Name: quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in caenorhabditis elegans by nile red and oil red o staining
Uploaded: 2018-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
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이 작품 NIH 교부 금에 의해 가능 하 게 되었다: R01GM109028 (S.P.C.)

1. 나 일 빨강 (NR) 지질의 얼룩
<ol><li>5 mg/mL NR 재고 솔루션의 준비<ol>
<li>500 mL 병에서 NR 분말의 100 mg 100% 아세톤의 200 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>빛을 모든 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일 병을 커버.</li>
		<li>사용 하기 전에 어둠 속에서 2 시간에 대 한 솔루션을 저 어.</li>
		<li>장기 사용에 대 한 어떤 빛 노출 없이 단단히 밀봉된 병에 NR 재고 솔루션을 저장 합니다. 연구의 필요에 따라 NR 재고 솔루션을 확장 합니다. 동일한 재고 솔루션은 일관 된 얼룩 및 이미징 결과 NR 얼룩 실험에서 사용 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 작업 솔루션의 준비<ol>
<li>40% 소 프로 파 놀 (v/v)의 모든 1 ml NR 재고 솔루션의 6 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>각 샘플에 대 한 NR 작업 솔루션의 600 µ L를 준비 합니다. 참고: 신선한 NR 솔루션 오른쪽 얼룩이 지기 전에 작업을 확인 합니다. NR 재고 솔루션 요구에 따라 15 mL 또는 졸업 50 mL 원뿔 튜브를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 지질 얼룩에 대 한 벌레의 준비<ol>
<li>선 충 류 성장 매체 (NGM) 시드 후반 로그 OP50 대장균과 20 ° C에서 초기 L4 단계에 벌레를 성장.</li>
		<li>인산 염 버퍼 식 염 수 + 0.01% 트라이 톤 X-100 (PBST) 솔루션 x 1의 1 mL와 함께 접시에서 벌레를 세척 하 고 웜 현 탁 액 1.5 mL microfuge 관에 넣어.</li>
		<li>560 x g 1 분에 벌레 제거 반복 대장균 까지이 단계를 삭제 하 고 상쾌한 현 탁 액에서 원심 분리기.</li>
		<li>웜 펠 릿을 40% 소 프로 파 놀의 100 µ L을 추가 하 고 3 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.</li>
		<li>560 x g 1 분 동안에 벌레를 원심 고 웜 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다. 참고: 경우 판에서 벌레를 세척 하는 PBST의 높은 볼륨 사용 큰 접시를 사용 하 여 또는 접시 당 더 많은 벌레를 얼룩. PBST에서 보다 더 15 분 샘플 고정 전에 벌레를 씻지 않는. 수행 추가 세척은 상쾌한 박테리아의 지워지지 않습니다. Nutator 또는 로커를 사용 하 여 40% 소 프로 파 놀에 보육을 실시 합니다. 항상 전체 샘플 동요 발생 되도록 튜브 모니터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nr 얼룩 지질<ol>
<li>어둠 속에서, 각 샘플에 NR 작업 솔루션의 600 µ L를 추가 합니다. 반전 튜브 세 번 하 고 NR 솔루션에서 벌레를 완벽 하 게 혼합.</li>
		<li>2 시간에 대 한 실 온에서 어둠 속에서 샘플을 회전 합니다.</li>
		<li>외피, 다음 1 분 동안 560 x g 에서 벌레를 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>PBST의 600 µ L을 추가 하 고 30 분 초과 NR 얼룩 제거에 대 한 어둠 속에서 샘플을 품 어.</li>
		<li>560 x g 1 분에 샘플 원심 고 상쾌한의 약 50 µ L를 제외한 모든 제거 하십시오. 참고: NR 인큐베이션 동요를 필요 하지 않습니다. 벌레의 정착은이 단계 동안 일반적 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>현미경 이미징에 대 한 슬라이드의 준비<ol>
<li>나머지 상쾌한에 웜 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>현미경 슬라이드에 벌레 서 스 펜 션의 5 µ L을 놓고 신중 하 게 트래핑 어떤 공기 방울을 피하기 위해 하는 coverslip 넣어 합니다.</li>
		<li>벌레를 이미징 하기 전에 매니큐어와 coverslip 인감.</li>
		<li>한 번에 단지 몇 가지 슬라이드를 준비 합니다. 이렇게 하면 NR 이미징 일정 하 게 유지 샘플에서. NR 스테인드 이미지의 품질에는 6 헤 이산 지질 방울 관찰 하기 곤란 하다 며 배경 형광, NR 신호 검출을 방해는 감소 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 얼룩진 벌레의 이미징<ol>
<li>보기의 필드 당 여러 동물을 잡으려고 5 배 확대에 벌레 이미지.</li>
		<li>개별 벌레의 더 나은 정량화에 대 한 10 배 확대로 전환.</li>
		<li>FITC/GFP 채널을 사용 하 여 이미지 NR 스테인드 웜 및 정량화에 대 한 최적의 조건을 결정 하기 위해 다른 노출 시간을 시도.</li>
		<li>압축으로 인해 데이터 손실을 방지 하려면 TIF 형식으로 파일을 저장 합니다. 참고: 일반적인 노출 시간 100-1000 양 최적의 노출 시간에 이르기까지, 모든 샘플에 대 한 그것을 사용 하 여 이미징 일관성을 유지 하.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 얼룩 이미지 정량화<ol>
<li>ImageJ를 현미경을 업로드. 플러그인 풀 다운 메뉴에서 이미지 파일 인식 되지 않으면 바이오 형식 함수를 사용 합니다.</li>
		<li>스택 함수에서 이미지 풀 다운 메뉴에서 이미지 스택 사용 하 여 여러 현미경을 비교 하면 이미지 스택을 만듭니다.</li>
		<li>같은 풀 다운 메뉴에서 이미지 스택의 밝기/대비를 조정 하 고 적용을 클릭 하 여 모든 이미지에 변경 내용을 전파 합니다.</li>
		<li>각 이미지 웜 윤곽을 그리 다 하는 NR에서 방출 되는 형광 강도 계량 분석 풀 다운 메뉴에서 측정 함수를 사용 하 여 다각형 선택 도구를 사용 합니다.</li>
		<li>각 이미지에 대 한 5 개의 배경 위치를 측정 하 고 평균 배경 형광 강도 계산 합니다.</li>
		<li>수식 N을 사용 하 여 각 이미지 웜으로부터 배경 형광 강도 빼기 = G-(A x B), N 순 형광, 총 형광에 대 한 G, 총 웜 지역 A와 B 평균 배경 형광에 대 한 의미.</li>
		<li>웜 크기에 의해 형광 강도 정상화 하려면 각 벌레의 전체 면적에 의해 net 형광을 나눕니다. 결과 형광 강도, 픽셀 당 임의의 단위 (거리)으로 보고 됩니다. 참고: JPEG 형식으로 이미지를 수출 하지 마십시오. 압축 파일 저장을 더 관리 하면,이 형식에 의해 데이터 무결성 손상 됩니다. 모든 이미지 수정 및 동일 하 게 분석 다는 것을 확인 하십시오. 제대로 다른 배율에서 크기를 평가 하는 눈금 막대를 포함 하도록 하십시오. ImageJ를 사용 하 여 형광 강도 차이 더 나은 시각화 하려면 8 비트 RGB에서 이미지 형식을 전환 하 고 이미지 룩 업 테이블 (LUT) 메뉴에서 화재를 선택 합니다. 이 증가 색상 밝기 증가 형광 강도 상관 열 맵 이미지를 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 석유 지질 빨간 O 얼룩 (오로)
<ol><li>오로 재고 솔루션의 준비<ol>
<li>250 mL 병에서 100% 소 프로 파 놀의 100 mL를 오로 가루 500 밀리 그램을 추가 하 고 잘 혼합.</li>
		<li>일단 준비, 단단히 빛 노출 없이 밀봉 하는 솔루션을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오로 작업 솔루션의 준비<ol>
<li>60% 소 프로 파 놀에 물 (3:2) 오로 재고 솔루션을 희석.</li>
		<li>사용 하기 전에 작업 오로 솔루션 0.2 µ m 셀 루 로스 아세테이트 멸 균 주사기 필터를 통해 필터링. 참고: 최상의 솔루션 품질을 위해 준비 작업 오로 솔루션 하루 전에, 그리고 섞어 하룻밤 보자. 그러나 솔루션은 필요한 같은 날, 희석과 혼합 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 로커에 오로 솔루션. 락, 전에 오로 솔루션의 누설을 피하기 위해 파라핀 테이프에 원뿔 튜브 포장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>벌레의 오로 지질 얼룩을 위한 준비<ol>
<li>선 충 류 성장 매체 (NGM) 원하는 생활 단계에 늦게 로그 OP50 대장균 으로 시드에 20 ° C에서 벌레를 성장.</li>
		<li>접시에 PBST 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 모든 벌레는 접시에서 때까지 소용돌이. 접시를 기울기와 PBST의 1 mL와 함께 그것을 씻어. 1.5 mL microfuge 관 벌레 중지 전송.</li>
		<li>원심 분리기 560 x g 1 분에 벌레 제거는 상쾌한 펠 릿 및 세척 단계 PBST의 1 mL와 함께 세 번 반복을 방해 하지 않고. 모든 표면에 뜨는 하지만 100 µ L을 제거 합니다.</li>
		<li>웜 펠 릿을 40% 소 프로 파 놀의 600 µ L을 추가 하 고 3 분 동안 실내 온도에 바위.</li>
		<li>G 30 s 및 모든 표면에 뜨는 제거 하지만 100 µ L x 560에서 웜 웜 펠 렛을 방해 하지 않고 원심. 참고: PBST의 높은 볼륨을 사용 하 여 높은 처리량 얼룩 하 고 접시에서 벌레를 씻어. 웜 PBST에 보다 더 많은 샘플 고정 이전 15 분 세척 하지 마십시오. 추가 세척 할 상쾌한 박테리아의 지워지지 않습니다. 40% 소 프로 파 놀 nutator 또는 로커를 사용 하 여 부 화를 실시 합니다. 항상 전체 샘플 동요 발생 되도록 튜브 모니터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오로와 얼룩 지질<ol>
<li>각 샘플에 600 µ L 오로 작업 솔루션을 추가 합니다. 반전 튜브 세 번 하 고 오로에서 벌레를 섞으십시오.</li>
		<li>실 온에서 2 h 30 rpm에서 샘플을 회전 합니다.</li>
		<li>1 분 동안 560 x g 에서 샘플 원심 고 모든 표면에 뜨는 하지만 100 µ L을 제거 합니다.</li>
		<li>PBST의 600 µ L에서 샘플을 resuspend 하 고 30 분 초과 오로 얼룩 제거 30 rpm에서 튜브를 회전.</li>
		<li>샘플 1 분 560 x g 에서 원심 하 고 상쾌한의 50 µ L를 제외한 모든 제거.</li>
		<li>더 나은 동물의 생식과 창 자 세포의 위치를 구별할,의 1 µ L을 추가 하 여 핵을 얼룩 (2-(4-amidinophenyl)-1 시간-indole-6-carboxamidine) (DAPI) 오로 작업 솔루션의 모든 1 ml. 이미징에 대 한 슬라이드를 장착 하기 전에 DAPI를 추가 2 h에 대 한 얼룩 오로 실시 합니다. 장 핵 크기에 더 큰 고 생식 개발 생식 세포에 의해 구별 된다. 참고: 후 오로 얼룩, 웜 수 있습니다 microfuge 관의 양쪽에 준수 고 눈에 띄는 펠 릿을 형성 하기 위하여 실패. 이 경우, 다시 벌레를 원심 하거나 적어도 10 분 동안 중력에 의해 침전 하는 벌레를 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>웜 이미징에 대 한 슬라이드의 준비<ol>
<li>나머지 상쾌한에 벌레를 resuspend 하 고 솔루션을 잘 섞는다.</li>
		<li>현미경 슬라이드에 벌레 서 스 펜 션의 5 µ L를 넣고 공기 폼 거품 확보는 coverslip 신중 하 게, 장소.</li>
		<li>매니큐어와 이미지 웜 coverslip 인감. 참고: 고정 하 고 얼룩, 후 웜 매우 견고 하 고 플라스틱 하기 어려운 수 있습니다. 회피, 그들의 끝을 절단 하 여 넓은 구멍 펫을 확인 합니다.</li>
		<li>안 착 직후 이미징 하는 경우 24 h까지 4 ° C에서 마이크로 원심 분리기 랙에 슬라이드를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오로 얼룩진 벌레의 이미징<ol>
<li>색상 가능 카메라 이미지 오로 얼룩진 벌레를 사용 하 여.</li>
		<li>5 배 확대를 사용 하 여 이미지 보기의 한 필드에 여러 가지 벌레를.</li>
		<li>개별 벌레의 더 나은 시험 10 배 확대로 전환.</li>
		<li>압축으로 인해 데이터 손실을 방지 하려면 TIF 형식에서 이미지를 내보냅니다. 참고: 경우 오로 + DAPI 얼룩, 형광을 캡처할 수 있는 하나에 색상 가능 카메라를 전환.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오로 얼룩진 벌레의 이미지 분석<ol>
<li>ImageJ를 micrograph(s)을 업로드. 플러그인 풀 다운 메뉴에서 이미지 파일 인식 되지 않으면 바이오 형식 함수를 사용 합니다.</li>
		<li>스택 함수에서 이미지 풀 다운 메뉴에서 이미지 스택 사용 하 여 여러 현미경을 비교 하면 이미지 스택을 만듭니다.</li>
		<li>지질 작은 물방울의 가시성을 개선 하기 위해 동일한 풀-다운 메뉴에서 밝기/대비를 조정 합니다.</li>
		<li>특정 조직 또는 동물의 체 내 지질 축적에 따라 이미지를 분류할 수 있습니다.</li>
		<li>지질 지역화의 더 나은 평가 및 일반적인 이미지 유물 ImageJ를 사용 하 여 식별 이미지 풀 다운 메뉴에서 색상 기능을 선택 하 고 표시 각 RGB 구성 요소의 신호를 RGB로 스택 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

비만 및 대사 질환에서 상승 선 충 C. 세포와 조직에 지방 축적 조절 메커니즘 연구에 적합 한 모델을 만든다. 최근의 증거는 지질 수준에 변화는 인슐린 신호8, 호르몬 수용 체2, 생식 출력5의 정품 인증에서에서 배열 하는 세포질 과정에 대 한 상관을 제안 합니다. 레이블 없는 현미경 검사 법 및 크로마토그래피 방법, 나 일 빨강 및 오일...

지질은 생활 필수품입니다. 그들은 세포 막의 필수 구성 요소, 보조 메신저 역할 및 신호 변환기, 그리고 에너지 저장에 중요 한 기능을가지고. 지질 대사 dysregulated 때, 그것은 공중 보건 우려9누르고 비만 타입 II 당뇨병 같은 질병에 이른다. 꼬마 선 충 (C. 선 충)은 상대적으로 짧은 수명 주기, 투명 한 몸, 알려진된 세포 계보와 완전히 시퀀스 된 게놈을가지고 있기 때문에 지질 대사를 공부 하는 우수한 모델 유기 체. 주로 남녀 추 니, C. 선 충 연구자를 인상 isogenic 동물의 많은 짧은 수행할 높은 처리량 앞으로 유전 스크린 다양 한 대사 유전자 및 통로4공부 기간에 있습니다. 이 이렇게 인간, 쥐, 쥐 및 초파리 중 273 선 충 C. 지질 물질 대사 유전자에서 보존의 높은 학위를 공개 했다. 또한, C. 선 충 에서 300 지질 유전자 변화 증후군11에 비관련 질병에 연결 된 인간의 orthologues가 있다. 전통적으로, C. 선 충 에 지질 저장의 검사는 주로 지질 축적에 대 한 강력한 정보를 제공 하는 염료 분류 분석 실험에 의존 했다. 덜 일반적인 조직에 걸쳐 지질 지역화 및 지질 풍부에서 측정 된 차이의 설명 이다. 그러나, 최근 작품은 지질 분포 지질 축적6만큼 중요 있을 수 있습니다 밝혔다.
최근에, 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석 (HPLC-석사), 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS), 같은 통합 연구 시작 하 고 일관 된 안티-스톡 스 라만 산란 (자동차) 현미경 주소로 얼룩-기반 접근 직접 지질 추출, 특정 지질 분수, 및 지질 예금, 각각10,11의 내용을 분석 하 여 단점 또한, 자동차 현미경 나 일 빨강 수 있습니다만 중요 한 얼룩 리드 오프 대상 자동 형광 세포10의 얼룩에 사용을 위해 통 염료로 사용 하는 경우 지방 축적에 대 한 프록시 역할을 계시 했다. 그러나, 필요한 기술적 전문성과 비용 이러한 크로마토그래피와 관련 된 그리고 현미경 검사 법 방법 활용 그들의 많은 연구 질문에 대 한 점. 이 문서에서 우리는 흥분 시키는 중립 지질 예금 C. 선 충 나 일 빨강을 사용 하 여 얼룩 하 고 기름 빨간 O 지질 풍부 전체 동물에서 및 특정 조직에 구별을 편리 하 고 안정적인 방법 토론.
나 일 빨강, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, benzophenoxazone 염료를 쉽게 다양 한 유기 용 매에 녹이 고 주로 물에 용 해 되지 않습니다 이다. 그것은 우수한 lysochrome 염료 사용 트리 글리세라이드 등 중립 지질 얼룩 또는 콜레스테롤 에스테 르는 강한 색상을 보유 하 고 있습니다. 때문에 지질에 잘 solubilizes, 무시할 상호 주위 조직, 않으며 덜에 보다 용 매에 용 해 지질입니다. 그것은 450-500 및 520 nm, 각각1의 여기 및 방출 맥시 마. 개별 지질 시체를 소장 및 다른 조직에 걸쳐 관찰 중 하나에 클러스터 또는 동물의 유전자 형 또는 실험적인 치료에 따라 균등 하 게 분산 수 있습니다 녹색 형광에 대 한 일 레드 스테인드 C. 선 충 을 볼 때 7.
기름 빨간 O lysochrome, 트리 글리세라이드 및 단백질 얼룩을 사용 하는 지 용 성 염료 이다. 그것은 그것의 화학 구조 포함 3 개의 향기로운 반지에 연결 된 두 개의 아조 그룹 때문에 아조 염료 이라고 합니다. 그것은 어느 지질에서 높게 녹는 렌더링 이온화, 어렵다입니다. 얼룩 색은 빨간색 이며 그것의 빛을 흡수 최대 518 nm 3. C. 선 충 기름 빨간 O 쇼 다른 조직6중 지질 분포의 질적 평가 용이 하 게 동물의 투명 한 바디에 눈에 띄는 빨간 지질 방울 스테인드.

<table><tbody><tr><td>Imager.M2m Microscope</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>Fluorescence microscope</td></tr><tr><td>ERC5s camera</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>Color-capable</td></tr><tr><td>MRm camera</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>Fluorescence-capable</td></tr><tr><td>Nile red</td><td>Thermo Fisher</td><td>N1142</td><td>Lipid Stain</td></tr><tr><td>Oil red O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12989</td><td>Lipid Stain</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td>DNA stain</td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>BDH</td><td>BDH1133-1LP</td><td>Fixative solution</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m seterile syringe filter</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>Cellulose acetate filter</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5428000015</td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>Shaker Rotisserie</td><td>Lab Quake</td><td>400110Q</td><td>Shaker</td></tr><tr><td>Tube Rotator</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td>Rotator</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7758-11-4</td><td>NGM</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>NGM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Alfa Aesar</td><td>7786-30-3</td><td>NGM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td>NGM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Teknova</td><td>L9110</td><td>NGM</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3147</td><td>Bacterial growth</td></tr></tbody></table>

quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in caenorhabditis elegans by nile red and oil red o staining

꼬마 선 충 은 지질 대사 및 에너지 항상성 공부 하는 뛰어난 모델 유기 체입니다. 그것의 지질 유전자의 많은 인간에서 보존 하 고 대사 증후군 또는 다른 질병와 관련. 이 유기 체에서 지질 축적의 시험 통 염료 또는 레이블 자유로운 방법에 의해 밖으로 수행할 수 있습니다. 통 얼룩 나 일 빨강 좋아하고 기름 빨간 O 양적 지질 수준을 측정 하 고 질적 관찰 지질 분포, 조직에 걸쳐 각각 저렴 하 고 신뢰할 수 있는 방법이 있습니다. 또한, 이러한 얼룩 다양 한 지질 물질 대사 유전자 및 통로의 높은 처리량 검열을 허용 한다. 또한, 그들의 소수 성 자연 지질 용 해도 용이 하 게, 주변 조직와 상호 작용을 감소 및 용 매로 분리를 방지. 이 메서드는 일반적인 지질 콘텐츠 검사에 효과적, 비록 그들은 화학 성분 및 지질 예금의 다양성에 대 한 자세한 정보를 제공 하지 않습니다. 이러한 목적으로, GC-MS와 자동차 현미경 같은 레이블 없는 메서드는 더 나은 적합, 불구 하 고 그들의 비용.

SKN-1은 bZip, cytoprotective 전사 요소는 포유류 NRF2와 상 동을 공유 하 고 지방산 산화를 중재에 표시 되었습니다. 그들의 식단에 포도 당 농도 따라 웜 constitutively 활성화 skn 1 대립 유전자와 다른 지질 수준 나 일 빨강7물 때를 표시 합니다. 그림 1A -C 표시 활성화 skn-1 동물 지질 수준을 증가 하는 조건에 노출 됩...

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Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

지질 풍부 및 평가의 지질 분포 나 일 빨강, 기름 빨간 O 얼룩으로 꼬마 선 충 의 정량화

나 일 빨강 고정된 꼬마 선 충 의 얼룩 조직 중 지질 분포의 질적 평가 용이 하 게 기름 빨간 O 얼룩 동안 중립 지질 예금, 양적 측정 하기 위한 방법입니다.

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

quantification-lipid-abundance-evaluation-lipid-distribution

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

20.1K 조회수.  University of Southern California. 나 일 빨강 고정된 꼬마 선 충 의 얼룩 조직 중 지질 분포의 질적 평가 용이 하 게 기름 빨간 O 얼룩 동안 중립 지질 예금, 양적 측정 하기 위한 방법입니다.

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A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

형광을 사용하여 조류 세포에서 중성 지질을 측정하기위한 간단하고 빠른 프로토콜

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

연구

화학

3D Fluorescence Lipid Droplet Reconstruction을 통한 간 지방증 평가

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

저자 스포트라이트: 간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석  

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

생화학

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

의 시각화 Caenorhabditis Elegans</emLipophilic 바이탈 염료, DiI를 사용하기> 표피 구조

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

생물학

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

에서 지방 질량의 생화학 및 높은 처리량 미세 평가<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

초파리 유충에 있는 Oenocytes의 해부 그리고 지질 물방울 염색

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This problem is aggravated with increasing density of worms and creates challenges for imaging and quantification. We developed a FIJI-based workflow, Worm-align, that can be used to generate single- or multi-channel montages of user-selected, straightened and aligned worms from raw image data of C. elegans. Worm-align is a simple and user-friendly workflow that does not require prior training of either the user or the analysis algorithm. Montages generated with Worm-align can aid the visual inspection of worms, their classification and representation. In addition, the output of Worm-align can be used for subsequent quantification of fluorescence intensity in single worms, either in FIJI directly, or in other image analysis software platforms. We demonstrate this by importing the Worm-align output into Worm_CP, a pipeline that uses the open-source CellProfiler software. CellProfiler&#8217;s flexibility enables the incorporation of additional modules for high-content screening.&#160;As a practical example, we have used the pipeline on two datasets: the first dataset are images of heat shock reporter worms that express green fluorescent protein (GFP) under the control of the promoter of a heat shock inducible gene hsp-70, and the second dataset are images obtained from fixed worms, stained for fat-stores with a fluorescent dye.

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align/Worm_CP is a simple FIJI/CellProfiler workflow that can be used to straighten and align Caenorhabditis elegans samples and to score whole-worm image-based assays without the need for prior training steps. We have applied Worm-align/Worm_CP to the quantification of&#160;heat-shock induced expression in live animals or lipid droplets&#160;in fixed samples.

벌레 정렬 및 Worm_CP, Caenorhabditis elegans에서 얻은 형광 이미지 데이터의 스트레이트 및 정량화를 위한 두 개의 오픈 소스 파이프라인

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

자극라만 산란 현미경 검사를 사용하여 Caenorhabditis elegans의 지질 저장 역학의 라벨 프리 이미징

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans

Aging is a complex process characterized by progressive physiological changes resulting from both environmental and genetic contributions. Lipids are crucial in constituting structural components of cell membranes, storing energy, and as signaling molecules. Regulation of lipid metabolism and signaling is essential to activate distinct longevity pathways. The roundworm Caenorhabditis elegans is an excellent and powerful organism to dissect the contribution of lipid metabolism and signaling in longevity regulation. Multiple research studies have described how diet supplementation of specific lipid molecules can extend C. elegans lifespan; however, minor differences in the supplementation conditions can cause reproducibility issues among scientists in different labs. Here, two detailed supplementation methods for C. elegans are reported employing lipid supplementation either with bacteria seeded on plates or bacterial suspension in liquid culture. Also provided herein are the details to perform lifespan assays with lifelong lipid supplementation and qRT-PCR analysis using a whole worm lysate or dissected tissues derived from a few worms. Using a combination of longitudinal studies and transcriptional investigations upon lipid supplementation, the feeding assays provide dependable approaches to dissect how lipids influence longevity and healthy aging. This methodology can also be adapted for various nutritional screening approaches to assess changes in a subset of transcripts using either a small number of dissected tissues or a few animals.

Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans

The present protocol describes lipid supplementation methods in liquid and on-plate cultures for Caenorhabditis elegans, coupled with longitudinal studies and gene transcriptional analysis from bulk or a few worms and worm tissues.

Caenorhabditis elegans의 수명 및 유전자 전사 분석을위한 지질 보충

Aging is a complex process characterized by progressive physiological changes resulting from both environmental and genetic contributions. Lipids are ...

지질 풍부 및 평가의 지질 분포 나 일 빨강, 기름 빨간 O 얼룩으로 꼬마 선 충 의 정량화

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간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석

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벌레 정렬 및 Worm_CP, Caenorhabditis elegans에서 얻은 형광 이미지 데이터의 스트레이트 및 정량화를 위한 두 개의 오픈 소스 파이프라인

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