자극된 라만 산란 현미경 검사는 지질의 신속하고 정량적 검출을 가능하게 하고 라벨이 없는 방식으로 살아있는 동물에서 지질을 추적할 수 있는 화학 영상 기술입니다. 전통적인 지질 검출 기술에 대한 SRS 현미경 검사법의 가장 중요한 장점은 라벨이 없고 따라서 다른 형광 및 염색 문제로 표백하는 것이 지속 가능하지 않다는 것입니다. 모델 유기체에 사용할 수 있는 유전 및 생화학 적 도구와 함께 SRS 현미경 검사법의 사용, 특히 Caenorhabditis elegans지질 생물학 및 신진 대사의 정상적인 레귤러를 공부하기위한 강력한 프레임 워크를 제공합니다.
SRS 현미경에 레이저 빔을 공급하려면 먼저 잠망경을 설정하여 피코초 광원 출구에서 현미경 스캐너의 적외선 레이저 입력 포트로 빔을 들어 올리고 레이저 제어 소프트웨어를 열어 레이저를 시작합니다. 펌프 레이저 전력을 50밀리와트로 낮추고 펌프 신호를 750나노미터로 설정합니다. 빔 익스팬더를 사용하여 빔 직경을 조정하여 현미경 목표의 후면 조리개에 맞춥시게 합니다.
두 개의 릴레이 거울, M1 및 M2를 사용하여 레이저 빔을 잠망경으로 안내하고 튜닝 범위의 중앙에 잠망경의 고개를 끄덕입니다. 레이저 빔이 대략 미러의 중앙에 닿는 것을 각 미러의 초기 위치와 각도를 선택하여 현미경으로 빔을 발사하고 현미경의 객관적인 포탑에 빈 포트를 사용하여 코스 정렬을 수행합니다. 파워 미터 프로브를 목표 포트에 배치하여 전송된 빛의 힘을 측정하고 현미경스캐너를 가장 높은 줌 인 50X로 설정합니다.
중점 레이저 빔 스폿으로 송신된 빛의 힘을 측정하고 가장 높은 투과 레이저 전력을 달성하기 위해 미러 M1 및 M2의 노브를 반복적으로 최적화합니다. 정렬 도구를 사용하여 전달된 빛의 미세 정렬을 수행하여 빛이 목표의 중심을 통과하고 형광 목표 정렬 캡을 빈 목표 시트에 배치합니다. 첫 번째 스티어링 미러M1의 노브를 조정하여 레이저 빔 스팟을 중앙에 놓고 다른 쪽 끝에 정렬 캡이 있는 익스텐션 튜브를 레이저 빔 스팟을 모니터링하기 위한 빈 목표 시트에 도입합니다.
그런 다음, 두 번째 스티어링 미러M2의 노브를 조정하여 확장 튜브의 다른 쪽 끝에 레이저 빔 스팟을 다시 중앙으로 조정합니다. SRS 검출 모듈을 설정하려면 응축기 후 빔 스플리터 큐브를 배치하여 전송된 레이저를 사진 다이오드 모듈로 유도합니다. 전자 장치 연결을 설정하려면 피코초 튜닝 가능 레이저 내부의 20메가헤르츠에 내장된 전자 광학 변조기를 사용하여 스토크스 빔의 강도를 조절하고 사진 다이오드의 출력 신호를 잠금 증폭기로 공급하여 자극된 라만 손실의 강등을 유도합니다.
그런 다음, 마이크로코프의 아날로그 상자에 잠금 증폭기 출력을 공급하여 전기 아날로그 신호를 디지털 신호로 변환한다. 이미징 조건을 최적화하려면 5개의 올레산 마이크로리터를 미니 현미경 슬라이드 챔버에 추가하고 커버 슬립으로 샘플을 덮습니다. 샘플을 현미경 단계에 배치하고 패드가장자리를 사용하여 물방울을 찾고 집중합니다.
Kohler 조명에 대한 응축기를 조정하고 적외선 센서 카드와 적외선 뷰어를 사용하여 펌프 빔 경로가 여전히 올바른지 확인합니다. 지연 단계가 펨토초제로 설정되어 있는지 확인하고 펌프 빔 파장을 795.8나노미터로 설정합니다. 펌프 빔의 전력을 50밀리와트로 설정하고 스토크 빔을 100밀리와트로 설정합니다.
레이저의 메인 셔터뿐만 아니라 빔 모두에 대한 셔터를 엽니 다. 샘플을 스캔하고 컴퓨터 화면에서 이미지를 확인합니다. 디스플레이 모드를 높은 낮은 수준으로 변경하고 범위를 조정하여 약 50%의 채도를 확인합니다.
포화도가 이미지에 중심이 되는지 확인하여, 펌프와 스토크스의 최적화된 오버랩을 위해 피코초 조정 가능 레이저 시스템 내부의 스티어링 미러를 신중하게 조정하여 이미지 강도를 극대화하고 필요에 따라 피크 강도를 중심으로 합니다. 각 이미징 세션 전에 100 마이크로리터의 따뜻한 2%아가로즈를 두 층의 실험실 테이프가 있는 지지 슬라이드 사이에 배치한 깨끗한 유리 슬라이드에 추가하고 첫 번째 슬라이드 위에 두 번째 슬라이드를 빠르게 놓습니다. 얇게, 심지어 아가로즈 패드를 만들고 아가로즈가 식힐 수 있도록 부드럽게 누르십시오.
이미징을 위해 벌레를 장착하려면 10~20개의 벌레당 마취제 의 4~5방울을 커버 슬립에 놓고 해부 현미경을 사용하여 이미지를 지정하여 벌레를 마취액에 배치합니다. 모든 웜이 수집되면 아가로즈 패드로 유리 슬라이드로 웜을 덮습니다. 이미징의 경우, 가려움서 를 사용하여 벌레 샘플을 대적 렌즈를 향하고 밝은 필드 광원을 접안으로 향하여 웜을 찾습니다.
웜을 초점으로 가져오고 그에 따라 응축기 위치를 조정합니다. 펌프 레이저 전력을 200밀리와트로 설정하고 IR 전력을 400밀리와트로 설정하여 레이저 파워를 조정합니다. 웜 SRS 신호의 강등용 잠금 증폭기를 설정합니다.
빠른 스캔 속도로 첫 번째 웜을 스캔하여 관심 영역을 찾기 위해 미세 한 초점을 조정하십시오. 신호가 최적화되면 느린 스캔 속도와 더 높은 픽셀 해상도로 전환하여 SRS 이미지를 얻고 이미지를 고해상도로 저장하는 형식으로 저장합니다. 모든 샘플이 이미지화되면 레이저 소스를 대기 중으로 배치하고 관련된 모든 장비를 끕니다.
이미지를 분석하려면 ImageJ에서 파일을 열고 분석할 속성을 선택하기 위해 분석 및 설정을 선택합니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 웜 장의 영역을 윤곽을 잡아 정량화하고 분석 및 측정을 다시 클릭합니다. 측정값이 결과 창에 나타납니다.
모든 웜이 설명되면 지정된 유전자형의 각 웜에 대한 측정값을 스프레드시트에 복사하여 붙여넣습니다. 배경 측정 값의 경우, SRS 신호가 없는 웜 부근의 영역을 선택하고 각 개별 웜에 대한 측정에서 배경 평균 회색 값을 빼서 주어진 유전자형 또는 테스트 그룹의 모든 웜에서 평균 회색 값을 빼낸 배경의 평균 및 표준 편차를 계산합니다. 그런 다음 이러한 값을 대조군의 평균으로 정규화할 수 있습니다.
이러한 대표적인 분석에서, 인슐린 수용체가 결여된 연령 동기화 된 야생 형 웜 및 daf-2 돌연변이체의 장 지질 수준은 성인기 동안 정량화되었다. 예상대로, 지질 수준에 있는 쇠퇴는 야생 모형 벌레에서 관찰됩니다, 첫날에서 시작하여 성인의 9 일까지 계속. daf-2 돌연변이의 지질 수준은 5 일 까지 증가하며, 이 시점에서 야생 유형보다 약 2.5 ~ 3 배 높게 일정하게 유지됩니다.
Daf-16 비활성화는 daf-2 돌연변이체의 지질 수준의 증가를 억제합니다. daf-16a 또는 daf-16b 이소폼의 발현은 daf-2, daf-16 이중 돌연변이체는 지질 수준을 복원하지 않는다. 그러나 daf-16d/f/h 등소형태의 발현은 daf-2, daf-16 이중 돌연변이체에서 다프-2 단일 돌연변이체에서 관찰되는 수준으로 지질 수준을 복원하기에 충분하다.
이러한 결과는 daf-16d/f/h 이소형이 daf-2 돌연변이 벌레의 지질 대사를 특별히 조절한다는 것을 나타냅니다. 이미징 세션 전반에 걸쳐 펌프 및 Stokes 빔에 동일한 레이저 전력을 사용하고 6및 4개의 일관된 정량화마다 제어 그룹을 포함하는 것이 중요합니다. 지질 저장을 정량화하는 것 외에도, SRS 현미경 검사는 중수소와 같은 생물orthogonal 태그와 결합될 수 있고, 지질 통합, 합성 및 분해의 역학을 시각화하기 위하여 구현될 수 있습니다.
SRS 현미경 검사는 멀티플렉싱을 허용하고 다른 세포 외 구획에서 여러 생체 분자를 이미지하도록 구현될 수 있습니다. 소위 하이퍼 스펙트럼 SRS 현미경 검사는 신진 대사 역학을 탐구에 있는 중대한 미래를 가지고 있습니다.
