Name: quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in caenorhabditis elegans by nile red and oil red o staining
Uploaded: 2018-03-05T14:00:00.000+00:00
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この作品は NIH グラントによって可能になった: R01GM109028 (S.P.C.)

1. ナイル (NR) 脂質の染色
<ol><li>5 mg/mL NR ストック溶液の調製<ol>
<li>500 mL ペットボトルで 100% アセトン 200 mL に NR 粉末 100 mg を追加します。</li>
		<li>光への露出を避けるためにアルミ箔でボトルをカバーします。</li>
		<li>使用前に暗闇の中で 2 時間のためのソリューションをかき混ぜます。</li>
		<li>長期的な使用、光の露出をせず密閉瓶で NR の原液を格納します。研究のニーズに応じて NR 原液をスケールします。NR 染色実験間で一貫性のある染色とイメージングの結果を取得する使用される同じ在庫ソリューションを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 作業溶液の調製<ol>
<li>すべて 1 mL 40% イソプロパノール (v/v)、NR 原液の 6 μ L を追加します。</li>
		<li>各サンプルの NR 実用的なソリューションの 600 μ L を準備します。 メモ: は、染色する前にソリューション権利を働いて新鮮な NR をください。NR 在庫ソリューションのニーズ、に応じて 15 mL または 50 mL のメスシリンダーの円錐管を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 脂質染色のワームの準備<ol>
<li>線虫の成長媒体 (NGM) 後半ログ OP50エシェリヒア属大腸菌でシードの 20 ° C で L4 早期にワームを成長します。</li>
		<li>X リン酸緩衝生理食塩水 + 0.01% トリトン X-100 (pbst;) 溶液 1 ml の 1 プレートからワームを洗って 1.5 mL および microfuge の管でワームの懸濁液を置きます。</li>
		<li>遠心 560 x gで 1 分間にワームは懸濁液から清と繰り返し大腸菌まで、この手順をオフにするを削除します。</li>
		<li>ワーム ペレットに 40% イソプロピル アルコール液 100 μ L を追加し、3 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>1分間 560 x gでワームを遠心し、ワームのペレットを中断させることがなく、上清を除去します。 メモ: pbst; 場合、皿のワームを洗うのに大量に使用より大きい版を使用して、プレートごとに多くのワームを染色します。サンプル固定する前に 15 分以上の PBST でワームを洗浄しないでください。細菌の培養上清がクリアされない場合は、追加の洗浄を実行します。Nutator やロッカーを使用して 40% イソプロパノールでインキュベーションを行います。完全なサンプルの動揺が発生しているかどうかを確認するチューブを常に監視します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>脂質染色 NR<ol>
<li>暗闇の中 NR 実用的なソリューションの 600 μ L を各サンプルに追加します。3 回チューブを反転し、NR のソリューションでワームを完全にミックスします。</li>
		<li>2 時間室温で暗闇の中サンプルを回転させます。</li>
		<li>次の孵化、1分間 560 x gでワームを遠心し、上清を除去します。</li>
		<li>Pbst; 600 μ L を追加し、余分な NR 染色を削除する 30 分間暗闇の中でサンプルをインキュベートします。</li>
		<li>1分間 560 x gでサンプルを遠心し、上清の約 50 μ L を除くすべてを削除します。 注: NR インキュベーションでは、攪拌は必要ありません。このステップの間にワームのセトリングが一般的です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>顕微鏡のスライドの準備<ol>
<li>残りの上清でワーム ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>顕微鏡のスライドのワーム懸濁液 5 μ L を置き、空気の泡を引っかけないように慎重に観察をつけます。</li>
		<li>ワームをイメージングする前にマニキュアで coverslip をシールします。</li>
		<li>一度にいくつかのスライドのみを準備します。これは NR 画像はサンプル間で一定となります。NR 染色画像の品質低下後 6 h 離散脂肪滴が観察することは困難と背景の蛍光性の増加、NR 信号検出を妨害します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR ステンド ワームのイメージング<ol>
<li>ビューのフィールドごとのいくつかの動物を捕獲する 5 倍の倍率でワームをイメージします。</li>
		<li>個々 のワームよりよい定量化の 10 倍の倍率に切り替えます。</li>
		<li>NR ステンド ワームをイメージして定量化のための最適の条件を決定する異なる露光時間 FITC/GFP チャネルを使用します。</li>
		<li>圧縮データを失うことを避けるために TIF 形式でファイルを保存します。 注: 典型的な露出時間の範囲は 100-1000 さんが最適な露出時間を過ごしてから、イメージの一貫性を維持するすべてのサンプルのためにそれを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR 染色画像の定量化<ol>
<li>ImageJ に顕微鏡写真をアップロードします。プラグインのプルダウン ・ メニューで画像ファイルが認識されない場合バイオ フォーマット関数を使用します。</li>
		<li>スタック関数の下で、画像のプルダウン メニューには、いくつかの顕微鏡写真を比較すると、画像のスタックを作成するのに画像のスタックを使用します。</li>
		<li>同じプルダウン メニューで画像のスタックの明るさ/コントラストを調整し、適用をクリックしてすべての画像への変更を反映します。</li>
		<li>各イメージのワームを描く NR によって放射される蛍光強度を定量化し解析プルダウン メニューの下メジャー関数を使用して、多角形選択ツールを採用してください。</li>
		<li>各イメージの 5 つの背景の場所を測定し、平均バック グラウンド蛍光強度を計算します。</li>
		<li>N 式を使用して各イメージのワームからのバック グラウンド蛍光を引く G = (A B x)、N が純蛍光、総蛍光 G、合計ワーム領域の A と B の平均背景の蛍光性の略します。</li>
		<li>ワームのサイズによって蛍光強度を正規化するには、その総面積による各ワームの純蛍光を分割します。結果は、ピクセルあたり任意の単位 (a.u.) での蛍光強度として報告されます。 メモ: は、JPEG 形式で画像をエクスポートしないでください。圧縮はファイルを格納するより管理しやすい間、この形式でデータの整合性が損なわれます。すべての画像を変更するか、同じ分析とを確認します。異なる倍率でサイズを正しく評価するスケール バーを含めるようにしてください。ImageJ を用いた蛍光強度の違いをよりよく視覚化するには、8 ビット RGB から画像の種類を切り替え、イメージ ルックアップ テーブル (LUT) メニューから火を選択します。これは高められた蛍光強度と相関する輝度色が増加熱マップ イメージを作成します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. オイル赤 O 染色 (オロ) 脂質
<ol><li>オロ ストック溶液の調製<ol>
<li>250 mL のボトルに 100 mL 100% イソプロパノールにオロ パウダー 500 mg を追加、よく混ぜてね。</li>
		<li>準備が整うと、光の露出無しで密閉ソリューションを格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オロ作業溶液の調製<ol>
<li>オロ 60% イソプロパノール (3:2) 水で原液を希釈します。</li>
		<li>使用前に 0.2 μ m 酢酸セルロースの滅菌注射器フィルターを通して作業オロ ソリューションをフィルターします。 注: 最高のソリューションの品質を前日作業オロ ソリューションを準備、一晩を混在させること。ただし、ソリューションが必要な同じ日の場合希釈し、使用前に少なくとも 2 時間ロッカーにオロ ソリューションをミックスします。ロッキング、前にオロ液漏れを避けるためにパラフィン テープで円錐管をラップします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オロ脂質染色のワームの準備<ol>
<li>線虫の成長媒体 (NGM) 後半ログ OP50 E. 大腸菌望ましいライフ ステージとシードに 20 ° C でワームを成長します。</li>
		<li>プレートに PBST 溶液 1 mL を追加し、すべてのワームがプレートをオフになるまで旋回します。プレートを傾けるし、pbst; 1 mL で洗います。ワームの懸濁液を 1.5 mL および microfuge の管に転送します。</li>
		<li>遠心 560 x gで 1 分間にワームは、ペレットと洗浄ステップ pbst; 1 mL で 3 回繰り返しを乱すことがなく上澄みを除去します。すべての培養上清が 100 μ L を削除します。</li>
		<li>ワーム ペレットに 40% イソプロパノールの 600 μ L を追加し、3 分間室温でロックします。</li>
		<li>ワームの餌を中断させることがなく 30 s と削除すべて培養上清中のgが 100 μ L x 560 でワームを遠心します。 注: は、高スループットの染色を行う場合、プレートをワームを洗浄するのに PBST の高いボリュームを使用します。ワーム pbst; サンプル固定する前に 15 分以上は洗浄しないでください。細菌の培養上清がクリアされない場合は、追加の洗浄を行います。Nutator やロッカーを使用して 40% イソプロパノールでインキュベーションを行います。完全なサンプルの動揺が発生しているかどうかを確認するチューブを常に監視します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>脂質染色オロ<ol>
<li>600 μ L オロ作業ソリューションを各サンプルに追加します。3 回チューブを反転し、オロにもワームをミックスします。</li>
		<li>室温で 2 時間 30 rpm でサンプルを回転させます。</li>
		<li>1分間 560 x gでサンプルを遠心し、すべて上澄みが 100 μ L を排除します。</li>
		<li>Pbst; 600 μ L のサンプルを再懸濁します、余分なオロ染色を削除する 30 分間 30 rpm でチューブを回転させます。</li>
		<li>560 × gで 1 分でサンプルを遠心し、上清を 50 μ l 添加以外のすべてを排除します。</li>
		<li>動物の生殖細胞や消化管細胞の場所を区別しやすく、1 μ L を追加することによって核を染色 (2-(4-amidinophenyl)-1 H-インドール-6-carboxamidine) (DAPI) オロ実用的なソリューションのすべて 1 ml。オロ染色 DAPI をイメージング用のスライドをマウントする前に追加すると 2 h を行います。腸の核は、サイズが大きいと、生殖腺は発展途上の生殖細胞によって区別されます。 注: オロ染色後、ワームがおよび microfuge の管の側面に付着、失敗は顕著なペレットを形成します。この場合、もう一度ワームを遠心分離機または少なくとも 10 分のために重力によって解決するワームを許可します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>イメージングのワームのためのスライドの準備<ol>
<li>残りの上清でワームを再懸濁します、ソリューションをよく混ぜます。</li>
		<li>顕微鏡のスライドのワーム懸濁液 5 μ L を入れて、気泡ではフォームないの確保、慎重に観察を配置します。</li>
		<li>マニキュアとイメージ ワーム coverslip をシールします。 注: 固定と染色の後ワームでき非常に堅いピペットにくい。これを回避するには、先端を切り落とすことによりワイドボア ピペットを確認します。</li>
		<li>染色後すぐにではなく、イメージング スライド 24 h まで 4 ° C でマイクロ遠心分離機ラックに格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オロ ステンド ワームのイメージング<ol>
<li>画像オロ ステンド ワームにカラー対応のカメラを使用します。</li>
		<li>5 倍の倍率を使用して、1 つのビューのフィールドのいくつかのワームをイメージします。</li>
		<li>個々 のワームのより良い検査のため 10 倍の倍率に切り替えます。</li>
		<li>圧縮によるデータの損失を避けるために TIF 形式の画像をエクスポートします。 注: オロ + DAPI 染色する場合は、蛍光を捉えることができますいずれかにカラー対応のカメラを切り替えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オロ ステンド ワームの画像解析<ol>
<li>ImageJ micrograph(s) にアップロードします。プラグインのプルダウン ・ メニューで画像ファイルが認識されない場合バイオ フォーマット関数を使用します。</li>
		<li>スタック関数の下で、画像のプルダウン メニューには、いくつかの顕微鏡写真を比較すると、画像のスタックを作成するのに画像のスタックを使用します。</li>
		<li>脂質小滴の可視性を改善するために同じプルダウン メニューの下の明るさ/コントラストを調整します。</li>
		<li>動物の体全体または特定の組織での脂質蓄積によると画像を分類します。</li>
		<li>脂質の局在化のより良い評価と ImageJ を用いた非固有のイメージ アイテムの識別のため、画像のプルダウン メニューの下色関数を選択し、RGB 各成分の信号を RGB にスタックをクリックします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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著者は利益相反を宣言しません。

肥満および代謝性疾患の率の上昇は、細胞や組織の脂肪蓄積を調節する機構を研究対象に適したモデルを線虫になります。最近の証拠は、脂質レベルの変化がインスリン シグナル8、ホルモン受容体2、生殖出力5への活性化に至る細胞プロセスに関連付けられることを示唆しています。ラベル無料顕微鏡とクロマト グラフ法、ナイ?...

脂質は、生命に不可欠です。膜の不可欠なコンポーネント、二次メッセンジャーとして機能し信号のトランスデューサー、エネルギー貯蔵に重要な機能を持っています。脂質代謝が調節不全、肥満、II 型糖尿病、公衆衛生の懸念9を押しているような病気に します。線虫(線虫) 比較的短いライフ サイクル、透明体、知られている細胞系統、完全に配列されたゲノムをもっているために、脂質の代謝を研究するためのエクセレント モデル生物であります。両性具有者に主にc. の elegansは、要するに持ち帰り高スループット転送遺伝子スクリーニング遺伝子経路の代謝4の広い配列を勉強する時間の期間の同質の動物の数が多いを高めるために研究者をことができます。このアプローチは、273線虫脂質代謝遺伝子ヒト、マウス、ラット、ショウジョウバエにおける保全の高度を明らかにしました。さらに、線虫の以上 300 の脂質遺伝子人間第オーソロガス メタボリック シンドローム11に関係のない病気に関連付けられているがあります。伝統的に、線虫脂質ストレージの検討が主染料ラベルのアッセイは、脂質蓄積に関する信頼性の高い情報を提供にしていました。あまり一般的は、組織全体で脂質がローカライズして豊富な脂質の測定の違いの説明です。しかし、最近の作品では脂質分布を脂質蓄積6と同じくらい重要にすることができることを明らかにしました。
最近は、高性能液体クロマトグラフィー質量分析 (高速液体クロマトグラフィー-MS)、ガスクロマトグラフィー質量分析法 (GC/MS) などの方法を統合する研究を始めているし、コヒーレント反ストークス アドレスにラマン散乱 (CARS) 顕微鏡、脂質抽出物、特定の脂質画分および脂質堆積物、それぞれ10,11の内容を直接分析することによって汚れ・ ベース ・ アプローチの欠点。さらに、CARS 顕微鏡ではナイルの赤は、脂肪蓄積オフのターゲット自動蛍光細胞小器官10の染色につながる重要な汚れとの使用のため定着性色素として使用する場合のプロキシとして使用できますを明らかにしました。ただし、これらのクロマトグラフィーに関連する必要な技術的な専門知識とコスト、顕微鏡検査方法の使用多くの研究質問理不尽。この記事ではこだわると線虫ナイルの赤を使用して中性脂質沈着汚れし、オイル赤 O の脂質豊富な全動物と特定の組織を区別するために便利で信頼性の高い方法をについて説明します。
ナイルの赤、9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one、benzophenoxazone 染料容易に様々 な有機溶剤に溶解するが、主水に溶解されていません。それは優秀な lysochrome 色素中性脂質トリグリセリドなどを染色するために使用またはコレステロール エステルそれは強い色を特徴とするので可溶性脂質で、周囲の組織とのごくわずかな相互作用よりも溶剤に難溶です。脂質。450-500 と 520 の nm、それぞれ1の励起・発光極大値があります。離散脂質体の腸や他の組織の中でいずれかのクラスターを観察または動物の遺伝子型または実験的な治療によって、均等に分散できる蛍光グリーンのナイルの赤はc. の elegansをステンド グラスを見ると、7。
オイル赤 O、lysochrome、トリグリセリド、リポタンパク質を染色に使用される脂溶性の色素です。アゾ染料は、その化学構造に 3 つの芳香環に接続されている 2 つのアゾ基が含まれているために呼び出されます。それは、イオン化することは困難非常に脂質に溶けるがレンダリングをします。その汚れの色は赤く、その光吸収最大は 518 nm 3。線虫は、オイル赤い O ショー異なったティッシュ6脂質分布の定性的な評価を容易に動物の透明体に対して際立つ赤脂質液滴と汚れます。

<table><tbody><tr><td>Imager.M2m Microscope</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>Fluorescence microscope</td></tr><tr><td>ERC5s camera</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>Color-capable</td></tr><tr><td>MRm camera</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>Fluorescence-capable</td></tr><tr><td>Nile red</td><td>Thermo Fisher</td><td>N1142</td><td>Lipid Stain</td></tr><tr><td>Oil red O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12989</td><td>Lipid Stain</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td>DNA stain</td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>BDH</td><td>BDH1133-1LP</td><td>Fixative solution</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m seterile syringe filter</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>Cellulose acetate filter</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5428000015</td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>Shaker Rotisserie</td><td>Lab Quake</td><td>400110Q</td><td>Shaker</td></tr><tr><td>Tube Rotator</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td>Rotator</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7758-11-4</td><td>NGM</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>NGM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Alfa Aesar</td><td>7786-30-3</td><td>NGM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td>NGM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Teknova</td><td>L9110</td><td>NGM</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3147</td><td>Bacterial growth</td></tr></tbody></table>

quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in caenorhabditis elegans by nile red and oil red o staining

線虫脂質代謝・ エネルギー代謝を研究するための特別なモデル生物であります。その脂質の遺伝子の多くは人間には維持され、メタボリック シンドロームまたはその他の疾患に関連付けられています。この生物における脂質蓄積の検討は定着性染料またはラベル自由な方法で実施できます。定着性の汚れはナイル川のように赤いとオイル赤 O の脂質レベルを定量的に測定し、質的、組織間でそれぞれ脂質分布を観察する安価な信頼性の高い方法があります。さらに、これらの汚れ各種の脂質代謝遺伝子および細道の高速スクリーニングを可能にします。また、疎水性性質は、脂溶性を容易に、周囲の組織との相互作用を減らす溶媒に解離を防ぐことができます。これらのメソッドは一般的な脂質含量を調べることで効果的なしかし、化学組成と脂質堆積物の多様性の詳細については行いません。これらの目的は、GC-MS と車の顕微鏡などラベル自由な方法がより適していますな、コストにかかわらず。

SKN 1 は bZip 胃酸転写因子 NRF2 の哺乳類と相同を共有して脂肪酸酸化を仲介することが示されています。彼らの食事療法のグルコース濃度に応じて恒常活性skn 1の対立遺伝子を持つワームはナイルの赤7と異なる脂質レベルを表示します。図 1A-C活性skn 1動物脂質レベルを上げることにつながる条件にさら?...

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Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

脂質豊かさとナイルの赤とオイル赤 O 染色により線虫の脂質分布評価の定量化

ナイルの赤固定線虫の染色は、組織中の脂質分布の定性的な評価を容易にオイル赤 O 染色中性脂質堆積物の定量的測定法です。

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

20.1K ビュー.  University of Southern California. ナイルの赤固定線虫の染色は、組織中の脂質分布の定性的な評価を容易にオイル赤 O 染色中性脂質堆積物の定量的測定法です。

ビデオ: Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単​​かつ迅速なプロトコル

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

化学

3D蛍光脂質液滴再構成による肝脂肪症の評価

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

著者スポットライト:肝脂肪症評価のための3D再構成による蛍光染色脂質液滴の分析  

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

肝脂肪症評価のための3D再構成による蛍光染色された脂肪滴の分析

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

生化学

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

の可視化線虫（Caenorhabditis elegans）</em親油性生体染色色素、DIIを使用する>キューティクルの構造

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

生物学

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

ショウジョウバエ幼虫における大鼻細胞の解剖と脂質液滴染色

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This problem is aggravated with increasing density of worms and creates challenges for imaging and quantification. We developed a FIJI-based workflow, Worm-align, that can be used to generate single- or multi-channel montages of user-selected, straightened and aligned worms from raw image data of C. elegans. Worm-align is a simple and user-friendly workflow that does not require prior training of either the user or the analysis algorithm. Montages generated with Worm-align can aid the visual inspection of worms, their classification and representation. In addition, the output of Worm-align can be used for subsequent quantification of fluorescence intensity in single worms, either in FIJI directly, or in other image analysis software platforms. We demonstrate this by importing the Worm-align output into Worm_CP, a pipeline that uses the open-source CellProfiler software. CellProfiler&#8217;s flexibility enables the incorporation of additional modules for high-content screening.&#160;As a practical example, we have used the pipeline on two datasets: the first dataset are images of heat shock reporter worms that express green fluorescent protein (GFP) under the control of the promoter of a heat shock inducible gene hsp-70, and the second dataset are images obtained from fixed worms, stained for fat-stores with a fluorescent dye.

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align/Worm_CP is a simple FIJI/CellProfiler workflow that can be used to straighten and align Caenorhabditis elegans samples and to score whole-worm image-based assays without the need for prior training steps. We have applied Worm-align/Worm_CP to the quantification of&#160;heat-shock induced expression in live animals or lipid droplets&#160;in fixed samples.

ワームアライメントとWorm_CP、カエノハブディティス・エレガンスから得られた蛍光画像データの矯正と定量化のための2つのオープンソースパイプライン

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

刺激されたラマン散乱顕微鏡を用いた カエノラム型エレガンス における脂質蓄積ダイナミクスの無標識イメージング

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans

Aging is a complex process characterized by progressive physiological changes resulting from both environmental and genetic contributions. Lipids are crucial in constituting structural components of cell membranes, storing energy, and as signaling molecules. Regulation of lipid metabolism and signaling is essential to activate distinct longevity pathways. The roundworm Caenorhabditis elegans is an excellent and powerful organism to dissect the contribution of lipid metabolism and signaling in longevity regulation. Multiple research studies have described how diet supplementation of specific lipid molecules can extend C. elegans lifespan; however, minor differences in the supplementation conditions can cause reproducibility issues among scientists in different labs. Here, two detailed supplementation methods for C. elegans are reported employing lipid supplementation either with bacteria seeded on plates or bacterial suspension in liquid culture. Also provided herein are the details to perform lifespan assays with lifelong lipid supplementation and qRT-PCR analysis using a whole worm lysate or dissected tissues derived from a few worms. Using a combination of longitudinal studies and transcriptional investigations upon lipid supplementation, the feeding assays provide dependable approaches to dissect how lipids influence longevity and healthy aging. This methodology can also be adapted for various nutritional screening approaches to assess changes in a subset of transcripts using either a small number of dissected tissues or a few animals.

Lipid Supplementation for Longevity and Gene Transcriptional Analysis in Caenorhabditis elegans

The present protocol describes lipid supplementation methods in liquid and on-plate cultures for Caenorhabditis elegans, coupled with longitudinal studies and gene transcriptional analysis from bulk or a few worms and worm tissues.

カエノラブディティス・エレガンスにおける長寿と遺伝子転写解析のための脂質補給

Aging is a complex process characterized by progressive physiological changes resulting from both environmental and genetic contributions. Lipids are ...

脂質豊かさとナイルの赤とオイル赤 O 染色により線虫の脂質分布評価の定量化

要約

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蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単かつ迅速なプロトコル

肝脂肪症評価のための3D再構成による蛍光染色された脂肪滴の分析

肝脂肪症評価のための3D再構成による蛍光染色された脂肪滴の分析

肝脂肪症評価のための3D再構成による蛍光染色された脂肪滴の分析

の可視化線虫（Caenorhabditis elegans）キューティクルの構造

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価

ショウジョウバエ幼虫における大鼻細胞の解剖と脂質液滴染色

ワームアライメントとWorm_CP、カエノハブディティス・エレガンスから得られた蛍光画像データの矯正と定量化のための2つのオープンソースパイプライン

刺激されたラマン散乱顕微鏡を用いたカエノラム型エレガンスにおける脂質蓄積ダイナミクスの無標識イメージング

カエノラブディティス・エレガンスにおける長寿と遺伝子転写解析のための脂質補給

脂質豊かさとナイルの赤とオイル赤 O 染色により線虫の脂質分布評価の定量化

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肝脂肪症評価のための3D再構成による蛍光染色された脂肪滴の分析

肝脂肪症評価のための3D再構成による蛍光染色された脂肪滴の分析

肝脂肪症評価のための3D再構成による蛍光染色された脂肪滴の分析

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内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価

ショウジョウバエ幼虫における大鼻細胞の解剖と脂質液滴染色

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刺激されたラマン散乱顕微鏡を用いた カエノラム型エレガンス における脂質蓄積ダイナミクスの無標識イメージング

カエノラブディティス・エレガンスにおける長寿と遺伝子転写解析のための脂質補給

蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単かつ迅速なプロトコル

刺激されたラマン散乱顕微鏡を用いたカエノラム型エレガンスにおける脂質蓄積ダイナミクスの無標識イメージング