Name: a microfluidic platform for longitudinal imaging in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

이 연구는 보조금 PHY-1205494를 통해 국립 과학 재단 및 MCB 1413134 (엘)와 연구 재단 국립 부여 2017R1D1A1B03035671에 의해 지원 되었다 (KSL).

프로토콜 아래 WormSpa5, 벌레의 경도 이미징에 대 한 이전 설명 미세 장치를 사용합니다. WormSpa (CAD 파일 요청 시 저자에 게 서 얻을 수 있는 시작)의 제조는 간단 하지만 일부 전문성을 요구 한다. 대부분의 경우, 제작 쉽게 수행할 수 있습니다 핵심 시설에 의해 또는 그러한 서비스를 제공 하는 상업 회사에 의해. 장치를 조작 하는 경우 기능 높이 50 µ m 지정 있는지 확인 하십시오.
1. 실험 설치
<ol><li>전동된 스테이지는 거꾸로 형광 현미경에 미세 장치를 탑재 합니다.</li>
	<li>현미경, 가까운 궤도 통을 배치 하지만 뿌리에서 진동 직접 영향을 주지 않습니다 현미경. 예를 들어, 광학 테이블와 접촉 하 게 벽에 고정 하는 선반에 뿌리를 넣어.</li>
	<li>궤도 통에 주사기 펌프를 배치 합니다. 테이프는 통에 펌프 흔들어 동안 흔들림 하지 않습니다 있도록.</li>
</ol>2입니다. 미세 환경 준비
참고: 동안 실험, 4 개의 주사기 연결 되어있습니다 주사기 튜브를 통해 미세 장치에 그림 1에 설명 된 대로. 이 단계에서는 이러한 주사기의 준비를 설명합니다. 달리 언급 하지 않는 한 그들을 긴장 늦추지 않고 주사기 튜브를 가능한 한 짧게 유지.
<ol><li>콘센트 주사기와 주사기 튜브를 준비 합니다. 이 주사기 ( 그림 1에서 S1) 것입니다 나중 주사기 튜브를 통해 장치를 콘센트에 연결 하 고 장치에서 나오는 액체의 임시 저장을 위해 사용.<ol>
<li>어댑터 바늘만 바늘 (금속 부분)을 유지 하는 20 G x 1/2 인치 주사기 팁의 플라스틱 부분을 제거 하 여 확인 합니다. 펜 치와 플라스틱 및 금속 부품을 보유 하 고 그들을 떨어져 당기 여 그렇게. 바늘에 남은 플라스틱 찌 꺼 분 젠 버너 점화 수 있습니다.</li>
		<li>실험적인 체제의 형상에 따라 바늘 펜 치와 그것의 2 개의 끝을 잡고 구부려. 여기서 설명 하는 디자인에 ~ 110 °의 각도를 구 부리는 그것의 중간에 바늘이 가장 편리 합니다.</li>
		<li>튜브 어댑터 바늘 절반 방법을 연결 합니다. 나머지 절반은 나중에 장치에 연결 합니다. 주사기 튜브 누출 (0.86 m m 내경 및 외경 1.32 m m의 튜브 등) 없이 20 G 주사기 팁과 호환 되어야 한다. 권장된 튜브 길이 50 cm입니다.</li>
		<li>20 G x 1/2 인치 주사기 팁을 통해 주사기 튜브의 다른 (오픈) 끝에 10 mL luer 잠금 주사기를 연결 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>버퍼 입구 주사기를 준비 하 고 튜브 주사기. 이러한 주사기 중 하나 ( 그림 1에서 S2) 액을 사출 흐름을 제어 하 고 장치에 대 한 저수지로 사용 됩니다. 다른 주사기 ( 그림 1에 S3)는 버퍼 교환에 필요한 단계 3.2에 설명 된 대로.<ol>
<li>3-방향 밸브를 직접 10 mL 주사기 luer 잠금 (S2)를 연결 하 고 주사기 튜브 (그림 1)을 통해 같은 밸브에 연결할 다른 주사기 (S3): S3 주사기 팁을 통해 튜브를 연결 하 고 다른 주사기 팁을 통해 밸브에 튜브를 연결. 참고: 이러한 자료 연결 된 순서 대로 중요 하지 않습니다.</li>
		<li>3-방향 밸브의 나머지 포트에 주사기 튜브를 연결 합니다. 준비 단계 2.1.2, 에서처럼 다른 어댑터 바늘을 바늘 도중 주사기 튜브의 다른 (오픈) 끝.</li>
		<li>S3 닫혀 있는 동안 단계 2.2.2에 S2 주사기 튜브 연결 되도록 밸브를 설정 (그림 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>웜-입구 주사기와 주사기 튜브를 준비 합니다. 이 주사기 ( 그림 1에서 S4) 장치에 벌레를 로드 사용 됩니다.<ol>
<li>10 mL 주사기 luer 잠금 (S4)를 긴 주사기 튜브를 연결 합니다. 로드; 하는 데 사용 하는 액체의 볼륨에서이 관의 길이 결정 예를 들어 100 cm 튜브의 액체의 2 개 mL 이상 지원 (또한, 단계 4.2 참조).</li>
		<li>2.1.2, 단계 에서처럼 또 다른 어댑터 바늘을 준비 하 고 하나의 플러그 주사기 튜브의 다른 (오픈) 끝에 바늘의 절반.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 주사기와 튜브 S 매체12 두 번 씻어. S-매체, 모든 기포를 제거 하도록 주사기와 튜브를 작성.</li>
	<li>장치 콘센트에 콘센트 주사기 튜브를 연결 합니다.<ol>
<li>출구 포트를 주사기 튜브의 끝에 어댑터 바늘에 연결 합니다.</li>
		<li>작은 S-중간 버퍼 입구와 웜 유입 때까지 장치를 채우기 위해 콘센트를 통해 S 매체의 작은 볼륨을 주입.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(1/32 인치 직경 스테인리스 못 핀) 핀 벌레 입구를 연결 하는 동안 버퍼 입구 주사기 튜브 장치, 버퍼 입구 포트에 연결 합니다.</li>
	<li>장치에 버퍼의 지속적인 흐름을 주사. 주사기 펌프13에 버퍼 입구 주사기 S2를 로드 하 고 s 2에서 매체에 지속적으로 장치 3 µ L/분의 유량에 주입 되도록 펌프를 설정.</li>
</ol>3. 미세 장치에 박테리아 로드
<ol><li>대장균 OP50 S-중간12에 준비 합니다.<ol>
<li>표준 프로토콜에 따라 파운드와 단일 식민지의 50 mL와 250 mL 플라스 크를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 품 어</li>
		<li>야간 문화 4000 rpm에서 10 분간 원심 하 고 S 매체의 30 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>5 µ m 주사기 필터를 통해 정지를 필터링 합니다. 600의 광학 밀도 의해 세균성 농도 측정 nm (OD600), 3의 세600 농도 조정 하 고. 이 높은 밀도 잘 먹이 벌레를 유지 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OP50 서 스 펜 션 장치에 버퍼를 교환 합니다.<ol>
<li>OP50 서 스 펜 션으로 가득 (S5) 깨끗 한 주사기를 준비 합니다. 주사기를 수직으로 잡고 하 고 상단에 모든 공기 방울 수집 여러 번을 누릅니다.</li>
		<li>장치에 연결을 닫습니다 버퍼 입구 주사기의 3 방향 밸브를 설정 하 고 두 개의 주사기, S2 및 S3 연결. 주사기 펌프에서 S2를 분리 합니다.</li>
		<li>밸브에서 s 2를 분리 하 고 S5 밸브에 연결. S5의 상단에 s 3 밸브를 통해 때까지 수집 S3 들어가는 약간 OP50 버퍼의 모든 공기를 밖으로 밀어. 이렇게, 아니 공기 방울이 S5 또는 밸브에 남아 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>3-방향 밸브 S3와 S5 사이의 연결을 장치에 연결 하는 S5 원래 위치로 다시 설정. 주사기 펌프에 S5를 로드 합니다. 펌프를 보유 궤도 셰이 커를 켭니다. 약 200 rpm 진동 속도 설정 합니다.</li>
		<li>수 100 µ L/min 흐름 속도 설정 합니다. 새로운 버퍼 장치에서 벌레에 도착 하는 데 걸리는 시간 버퍼 입구 주사기 튜브 (위에서 설명한 튜브와 함께 약 5 분)의 길이에 따라 달라 집니다. 높은 흐름 속도 빠른 버퍼 exchange는 필요한 경우 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>OP50 버퍼 장치를 통해 확산, 일단 3 µ L/분에 다시 흐름 속도 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 미세 장치에 웜 로드
<ol><li>작은 낮은 바인딩 microcentrifuge 튜브 (650 µ L)를 준비 하 고 100 µ L OP50 서 스 펜 션의 그것을 채우십시오. 주위 전송 20-30 나이 동기화 젊은 성인 벌레 (46 시간 25 ° C에서 L1 애벌레 체포를 게시) NGM (선 충 류 성장 매체) 한 천 배지에서 튜브를 그들에 게 벌레와 함께 하나 하나를 선택 하 여 선택. 12표준 프로토콜 따라 나이 동기화를 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>웜-입구를 채우기 주사기와 주사기 튜브 ( 그림 1에서 S4) OP50 서 스 펜 션. 벌레와 함께 microcentrifuge 관에 액체의 ~ 500 µ L를 삽입할. 웜-입구 주사기 튜브에 벌레와 함께 정지를 그립니다. 주사기 튜브는 충분히 있는지 확인 하십시오 (> 1 m) 그린된 웜 주사기 튜브에 하 고 하지 않는 게 줄곧 주사기 S4.</li>
	<li>웜-인렛에 s 4를 연결 합니다. 미세 장치에 웜 유입 주사기 튜브에서 모든 벌레를 주사. S4 및 주사기 튜브를 분리 합니다. 연결 핀 웜 입구.</li>
	<li>기계식 펌프 ( 그림 1)에서 버퍼 입구 주사기 S2를 분리 하십시오 하 고 수동으로 제어 s 1과 s 2를 별도 채널에 모든 벌레를 밀어. S 2를 누르면 이동 합니다 벌레는 채널에 동안 s 1을 누르면 반대 방향에서 그들을 이동 합니다. 채널 로드 되 면 각 채널에 벌레 다른 벌레의 항목을 차단 합니다.</li>
	<li>웜 2-3 시간 동안 새로운 환경에 적응 하자.</li>
</ol>5. 영상 프로토콜 설정
<ol><li>안전 하 게 장치에 있는 모든 벌레를 찾아서 당신의 현미경을 제어 하는 이미지 수집 소프트웨어에 그들의 각각에 대 한 이미지 위치를 설정. 어떤 경우에 유의 (예: 높은 확대를 원하는 또는 작은 CCD 센서와 카메라를 사용 하는 경우) 여러 영상 위치는 각 채널에 대 한 필요. 참고:이 수동으로 할 수 있습니다, 하는 동안 일부 수집 소프트웨어 패키지 이미지 취해야 한다 위치를 나열 하는 텍스트 파일을 로드할 수 있습니다. 주문 때문에이 위치는 정기적으로 WormSpa에, 사용자는 이러한 목록을 자동으로 생성 하는 작은 스크립트를 (예를 들어, Python 또는 상용 소프트웨어)를 작성할 수 있습니다. 이 스크립트의 정확한 형식 것 수집 소프트웨어 ( 보충 자료 1에서 예를 참조)에 의해 필요한 파일 형식에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>시간 경과 화상의 필요한 주파수를 설정 합니다. 예를 들어 감염에 면역 유전자 응답의 영상 프레임 당 10 분의 주파수에서 이루어집니다. 모든 시간 지점에서 모든 필요한 채널 (예: 밝은 분야 및 GFP 형광)을 인수 하는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
</ol>6. 호스트 응답 모나 스 감염으로
참고:이 단계는 호스트 병원 체 상호 작용을 공부에 대 한 특정. 또는, 하나 (biotic 및 abiotic 스트레스, 약물, 신호 분자, 등등)의 다른 환경 단서를 포함 하는 버퍼를 준비할 수 있습니다.
<ol><li>녹 농 균 PA14 SK-중간14에서 일시 중지를 준비 합니다.<ol>
<li>파운드와 단일 식민지의 50 mL와 250 mL 플라스 크를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 품 어</li>
		<li>파운드의 50 mL 및 문화의 약 수와 함께 또 다른 250 mL 플라스 크를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 품 어</li>
		<li>야간 문화 4000 rpm에서 10 분간 원심 하 고 SK-매체의 10 mL에 펠 릿을 resuspend. 세균 농도 측정 하 고 OD600 농도 조정 = 4.</li>
		<li>깨끗 한 플라스 크에 정지를 전송 하 고 24 시간 동안 37 ° C에서와 동요 하는 동안 24 시간 동안 25 ° c를 품 어. 이 단계는 표준 분석 결과14를 죽이고 접시 인큐베이션 단계를 모방 합니다.</li>
		<li>5 µ m 주사기 필터를 통해 정지를 필터링 합니다. 이것은 장치를 막힘에서 세균성 집계를 방지 하기 위해입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PA14 서 스 펜 션, 3.2 단계와 같은 절차에 따라 OP50 서 스 펜 션 장치에서를 교체 합니다. 10 시간 동안 이미지 유지입니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

미세 도구 공부 벌레에 여러 혜택을 제공 합니다. PDMS에 이미징 장치 표준 NGM 천 판에 비해 더 높은 영상 품질을 제공 합니다. 대조적으로 전통적인 방법 동물 접시에서 고른 및 이미징 위한 현미경 슬라이드에 장착 된 단일 벌레에서 여러 개의 이미지를 취할 수 있습니다. 또한, 웜 거주 하는 microenvironment 상수 또는 원하는 정확한 환경 구성 및 동물의 응답 사이의 매핑 허용으로 변조 된 보관할 수 ...

환경에서 변화 유도 및 특정 유전자1,2의 식의 억제를 동반 하는 유전 프로그램의 활성화로 이어질 수 있습니다. 이러한 운동 변화 조직 같은 동물 및 다른 동물 사이 중 변수를 있을 수 있습니다. 같은 유전 프로그램의 연구는 따라서 개별 동물의 경도 이미징 허용 및 환경 조건의 정확한 동적 제어를 제공 하는 방법에 대 한 호출 합니다.
최근 몇 년 동안, ﹙ 유체 장치 응답 및 작은 동물, 벌레, 파리, 물 곰 그리고 더 많은3,,45,6,를 포함 하 여 행동의 여러 측면을 연구 하는 데 사용 되었습니다. 7. 응용 프로그램 포함, 예를 들어 깊은 형질, optogenetic 화학 자극에 응답에 신경 활동의 기록 하 고 운동 등 펌핑8,,910 모터 동작 추적 , 11.
미세-기반 접근 개최 지역 microenvironment의 유지 보수를 허용 하는 유연한 디자인의 정확한 동적 제어를 포함 한 환경 신호에 응답의 장기 경도 이미징 혜택을 수 있는 많은 속성 별도 숙소, 및 이미징에 대 한 유리한 속성에 개별 동물. 그러나, 그들의 잘 존재에 불리 한 영향을 최소한의 오랜 시간에 대 한 미세 챔버에 동물을 유지 하는 것은 실험의 실행에서 뿐만 아니라 미세 소자의 디자인에 특별 한 주의 요구 하는 도전입니다.
여기 WormSpa, 꼬마 선 충의 경도 이미징 미세 장치를 사용 하 여를 설명합니다. 5 개별 웜 챔버에 국한 됩니다. 액체와 세균 현 탁 액의 지속적인 낮은 흐름 벌레가 잘 먹이 충분히 좋은 건강을 유지 하 고 스트레스를 완화 하는 활성는 챔버의 구조로 벌레 알을 낳 기를 보장 합니다. 디자인의 단순 하 고 WormSpa의 그들의 자신의 연구 계획에이 장치를 통합 하는 마이크로에 이전 경험을 가진 연구원을 허용 해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>WormSpa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab.</td></tr><tr><td>Compound Microscope</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver Z1</td><td>An inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-501</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>SCI Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/5</td><td>0.034&amp;rdquo; (0.86 mm) I.D. x 0.052&amp;rdquo; (1.32 mm) O.D</td></tr><tr><td>Syringe Tip</td><td>CMLsupply</td><td>901-20-050</td><td>20 Gauge x 1/2&amp;rdquo; blunt tip stainless steel canula</td></tr><tr><td>Syringe Filter</td><td>PALL</td><td>4650</td><td>Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Qosina</td><td>C3307</td><td>10 mL Male Luer Lock Syringe</td></tr><tr><td>3 Way Valve</td><td>ColeParmer</td><td>FF-30600-23</td><td>Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile</td></tr><tr><td>Dowel Pin</td><td>McMaster-Carr</td><td>90145A317</td><td>18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32&quot; Dia. x 1/2&quot; Lg.)</td></tr><tr><td>Low Binding Microcentrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>CL S3206</td><td>0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube</td></tr></tbody></table>

a microfluidic platform for longitudinal imaging in caenorhabditis elegans

지난 10 년간에서 미세 꼬마 선 충, 선 충 류 등 작은 동물을 연구에 적용 된 기술과의 정밀 하 게 제어 기능을 제공 하는 편리한 라이브 이미징 플랫폼으로 유용한 증명 실시간으로 실험 조건입니다. 이 문서에서는 개별 웜 WormSpa, 이전에 게시 사용자 지정 미세 장치 채용의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다. 기능을 설명 하기 위해 수행 하는 병원 성 박테리아, 장치에 웜 감염 했다 그리고 면역 반응 유전자와 달걀 누워의 표현의 역학 개인에서 지속적으로 감시 되었다 증거의 원리 실험 동물입니다. 단순한 설계와 동작이 미세 기반 실험 이전 경험을 가진 사용자에 게 적합 합니다. 우리는이 이렇게 잘 정의 된 조건 하에서 생물 학적 과정의 종 적 관찰에 관심이 많은 연구원을 위한 도움이 될 것입니다 제안 합니다.

(46 시간 게시물 25 ° C에서 L1 애벌레로)12 프로토콜에 설명 된 대로 장치에 로드 된 젊은 성인 벌레를 나이 동기화. 벌레는 개별적으로 병원 체에 동물의 응답의 경도 측정을 사용 하면 별도 채널에 위치 했다. 실험 성공 하면 대부분 웜 실험의 기간에 대 한 그들의 채널에 남아 있습니다. 이 경우 개별 벌레의 이미지는 단순히 동물을 적극적으로 찾이 필요?...

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A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

이 문서에서는 사용자 지정 미세 장치를 채용 하는 개별 벌레의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다.

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

a-microfluidic-platform-for-longitudinal-imaging-caenorhabditis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

6.4K 조회수.  Kongju National University. 이 문서에서는 사용자 지정 미세 장치를 채용 하는 개별 벌레의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다.

비디오: A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

연구

생체공학

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt; &#39;로코

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

발생학

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

신경과학

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

생물학

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

Longitudinal Fluorescence Monitoring and Averseive Interventions를 위한 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans 의 장기 배양

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

요약

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에 대한 간단한 마이크로 유체 장치

의 주문형 정량 분석을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers

이미징 C. 엘레간스 태아

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

Longitudinal Fluorescence Monitoring and Averseive Interventions를 위한 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans 의 장기 배양

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

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이미징 C. 엘레간스 태아

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

Longitudinal Fluorescence Monitoring and Averseive Interventions를 위한 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans 의 장기 배양

의 주문형 정량 분석을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis