B. への DK079638) と T32HL092332-13 M.A.S. と M.B. と (M.B.) にマクネア医療財団、BCM 知的、発達障害研究センターの共焦点のコアによって支えられた (ユニスから NIH U54 HD083092ケネディ ・ シュライバー国立研究所母子保健と人間開発)。

このメソッドに記載されているすべての動物実験は、機関動物ケアおよび使用委員会のベイラー医科大学によって承認されました。
1. マウス胚日 10.5 膵前駆細胞の調製
注: このプロトコル必要はありません手順 2 まで無菌条件の下で続くことにしかし、それは解剖ツールを殺菌し、使用する前に 70% エタノールをスプレーするが最適。
<ol><li>郭清をセットアップする、氷のバケツを埋めるし、氷のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) のコンテナーを配置します。2 つの細い鉗子と解剖はさみの 70% エタノールで拭きます郭清範囲付近に設定、少なくとも 3 つホウケイ酸毛管容器チューブ口ピペット、ライターと 1,000 μ L ピペット チップをフィルタ リングします。<ol>
<li>滅菌水と氷の上 12 ウェル プレートの 2 番目の井戸の場所で希釈 1.25 mg/mL 冷たい当期の少なくとも 1 mL を準備します。最初、3 番目、および 4 番目の PBS を入れて 12 の井戸はウェル プレートします。氷の上チューブ 1.5 mL のトリプシンの 0.05% の場所 1 mL。あらかじめ 37 oc 以上に揺れインキュベーターを温める</li>
	</ol>
</li>
	<li>E10.5 IACUC ガイドラインに従ってタイミング妊娠マウスを安楽死させます。腹部をハサミ、鉗子を使ってマウスの性器で V 字切開を行う前に、地域をきれいにし横隔膜まで継続 70% エタノールをスプレーします。 注: このプロトコルで膣にプラグの外観は、0.5 日を示します。2 g 以上の体重増加は 5 - 6 週齢のマウスを使用して成功した含浸の二次的な対策として機能します。<ol>
<li>慎重に反対側に繰り返す前に陰部にこの切開し、上方マウスからの臓器を引っ張って、子宮の最上部の横部分で切開することで子宮を切除します。10 cm 冷 PBS でシャーレに入れること。 注: それはしかし e10.5 の pancreatoids とは異なりこれらオルガノイド特徴付けされていませんし、従ってすべての 3 主要な膵臓系譜への分化誘導能力が保持されない分離した e11.5 細胞からオルガノイドを得ることが可能です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>光解剖顕微鏡の下でペトリ皿を配置し、慎重にそれぞれの胚の間 2 つの鉗子を配置し、卵黄嚢から組織を剥離子宮の組織を開きます。把持鉗子と 10 cm シャーレ、新鮮な場所で軽く卵黄嚢胚を転送冷 PBS。氷の上にペトリ皿を配置します。 注: 胚、強制的な削除は、臍帯、胎児の組織をリッピングと構造の整合性を損なうことを引っ張ることができる卵黄嚢内で維持できれば heedfully を削除することが重要です。</li>
	<li>10 cm シャーレの蓋に複数 PBS 滴を配置します。これらの液滴を使用すると、初期胚胚体外組織が視認性を確保するために削除されると、解剖時に胚を転送します。PBS ドロップに胚を転送、鉗子を使用して残りの胚のまま氷上 (図 1A) PBS で卵黄嚢からそっと取り外します。胚を軽くティッシュ (図 1B) を損傷しないように、胚をスクープする鉗子を使用して新しい PBS ドロップに移動する前に頭を削除します。 注: 組織は、液体の不透明度に応じてここでは、説明よりも新鮮な PBS の液滴により頻繁に転送する必要があります。<ol>
<li>新しい PBS ドロップ鉗子 (図 1B) を使用して前肢芽を削除します。肢芽があった開口部に鉗子を配置し、ゆっくり前方のみほとんどの外部組織を引き裂く (図 1B)。胚を回転させ、肢芽で停止、後部方向に繰り返します。この時点で、消化管は目に見える (図 1B) をする必要があります。</li>
		<li>消化管の後部の地域は、わずかな曲がり (図 1 f) を持っています。消化管と体壁の脊髄領域の冒頭でこの曲の背後に鉗子を挿入します。消化管、心臓領域が (図 1B E) を接続する最も前方の領域に到達するまでゆっくりと上向きに働くをデタッチします。 (省略可能) は、原始の心と肝芽を削除連続腸内管だけを残して、消化管の腹側の地域から。このプロトコルが実行される最初の数回それは心臓と肝臓消化管および背側膵原基の形態まで腹側ランドマークが多いまましやすくなる可能性があります (図 1CとDはおなじみ).</li>
		<li>消化管を新鮮な PBS の液滴に転送します。</li>
		<li>鉗子を取るし、突出の芽と腸の下にティッシュを軽くピンチ (図 1D F) を外側の組織を少し持ち上げます。 注: 背側膵原基は胃と腸 (図 1C G) の間に位置します。下膵芽ラウンド、節くれだった構造 (図 1G) ようになります。</li>
		<li>芽が腸と上向きの芽 (図 1G) を緩めにピンチに接続する鉗子を配置します。新しい PBS バブルで氷冷 PBS で 12 ウェル プレートの最初のウェルに芽を転送する前に 1 つの時間を洗浄します。すべて芽胚から収集され、12 ウェル プレートの最初の井戸の配置までを繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>光解離顕微鏡 12 よく皿を配置します。正常に後分割比率を計算するために解剖膵芽の数をカウントします。<ol>
<li>場所フィルター 1,000 μ L ピペット チップ キャピラリー チューブと口のピペットに添付。炎はキャピラリー チューブを滅菌して使いやすさのためチューブにベンドを作成します。キャピラリーを使用すると、2 分の 2 番目も含んでいる冷たい当期ソリューションにきれいな PBS (図 1G) で 3 番目の井戸の中に転送する前に芽を転送します。 注: 当期から芽を PBS に転送する中に、は、キャピラリー チューブの先端にティッシュを触れないでください。組織は、チューブの先端をはまり、ピペットの上下またはゆるむまでクリーンソリューション PBS で横に振る。</li>
		<li>芽の上下、ピペットし、きれいな PBS の 4 番目の井戸に転送。最後に、0.05% と 1.5 mL チューブに芽キャピラリー デバイス転送を使用してトリプシン。予め温めておいた 37 oC シェーカーにチューブを置き、4 分間 1,500 rpm で振る。</li>
		<li>約 10 の渦 s すぐを置く遠心分離機で 200 で 5 分間スピン チューブ g. 削除遠心細胞 (図 1G) を邪魔しないよう慎重にソリューションのすべてが約 50 μ L。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Pancreatoids を形成する解離前駆細胞の培養
注: 次は滅菌滅菌の標準の手順を使用して、標準のティッシュ文化フードの雰囲気の中で実行する必要があります。
<ol><li>すべての芽を収集、遠心のセルを 400 μ L 器官形成メディア16,17 (表 1) を追加します。パルス渦 3 回とプレート 100 μ L/ウェルの低接着 96 ウェル プレート、1:4 の比率 (図 1G) で芽を分割します。</li>
	<li>視覚化する解離細胞 (図 1H) を自由に浮遊、顕微鏡下でチェックしてください。中速でロッカーに 5% CO2と 37 oC のインキュベーターで培養皿を配置します。</li>
	<li>Pancreatoids の進行状況を毎日監視します。新鮮なメディアすべての 3 日間、慎重にピペッティング井戸の pancreatoid を残しながら削除するフード、顕微鏡の制御の下の 100 μ L に置き換えます。また、メディアの新鮮な 100 μ L に追加できます新しいもと pancreatoid を使用して転送ホウケイ酸のキャピラリー チューブ口のピペットに添付されている 1000 μ L ピペット チップをフィルタ リングします。</li>
</ol>3. 蛍光イメージングのための Pancreatoids の処理
<ol><li>蛍光画像の pancreatoids を処理するには、最初 4% パラホルムアルデヒド/PBS、pH7.4 (PFA) ソリューションを準備します。4 %pfa は 96 の井戸のウェル プレートの 50 μ L を配置します。<ol>
<li>4% 新鮮な井戸の中に可能な限りとしてほとんどのメディアを取って培地から pancreatoids を転送ホウケイ酸キャピラリー チューブと口ピペットを用いた 1,000 μ L フィルター ピペット チップ、PFA。15 分間室温でロッカーに設定します。</li>
		<li>4% から pancreatoids を転送の新鮮な PBS 100 μ L をウェルに PFA が新鮮な PBS 洗浄 3 の合計 5 ~ 10 分繰り返し室温でロックします。 注: プロトコルは、pancreatoids の 1 週間 4 oC で 100 μ L の PBS に格納されているとここでは、休止できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wholemount イメージング (抗体は、セクション 3.3 で適切な代替アプローチが推奨します。 3.4 顕微鏡。)、PBS から 0.1% 非イオン性洗剤 (pbst;) 1x PBS で 50 μ l の 5% ロバ血清にブロック転送。4 oC で一晩岩または室温で 4 時間。<ol>
<li>Pancreatoids を 1 に 5% ロバ血清の 50 μ L で希釈した一次抗体を含む新しい井戸に転送 x PBST。(36 h ですが少なくとも 12 h) 4 oC で 24 時間、最適なロック。 注: Chga (1: 100)、DBA (1: 400)、Vim (1: 400) および Pdx1 に対する材料の表に記載されて抗体 (1: 100); 染め色に適していますその他の抗体は、最適化を必要があります。</li>
		<li>よく洗浄し、室温で 30 分間ロック新鮮な PBST の 100 μ L を含む pancreatoids に転送します。3 新鮮な pbst; 洗浄の合計のためには、この手順を繰り返します。</li>
		<li>Pancreatoids を 1 に 5% ロバ血清の 50 μ L で希釈した二次抗体を含む新しい井戸に転送 x PBST。光から保護して、プレート、4 oC、24 h (36 h ですが少なくとも 12 h) 最適のロッキングの場所します。 注:テーブルの材料および DAPI 核の対比染色に記載されているすべての二次抗体は染め色に適しています。</li>
		<li>PBST と常温 1 で 3 つの洗浄の合計の 30 分の繰り返しのロック × 1 の 100 μ L を含む新しい井戸に pancreatoids を転送 x PBST。3 番目と最後の洗浄に追加 300 nM DAPI。</li>
		<li>最後に、100 μ L の PBS 清潔 4 o染色直後後イメージングから来る最高の結果が、共焦点顕微鏡によるイメージングの前に週までの光から保護 C でストアに配置します。イメージ投射の間 pancreatoids の動きを防ぐが、完全に乾くことを防ぐため、PBS の 20 μ L 液滴に各 pancreatoid を配置します。Pancreatoids がまだ残っていない場合、は、PBS の量を減らします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>凍結切片の PBS から一晩で 4 oc. 30% ショ糖液の pancreatoids を転送する.<ol>
<li>解剖顕微鏡の下にバブルの埋め込みメディアを追加します。顕微鏡制御の下で鉗子を使用して、優しく押すことによって埋め込みメディアを通じて何回か残留ショ糖を埋め込みメディアを凍結組織ブロックを転送する前に削除する pancreatoids を浸します。</li>
		<li>8 μ m でクライオスタットにドライアイス凍結までに組織ブロック、セクションを配置します。 注: セクション格納できます-80 oC または immunostained ですぐに。</li>
		<li>-80 oC 乾燥するまで約 5 分間室温で解凍してからのセクションを許可します。組織周辺ブロック 1 で希釈した 5% ロバ血清を用いた疎水性 pap ペンを使用して疎水性の障壁を描画室温で 30 分間 x PBST。</li>
		<li>メディアを取り出し、1 x pbst; 4 oc. で一晩で希釈 5% ロバ血清で希釈した一次抗体をすぐに交換</li>
		<li>主なソリューションを削除し、3 回 1 組織を洗って 10 分の x PBST。5% ロバ血清 1 の希釈で希釈した二次抗体溶液を追加後、室温で 1 時間 x PBST とスライドを光から保護します。</li>
		<li>セカンダリのソリューションを削除し、1 でスライドを 3 回洗浄 10 分の x PBST。最終的な洗浄に追加 300 nM DAPI。</li>
		<li>メディアを削除し、メディアをマウント、coverslip を追加します。ストアは、イメージする準備ができるまで 4 oC の光からスライドします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 転写解析のための Pancreatoids からの RNA の隔離
<ol><li>Pancreatoids 酸ためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム溶液 1.5 mL チューブの 500 μ L に不稔と場所のフィルター 1,000 μ L ピペット チップと口のピペットに添付ホウケイ酸のキャピラリーを使用してを収集します。-80 oC で保存または RNA の隔離に進んでください。</li>
	<li>RNA の隔離の必要に応じて、氷のサンプルを解凍し、100 μ L のクロロホルムを追加します。4 oc 以上に遠心分離機があらかじめ冷たい渦もと 4 oC で 15 分間の場所<ol>
<li>遠心分離機・ スピン 4 oc 以上で 12,000 g で 20 分間のチューブを置き</li>
		<li>層の分離を邪魔しないようにチューブを慎重に取り外します。200 μ L ピペットを使用して、透明な水溶液を収集し、白質層とピンクの DNA 層からバッファーに少量を残して新しい 1.5 mL チューブに配置。このプロセスで何かをピペットの先端に触れないで、1.5 mL チューブの壁に触れないでください。</li>
		<li>水層と渦を含む新しい管への 100% イソプロピル アルコール液 500 μ L を追加します。20 分、氷の上に長い間または一晩で-20 oC. 最大降水量まま室温で放置します。</li>
		<li>4 oC RNA をペレットにで 15 分間 12,000 g で遠心分離機します。ペレットを乱すことがなく、イソプロパノールを削除します。 注: pancreatoids は小さな、ペレットは表示できない可能性が高いです。</li>
		<li>風邪、75% エタノールを追加し、数回チューブを反転します。遠心分離機で配置し、エタノールと 9,000 の x g で 2 分間スピン 4 oc. 削除で 10 分の 9,000 の x g でスピンします。</li>
		<li>200 μ L ピペットを使用して、ペレットが存在する地域に連絡せずチューブに任意の残りのエタノールを削除します。残留エタノールの蒸発を確保するため室温で 5-10 分間チューブのキャップを開いたまま。</li>
		<li>きれいな、ヌクレアーゼ フリー水の 20 μ L のボルテックスでペレットを再懸濁します。 オプション: 熱 RNA 65 oC 3 分のため、すぐには、氷に戻る。RNA は-80 oC で保存または逆のトランスクリプションと qPCR のすぐに使用できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Akkerman, N., Defize, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dawn+of+the+organoid+era:+3D+tissue+and+organ+cultures+revolutionize+the+study+of+development,+disease,+and+regeneration.">Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration.</a> Bioessays. 39 (4), (2017).</li><li>Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+expressed+by+murine+embryonic+pancreatic+mesenchyme+enhance+generation+of+insulin-producing+cells+from+hESCs.">Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs.</a> Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).</li><li>Landsman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+mesenchyme+regulates+epithelial+organogenesis+throughout+development.">Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).</li><li>Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pancreatic+differentiation+by+signals+from+blood+vessels.">Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels.</a> Science. 294 (5542), 564-567 (2001).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+kidney+organoids+by+differentiation+of+human+pluripotent+cells+to+ureteric+bud+progenitor-like+cells.">The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Loftus, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinar+cell+apoptosis+in+Serpini2-deficient+mice+models+pancreatic+insufficiency.">Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency.</a> PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).</li><li>Kleeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pancreatitis.">Chronic pancreatitis.</a> Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).</li><li>Murtaugh, L. C., Melton, D. 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A., Kumar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+insufficiency+in+type+1+and+type+2+diabetics+of+Indian+origin.">Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin.</a> Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

細胞培養モデルの進行は、適切にモデル開発、臨床的に関連する細胞の種類、試験薬の有効性、または患者にも移植を生成に不可欠です。ただし、我々 は器官形成と生理のメカニズムの理解には程遠い、挑戦は皿に開発を人工的にさた体内。こうして体外細胞が効率的に生成された、完全に機能しない、時間の長い期間のために維持されるまたは匹敵する細胞を体内からその他...

正常な発達の生理機構の輪郭を描くは、疾患の病因を理解し、最終的に治療法を育成に重要です。養殖と幹細胞の差別化により、開発を迅速かつ高スループット分析、細胞の運命を制御するメカニズムに関する知識の既存のボディによって制限されます、人工的に開発を繰り返す、比較的均質な二次元の状態1,2。だけでなく、ニッチおよび環境の異なる細胞型と外因性の影響によって影響を受ける生体の開発は器官形成を導くためパラクリン シグナルと組織的支援を提供して、これらの細胞の機能にも依存、ガイダンス3,4、5の周辺。これらの外部の手がかりの重要性、差別化プロトコルの制限およびマウス モデル生体内での骨の折れる性質を考えると、新しいシステムが実験的基本的な発達過程および生理学を調査するため必要です。
3次元、複雑なオルガノイドを生成するプロトコルの出現も病態. 、薬効、生理器官形成研究に便利と合同システムを提供します。6腸胃7などさまざまなシステムが器官形成の私達の理解を拡大しているためマウス オルガノイドの確立、体内よりも少ない制限で発達の複雑性を研究するためのツールを提供します。生体外モデル。形成とひと多能性の出現により幹細胞、ひと腸8、網膜9, 腎10,11, マウス organoid のこれらの進歩のためと脳12オルガノイドを生産されているとこレパートリーは、開発のメカニズムに関する既存の知識によってのみ制限されます。
特定の関心は膵オルガノイドの世代として病気の無数の膵外分泌不全13、膵炎14、腺房細胞の腺房細胞、ダクトを含む種類の異なる膵細胞を悩ませていると糖尿病15のベータ細胞。これらの異なる細胞型の開発に関する知識を得る彼らの病理を理解することに役立つ可能性が、パーソナライズされた薬剤のスクリーニングまたは移植のためのプラットフォームとして使用できます、また。Greggioらが生体の形態形成を要約し、すべての主要な膵上皮細胞から成る組織、立体的で複雑な構造を開発するマウスの膵オルガノイドを作成する手法を開発する以前は、16,17 を種類します。これは膵の分野で主要な前進、体外特にとして作る細胞はベータ細胞の生物学的調査を有効にできます。ただし、内分泌細胞の不足は、ニッチが対話できるし、指導手掛かり17を提供する組織に、オルガノイドを移植しない限り、このプロトコルで結成。間充織が大きく内分泌はく離と分化3,4を含む後の段階に器官形成の初期段階から開発の上皮を包み込む、ニッチの最も大きい部分を構成します。 18。発展途上膵臓と間充織相互作用はまだ器官形成を研究する外因性シグナリングと体内細胞複雑さを維持することの重要性の別の例です。
ここでは、解離の e10.5 マウス膵前駆細胞からの pancreatoids と呼ばれる三次元の膵オルガノイドを生成する方法について述べる。これらの pancreatoids ネイティブ間充織を保持、自己をフローティング状態で組み立てるし、堅牢な内分泌のベータ細胞19数など、主要な膵細胞型をすべて生成します。この方法は、以前のプロトコルは、堅牢な内分泌分化を欠いているように内分泌の開発の分析に最適です。ただし、膵オルガノイドのプロトコルを使用して Greggioらは膵上皮分岐の形態形成解析に適してのとおり分岐と限定 pancreatoids。

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>BarnStead NanoPure Nuclease-free water</td><td>ThermoFisher</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Capillary Tubes</td><td>Sutter Instruments</td><td>GB1007515</td><td>O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Repellent 96-Well Microplate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>U-bottom</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233306</td><td></td></tr><tr><td>Chromogranin-A antibody</td><td>Abcam</td><td>ab15160</td><td></td></tr><tr><td>Compact, Modular Stereo Microscope M60</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10310</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counter Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>ThermoFisher</td><td>957000L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidine-2&#039;-phenylindole-dihydrochloride)</td><td>Roche</td><td>10 236 276 001</td><td>Powder</td></tr><tr><td>DBA antibody</td><td>Vector Lab</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, Powder</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip</td></tr><tr><td>EGF (Epidermal growth factor)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri Cycle CO2 Incubators</td><td>ThermoFisher</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>OB10001</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>INSM1 Antibody</td><td>Santa Cruz BioTechnology</td><td>sc-271408</td><td>Polyclonal Mouse IgG</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>a4164</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia Isoflurane, USP</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Antibody</td><td>Dako</td><td>A056401</td><td>Polyclonal Guinea Pig</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universal</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>KaryoMax</td><td>10575090</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442615</td><td></td></tr><tr><td>Mouse C-Peptide ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-CPTMS-E01</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-INSMSU-E01</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Microtome Blades</td><td>ThermoFisher</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pdx1 antibody</td><td>DSHB</td><td>F6A11</td><td>Monoclonal Mouse MIgG1</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td><td>VWR</td><td>15160-157</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>1.5mL Capacity</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-10 Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-Acidic</td><td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human R-Spondin I Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>4546-RS</td><td></td></tr><tr><td>BenchRocker 2D</td><td>Benchmark</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose 500g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-401</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604039</td><td>(1x), no Phenol Red</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Invitrogen</td><td>15250061</td><td>For cell counting slides</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Phenol Red</td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment 24-Well Plate</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well</td><td>Corning</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin Antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5733</td><td>Polyclonal Chicken IgY</td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>BioExpres</td><td>S-7350-1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochloride</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1254</td><td>Also known as ROCK inhibitor</td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of scaffold-free, three-dimensional insulin expressing pancreatoids from mouse pancreatic progenitors in vitro

膵臓は、血液グルコースの恒常性と消化を調節する一緒に働く多くの異なったセルタイプから成る複雑な器官です。これらの細胞型には酵素分泌腺房細胞、腸、およびホルモン産生の内分泌細胞に酵素の輸送を担う葉状管システムが含まれます。
内分泌のベータ細胞は、血糖値を下げるインシュリンを作り出すボディの唯一のセル タイプです。糖尿病、損失または β-細胞の障害によって特徴づけられる病気大流行に達しています。したがって、スクリーニング目的のため使用して、薬物および細胞ベースの治療を派生できます β 細胞の開発を調査するためのプロトコルを確立することが不可欠です。マウス開発の実験的調査が不可欠ですが、生体内での研究は手間と時間がかかるです。培養細胞のスクリーニング; もっと便利なプラットフォームを提供します。しかし、彼らは細胞の多様性、建築の組織、および発見した細胞間相互作用を維持することは体内。したがって、膵の形態形成と生理学を調査するための新しいツールの開発が不可欠です。
細胞を整理して複雑な生理学的に有能な大人の臓器に分化膵上皮細胞器官形成の発症から間充織と密接に関連開発します。膵間充織は、多くのよく理解されていません、まだこうして体外培養中に要約することは困難内分泌の開発のための重要な信号を提供します。ここでは、pancreatoids と呼ばれる、間充織を保持文化複雑なマウスの立体化、細胞オルガノイドするプロトコルについて述べる.E10.5 マウス膵芽は解剖、解離、足場のない環境で養殖。浮遊細胞これらは自己開発の pancreatoid と堅牢な内分泌ベータ細胞、腺房と管細胞と一緒に開発数を包み込む間充織と組み合わせてください。このシステムは、器官形成中、や薬物、小さい分子、または遺伝学的スクリーニングの細胞運命決定、構造、形態形成、細胞間の相互作用を研究するために使用できます。

子宮角から e10.5 のマウス胚を細かくは、さらに郭清 (図 1A) の PBS で無傷の胚を得られるはず。消化管は、胚 (図 1B)、腸および胃 (図 1C F) の接続点で背側膵原基の洞察力を許可するから効率的に削除できます。E10.5 膵芽以前特徴付けされています。前駆細胞はPd...

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Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

分離したフローティング e10.5 膵前駆細胞と関連付けられて間充織から 3 D マウス pancreatoids を表現するインスリンを生成するプロトコルを紹介します。

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

generation-scaffold-free-three-dimensional-insulin-expressing

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

9.0K ビュー.  Baylor College of Medicine. 分離したフローティング e10.5 膵前駆細胞と関連付けられて間充織から 3 D マウス pancreatoids を表現するインスリンを生成するプロトコルを紹介します。

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In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

発生生物学

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of pancreatic progenitor cells that can be used for the study of and future treatment of diabetes. This article outlines a four-stage differentiation protocol designed to generate pancreatic progenitor cells from human embryonic stem cells (hESCs). This protocol can be applied to a number of human pluripotent stem cell (hPSC) lines. The approach taken to generate pancreatic progenitor cells is to differentiate hESCs to accurately model key stages of pancreatic development. This begins with the induction of the definitive endoderm, which is achieved by culturing the cells in the presence of Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and CHIR990210. Further differentiation and patterning with Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) and Dorsomorphin generates cells resembling the posterior foregut. The addition of Retinoic Acid, NOGGIN, SANT-1 and FGF10 differentiates posterior foregut cells into cells characteristic of pancreatic endoderm. Finally, the combination of Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamide and NOGGIN leads to the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ cells. Flow cytometry is performed to confirm the expression of specific markers at key stages of pancreatic development. The PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors at the end of stage 4 are capable of generating mature &#946; cells upon transplantation into immunodeficient mice and can be further differentiated to generate insulin-producing cells in vitro. Thus, the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors, as demonstrated in this protocol, is of great importance as it provides a platform to study human pancreatic development in vitro and provides a source of cells with the potential of differentiating to &#946; cells that could eventually be used for the treatment of diabetes.

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Here we describe a 4-stage protocol to differentiate human embryonic stem cells to NKX6-1+ pancreatic progenitors in vitro. This protocol can be applied to a variety of human pluripotent stem cell lines.

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化<sup&gt; +</sup&gt;膵臓前駆細胞

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human developmental processes. Stepwise directed differentiation that recapitulates developmental processes is one of the major ways to generate pancreatic cells including pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) pancreatic progenitor cells. Conventional protocols initiate the differentiation with small colonies shortly after the passage. However, in the state of colonies or aggregates, cells are prone to heterogeneities, which might hamper the differentiation to PDX1+ cells. Here, we present a detailed protocol to differentiate hPSCs into PDX1+ cells. The protocol consists of four steps and initiates the differentiation by seeding dissociated single cells. The induction of SOX17+ definitive endoderm cells was followed by the expression of two primitive gut tube markers, HNF1&#946; and HNF4&#945;, and eventual differentiation into PDX1+ cells. The present protocol provides easy handling and may improve and stabilize the differentiation efficiency of some hPSC lines that were previously found to differentiate inefficiently into endodermal lineages or PDX1+ cells.

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Here, we present a detailed protocol to differentiate human pluripotent stem cells (hPSCs) into pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) cells for the generation of pancreatic lineages based on the non-colony type monolayer growth of dissociated single cells. This method is suitable for producing homogenous hPSC-derived cells, genetic manipulation and screening.

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

糖尿病マウスの精巣上体脂肪細胞における膵島支持骨格移植

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

生物工学

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to diabetes. hPSC-derived insulin-secreting cells can be generated for cell therapy and disease modeling,&#160;however,&#160;with limited efficiency and functional properties. hPSC-derived pancreatic progenitors that are precursors to beta cells and other endocrine cells, when co-express the two transcription factors PDX1 and NKX6.1, specify the progenitors to functional, insulin-secreting beta cells both in vitro and in vivo. hPSC-derived pancreatic progenitors are currently used for cell therapy in type 1 diabetes patients as part of clinical trials. However, current procedures do not generate a high proportion of NKX6.1 and pancreatic progenitors, leading to co-generation of non-functional endocrine cells and few glucose-responsive, insulin-secreting cells. This work thus developed an enhanced protocol for generating hPSC-derived pancreatic progenitors that maximize the co-expression of PDX1 and NKX6.1 in a 2D monolayer. The factors such as cell density, availability of fresh matrix, and dissociation of hPSC-derived endodermal cells are modulated that augmented PDX1 and NKX6.1 levels in the generated pancreatic progenitors and minimized commitment to alternate hepatic lineage. The study highlights that manipulating the cell&#39;s physical environment during in vitro differentiation can impact lineage specification and gene expression. Therefore, the current optimized protocol facilitates the scalable generation of PDX1 and NKX6.1 co-expressing progenitors for cell therapy and disease modeling.

The present protocol describes an enhanced method to increase the co-expression of PDX1 and NKX6.1 transcription factors in pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) in planar monolayers. This is achieved by replenishing the fresh matrix, manipulating cell density, and dissociating the endodermal cells.

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

生物学

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールドフリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

要約

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この動画の章

インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1⁺後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

糖尿病マウスの精巣上体脂肪細胞における膵島支持骨格移植

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

のためのシステム

分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

要約

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インビトロコロニーアッセイでトライ強力な前駆細胞を特徴付けるための大人のマウスの膵臓から分離されました

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

糖尿病マウスの精巣上体脂肪細胞における膵島支持骨格移植

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

のためのシステム

分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールドフリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1⁺後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から