우리는 마누엘 짐머 남성;와 사용을 위해 적응 시켰다 초기 디자인 파일 제공 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 합성 및 ascr #3;의 공급에 대 한 프랭크 슈뢰더 로스 Lagoy 통찰력 및 영상 및 분석; 그리고 크리스토퍼 낙하산, 함께 마스터 제작 및,로 라 Aurilio이이 원고 검토에 기여. 이 작품에 대 한 자금 국립 보건원 그랜트 1R01DC016058-01 (제), 국립 과학 재단 부여 CBET 1605679 (D.R.A.), 및 버로우즈 Wellcome 경력 수상 과학 인터페이스 (D.R.A.)에서 제공 했다.

1. 장치 제조 참고: 참조 참조 1.
 참고: 실리콘 마스터 금형 실리콘 마스터 1 , 7 수 8 포토 레지스트 패터 닝에 대 한 표준 photolithographic 기법을 사용 하 여 날조 했다. 웨이퍼 패턴에 대 한 포토 25000 dpi에서 인쇄 되었다. 남성 적응 장치 기능 Chronis 후 각 칩 디자인 변화는 웜 포트 로드, M. 짐머 (개인 통신, 2016)에서 얻은 디자인을 적응에 19. 차례 동물의 회전을 제어 하는 포함 되어 있습니다. 포트 채널을 로드 하는 벌레의 폭은 50 μ m로 좁혀 졌다. 모든 채널은 32 μ m 높이 이다. 실리콘 마스터 몰드는 사용자에 게 제공 되 면 사용자는 후속 따를 수 프로토콜, 앞에서 설명한 1.
<ol><li>무게에 의해 10:1 비율로 믹스 PDMS 기본 및 경화 에이전트.</li>
	<li>전송 펫으로 철저 하 게 혼합.</li>
	<li>모든 보이는 거품 제거 될 때까지 1 시간에 대 한 진공 desiccator에 섞어 드.</li>
	<li>두께 5 mm (100 g) 때까지 150 m m 직경 접시에 실리콘 몰드 마스터에 혼합물을 부 어. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 모든 거품 또는 혼합물에 도입 된 먼지 제거.</li>
	<li>적어도 3 h, 또는 하룻밤 65 ° C에서 구워.</li>
	<li>메스를 사용 하 여 금형에서 PDMS를 잘라내어 별도 장치를 떨어져 면도날을 사용 하 여 잘라.</li>
	<li>1mm 피부 펀치와 인 레트와 출구 구멍을 펀치.</li>
	<li>플러시 dH 구멍 2 O, 에탄올, 그리고 다시 dH 2 O는 펀치에서 입자를 제거 하. 에 어 스트림 펄스에서 장치 건조.</li>
	<li>채널 측 및 어떤 먼지 또는 성공적인 접합 수 있도록 장치에 남아 있는 파편 제거 접착 테이프로 장치의 위쪽 청소.</li>
	<li>플라즈마-본드 장치, 제 1 덮개 유리, 채널 사이드.
	<ol><li>노출 커버 유리 및 장치 (채널-쪽) 공기 플라즈마 100 W 30 같은 적절 한 결합을 허용 하는 조건을 사용 하 여 s 또는 24 W 60에 대 한 s. 
		참고: 설정은 결합 효율을 향상 시키기 위해 조정할 수 있습니다. 플라즈마-결합 조건이 결합 효율을 개선 하려고 할 때 적절 한 청소 만큼 중요있지 않습니다. 이상적인 플라즈마 조건 에서도 충분 청소 장치 채권 하지 것입니다.</li>
		<li>5 손가락으로 아래로 장치 및 보도 채널 쪽으로 커버 유리를 반전 미</li>
	</ol></li></ol> 2. 준비를 버퍼 <ol><li>Dilute 1 살 균 10 배 재고에서 S 기초 (100 m m NaCl 및 0.05 M KPO 4, pH 6.0) x.</li>
	<li>모든 버퍼 솔루션에 대 한 1 M 1 m m S 기초 x 1에서의 최종 농도 tetramisole 재고 희석.</li>
	<li>Fluorescein 둘 다 추가 &#34; 흐름 제어 &#34;와 &#34; 버퍼 &#34; 저수지.
	<ol><li>S 기초 x 1에 100 mg/mL 재고 fluorescein 만들기.</li>
		<li>흐름 제어에 1 µ g/mL 및 버퍼에서 0.1 µ g/mL의 최종 농도에 재고 희석.</li>
	</ol></li> <li>자극을 만듭니다.
	<ol><li>1 M S 기초 X 1에서의 최종 농도에 희석 글리세롤.</li>
		<li>S 기초 X 1으로 1 µ M의 최종 농도를 희석 ascaroside #3 (ascr #3).</li>
	</ol></li></ol> 3. 장치 설치 참고: 1 참조.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig1.jpg" /> 그림 1. 미세 장치 설치. (A) 저수지 및 튜브 30 mL 주사기 플런저 역할 수 없이 &#34; 저수지. &#34;이 세 가지 흐름 옵션 Luer 밸브에 연결. 다른 미세 장치에 연결 하는 튜브에 삽입 된 바늘 (오렌지)에 연결 하는 동안 1 개의 출구 3 mL 주사기 플런저와 연결 된다. (B) 전체 이미징 실험 미세의 설정. 소자 대물 렌즈 위에 거꾸로 epifluorescence 현미경의 단계에 배치 됩니다. &#34; 흐름 제어 &#34; 버퍼 설정 위의 선반에 장치에 의해 제어 되는 3 방향 밸브를 통해 여행. 라인 버퍼를 포함 하는 다음 적절 한 장치 포트에 삽입 됩니다. (C) 미세 소자의 포트. &#34; 흐름 제어 &#34; 포트 측면 다른 입구 포트:는 &#34; 자극 &#34; 및 &#34; 버퍼 &#34; 포트. &#34; 콘센트 &#34;는 가장 오른쪽 포트. 웜 로드 경기장의 위치는 &#34; 웜 로드 &#34; 포트는 장치에서 중앙 대부분 포트입니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol><li>준비 3 3 mL 주사기 및 바늘 ( 그림 1A)에서 뿐만 아니라 루어 밸브에 연결 된 3 방향 Luer 밸브, 30 또는 60 mL 주사기를 연결 하 여 유체 저수지. 미세 장치 확장 튜브에 바늘을 연결 ( 그림 1A에서 -B).</li>
	<li>저수지와 배관에서 공기 방울을 제거.</li>
	<li>S 기초 x 1과 연결 된 튜빙 3 mL 주사기를 콘센트에 삽입 포트</li>
	<li>버퍼 입구 구멍의 상단에 표시 될 때까지 부드럽게 주사기에 압력을 적용.</li>
	<li>적절 한 입구 구멍에 흐름 제어, 버퍼 및 자극 튜브를 연결 ( 그림 1B에서 -C), 액체 방울 로드 포트에 있는 지를 확인 구멍과 첨부 버퍼 튜브.</li>
	<li>방울 벌레 로드 포트 입구에에서 나타날 때까지 출구 포트에 연결 된 주사기를 다시 부드럽게 압력을 적용.</li>
	<li>포트 로드 벌레에 단단한 차단 핀을 삽입</li>
	<li>출구 포트에서 주사기를 제거 하 고 집 진공 (-670 Torr)에 연결 하는 콘센트 라인 연결.</li>
	<li>검사 흐름에 어떤 거품에 대 한 장치 채널, 시각 및 카메라와 호환 하는 소프트웨어를 통해 비디오 확인을 통해 사용, 오픈-소스 소프트웨어 마이크로 유 등. 마이크로-Manager를 사용 하 여에 대 한 도움말 6 단계를 참조 하십시오.
	<ol><li>어떤 거품이 있으면 기다리는 그들을 꺼내 려 하는 PDMS에 흡수 될 어떤 동물을 로드 하기 전에 벽, 거품의 존재는 장치를 통해 체액의 적절 한 흐름을 방해 합니다.</li>
	</ol></li> <li>장치 내에서 적절 한 흐름 역학 확인 GFP 필터를 사용 하 여 웜 3-방향 밸브를 움직이는 버퍼의 관찰을 로드 하기 전에.
	<ol><li>결정 적절 한 흐름 역학: 흐름 제어 및 버퍼 솔루션에 fluorescein 관찰 ( 그림 2D -2E) 컨트롤을 눌러 흐름 제어 값이 변경 될 때 변경 3-방향 밸브 밸브 링크 ( 그림 1B)에 해당 하는 버튼.</li>
		<li>마이크로 관리자를 연 후에 클릭 &#34; 라이브 &#34; 소자의 라이브 이미지를 관찰 하는 것. 장치에서 버퍼의 흐름을 관찰 하는 형광 광원 설정 ( 그림 2D -2E).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig2.jpg" /> 그림 2: 한 남자 적응 미세 후 각 칩 했다. 장치는 벌레는 노출 될 경우의 (A) 흐름 패턴 버퍼를. 버퍼 (B)는 브라운에 나와 고 흐름 제어 (FC) 흰색에서 노란색, 자극 (S)에 표시 됩니다. 포트 로드 웜 웜 오리엔테이션의 더 나은 제어 곡선을 포함 적응 되었습니다. (B) 흐름 벌레 자극에 노출 되 면 소자의 패턴. 버퍼 (B)는 브라운에 나와 고 흐름 제어 (FC) 흰색에서 노란색, 자극 (S)에 표시 됩니다. (C) 조작으로 적응된 장치의 측량. 포트 로드 웜 남성 폭을 위한 50 µ m 채널 여 42 µ m에 끝납니다. 채널의 측정된 높이 디자인 25 µ m의 목표에도 불구 하 고 32 µ m입니다. (D-E) A 갇혀 남성 표현 p sra-6:: GCaMP3. Sra 6 발기인 재 관련, 그리고 비록 아무 칼슘 과도 ASI에 관찰 했다 일부 식 ASI 신경에서 관찰 될 수 있습니다. 반면 (E) 형광 이미지 (D) 밝은 분야 및 형광 조명의 조합입니다. 스케일 바는 강력한 신경 활동 42 µ m. (F)는 재 신경 응답을 1 M 글리세롤 자극을 나타냅니다. 파란색 영역 1 M 글리세롤 자극의 시간을 나타냅니다. 음영 처리 된 영역 나타냅니다 표준 오차, n = 7 벌레에서 20 펄스. 붉은 흔적이 depolarizing 응답을 나타냅니다. y 축의 δ/F 0을 표시합니다. 눈금 막대를 5 나타냅니다 s. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
 4. 동물 준비 참고: 참조 참조 23.
<ol><li>이미징 재 응답 1 M 글리세롤.
	P sra-6에 대 한 긍정적인 <li>장소 약 20 C. 선 충 <ol>남성:: 선 충 류 성장 매체 (NGM) 한 접시에 GCaMP3 배열 식 OP50 대장균의 잔디와 시드. 형광 GECI의 표현 및 공동 주입 마커를 사용 하 여 배열-긍정적인 동물의 식별에 대 한. 
		참고: 배열 긍정적인 동물 사용 GECI에 따르면 형광 것입니다 (즉, 동물을 표현 하는 GCaMP 것입니다 형광 블루 빛 자극, 아래 녹색 RCaMP 동물 그린 빛 자극 아래에 빨간색 형광 것입니다 하는 동안). 공동 주입 마커 phenotypic 마커, rol-6, 같은 다른 형광 단백질, GFP와 RFP, 등에서 배열할 수 있다 또는 pha-1 돌연변이 28 같은 지배적인 표현 형을 구출 하실 수 있습니다.
		<li>따기 직전 분석 결과, 젊은 성인 남성을 선택 하는 경우 <ol>. 만약 전날 분석 결과, L4 애벌레 남성 선택.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>이미징 CEM 응답 1 µ M ascr #3.
	<ol><li>선택 약 20 L4 C. 선 충 수 컷 (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1 (e2123ts); 그-5 (e1490); 라이트-1 (ce314)) 그는 dsRed 공동 주입 식 표식에 대 한 긍정적. 
		참고: 남자 이야기의 광선 신경 내 dsRed 식을 관찰 하 고 4 개의 CEM 뉴런 내에서 GCaMP 식 보다 확인 쉽습니다.</li>
		<li>이미징 실험을 수행 하기 전에 5-14 h OP50 대장균의 잔디와 시드 NGM agar 접시에 광고에 나온 것에서이 남성 분리. 
		참고: 남성 5 h의 최소 절연 하지 행동 ascr # 3에 응답 하지 않는 및 따라서 여기 관찰 보다는 ascaroside에도 적은 칼슘 과도 전시 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 5. 동물 로드 참고: refefence 1.
<ol><li>표준 웜 유지 관리 기술을 사용 하 여 한 unseeded NGM 천 배지 위에 한 웜 선택.
	<li>선택 <ol>벌레는 (병합 된 백 금 철사로 만든), 선택, 선택에 박테리아를 따기 불타는 여 고 &#34; dabbing &#34; 그것을 데리 러 벌레. 부드럽게 장소 자체에서 크롤링할 수 있도록 하는 새로운 접시에 웜.</li>
	</ol></li> <li>접시가 홍수 같은 unseeded 접시에 S 기초 x 1의 약 5 mL을 추가.</li>
	<li>S 기초 x 1 미리 채워진 된 로드 주사기 (즉, 연결 된 튜빙 3 mL 주사기)에 벌레를 그립니다.
	<ol><li>웜 튜브로 서만, 아니라 모든 방법으로 주사기를 빨 아 해야. 
		참고: 경우 벌레 주사기에 여행, 그것은 가까이 튜브에 그것을 다시 얻을 불가능.</li>
	</ol></li> <li>콘센트 Luer 밸브 선회 하 여 흐름을 중지 하려면 진공 해제.</li>
	<li>포트 로드 웜 차단 고체 핀 제거</li>
	<li>설정 Luer 밸브 배기는 출구 포트 ( 그림 1B)에 연결. 
	참고: 사용 하 여 라이브 비디오 피드는 벌레를 로드 하는 동안 위치와 동물 (단계 5.8-5.13)의 방향을 확인.</li>
	<li>삽입 튜브 웜 포트 로드에 로드 하는 웜</li>
	<li>웜 로드 채널에 나타날 때까지 부드럽게 주사기에 압력을 적용.</li>
	<li>벌레 꼬리 1 채널 입력을 시작, 경우 입력 채널에서 벌레를 방지 하기 위해 주사기 플런저 당겨.</li>
	<li>적용 하 고 머리 먼저 채널 입력 될 때까지 압력을 반전 전환.</li>
	<li>3 방향 Luer 밸브 선회 하 여 진공 분위기 대신 진공 하 여 출구 포트에 연결 하는 오픈.</li>
	<li>수동으로 머리 자유롭게 이동할 수 우울을 동양 벌레 머리 버퍼 흐름 채널, 하지만 지금까지 노출 되는 주사기 플런저에 의해 압력을 적용 ( 그림 2 D-2E).</li>
</ol> 6. 자극 및 수집 <ol><li>마이크로 매니저 등 10 프레임/s 블루 빛 여기를 사용 하 여 TIFF 스택으로 이미지를 캡처하여 기록 소프트웨어를 오픈-소스 현미경을 사용 하 여, (470 nm) 30 미</li>
	<li><ol><li>오픈 100 양 메인 메뉴에서 노출 설정 &#34; 멀티 D Acq. &#34; 소프트웨어의 메인 메뉴에서. 설정는 &#34; 번호 &#34;를 &#34; 300, &#34; 및 &#34; 간격 &#34;을 &#34; 0. &#34; 클릭 &#34; 취득! &#34; 비디오를 얻으려고.</li>
	</ol></li> <li>적용 수집을 시작한 후 자극 5 s의 10 s 펄스. 원하는 대로 응용 프로그램 자극의 기간 조정.
	<ol><li>5 인수 후 s 비디오의 변경 제어 흐름 제어 버퍼 테스트 중인 동물을 자극을 적용 하는 3 방향 밸브. 밸브 연결 ( 그림 1B)에 가장 왼쪽 단추를 클릭 하십시오.</li>
		<li>자극 노출 후 10 s (이 시간을 조정할 수 있습니다 사용자가 원하는대로), 다시 밸브 링크 맨 왼쪽 버튼을 누르면 버퍼의 흐름을 변경.</li>
	</ol></li> <li>버퍼 30의 창 GECI 형광 기준선으로 돌아갑니다 있도록 완료 될 때까지 아래 기록.</li>
	<li>원하는 대로 반복합니다. 수집의 끝과 다음 재판의 개시 사이 대기 30 s.</li>
</ol> 7. 분석 이미지 <ol><li>ImageJ 창에 파일을 드래그 하 여 TIFF 스택 ImageJ, 오픈 소스 소프트웨어와 함께 엽니다.</li>
	<li>커서를 사용 하 여 클릭 하 고 끌어 관심 (ROI)의 신경 주변 영역을 설정. ( 그림 3A)와 같이 관심의 신경의 soma를 포함 하도록 영역 설정.</li>
	<li>열기 클릭 하 여 투자 수익의 형광 강도의 z 스택 스택 전체 플롯-&#62; 이미지-&#62; 스택-&#62; z 축 프로필 플롯.</li>
	<li>클릭 &#34; 목록 &#34; 열리는 창에서. 편집-&#62; 값을 복사 하려면 복사. 값을 붙여 스프레드시트 프로그램으로.</li>
	<li>웜 GCaMP 식을 포함 하지 않는 영역에 투자 수익을 드래그 하 여 각 펄스에 대 한 배경 형광 분석.</li>
	<li>신경 형광 강도 값에서 배경 형광 값을 빼서 각 펄스에 대 한 배경 빼기 수행.</li>
	<li>계산 각 펄스의 각 프레임에 대 한 δ/F 0.
	<ol><li>첫 번째 1 대 한 투자 수익의 평균 휘도 값으로 계산 F 0 수집 (예: 프레임 1-10)의 s.</li>
		<li>계산된 F 0 값으로 관심의 프레임에 대 한 배경 뺀 값을 분할 하 여 δ/F 0를 계산.</li>
	</ol></li> <li>군데 모든 신경 및 모든 자극 펄스 반복.</li>
	<li>일관 된 응답 프로필, 화산재, 등 신경 각 뉴런에 대 한 모든 펄스를 평균 하 고 ( 그림 2F)에서 SEM을 계산.</li>
	<li>각 뉴런에 대 한 시간이 지남에 SEM와 평균 δ/F 0 플롯. 
	참고:이 경우에, 그것은 뿐만 아니라 각 재판의 개별 신경 응답의 heatmaps를 포함 하 일반적인 관행입니다. 그것은 개별 펄스 트레이스 (로 표시에 더 적용 수 반복된 stimulations 걸쳐 자극에 노출 되 면 칼슘 과도 일관 된 변화를 전시 하지 않는 신경 또는 다른 개인 23 그림 4)입니다. 결정 하는 데이터를 표시 하는 방법에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Behavioral+Analysis,+Microscopy,+and+Neuronal+Imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).</li><li>Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+the+analysis+of+behavior,+nerve+regeneration,+and+neural+cell+biology+in+C.+elegans.">Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).</li><li>Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worm+chips:+Microtools+for+C.+elegans+biology.">Worm chips: Microtools for C. elegans biology.</a> Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).</li><li>Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+screening+of+genes+regulating+tryptophan+hydroxylase+transcription+in+Caenorhabditis+elegans+using+microfluidics+and+an+adaptive+algorithm.">Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm.</a> Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).</li><li>Lockery, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+whole-animal+drug+screening+using+electrophysiological+measures+in+the+nematode+C.+elegans.">A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans.</a> Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).</li><li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model.">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nat Commun. 7, 13023 (2016).</li><li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).</li><li>Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+calcium+sensor+proteins+for+monitoring+neural+activity.">Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity.</a> Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).</li><li>Tatro, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+imaging+of+neurons+in+action.">Brain-wide imaging of neurons in action.</a> Front Neural Circuits. 8, 31 (2014).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li><li>Greene, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+selection+shapes+density-dependent+foraging+behaviour.">Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour.</a> Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).</li><li>Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+changes+in+two+chemoreceptor+genes+contribute+to+a+Caenorhabditis+elegans+QTL+for+foraging+behavior.">Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Chemoreceptors+Mediate+Developmental+Effects+of+Dauer+Pheromone+in+C.+elegans.">Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans.</a> Science. 326 (5955), 994-998 (2009).</li><li>McGrath, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+evolution+of+domesticated+Caenorhabditis+species+targets+pheromone+receptor+genes.">Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes.</a> Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).</li><li>Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Expression+of+Channelrhodopsin-2+in+Single+Neurons+of+Caenorhabditis+elegans.">Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structure+of+the+Nervous+System+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>White, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensory+circuitry+for+sexual+attraction+in+C.+elegans+males.">The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males.</a> Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Chute, C. D., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+mating+cues+in+C.+elegans.">Chemical mating cues in C. elegans.</a> Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).</li><li>Izrayelit, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+reveals+a+male+pheromone+and+sex-specific+ascaroside+biosynthesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).</li><li>Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascaroside+signaling+in+C.+elegans.">Ascaroside signaling in C. elegans.</a> WormBook. , 1-22 (2013).</li><li>Narayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+responses+within+a+single+neuron+class+enable+sex-specific+attraction+in+Caenorhabditis+elegans.">Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li><li>Sammut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia-derived+neurons+are+required+for+sex-specific+learning+in+C.+elegans.">Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans.</a> Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).</li><li>Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+male:+postembryonic+development+of+nongonadal+structures.">The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures.</a> Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).</li><li>Hilliard, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+C.+elegans+ASH+neurons:+cellular+response+and+adaptation+to+chemical+repellents.">In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents.</a> The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+microinjection.">Transformation and microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li><li>C&#225;ceres, I. d. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laterally+Orienting+C.+elegans+Using+Geometry+at+Microscale+for+High-Throughput+Visual+Screens+in+Neurodegeneration+and+Neuronal+Development+Studies.">Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies.</a> PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).</li><li>Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Garc&#237;a, L. R., Portman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+for+sexually+dimorphic+and+sexually+divergent+behaviors+in+Caenorhabditis+elegans.">Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).</li><li>Clokey, G. V., Jacobson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autofluorescent+&amp;#34;lipofuscin+granules&amp;#34;+in+the+intestinal+cells+of+Caenorhabditis+elegans+are+secondary+lysosomes.">The autofluorescent &amp;#34;lipofuscin granules&amp;#34; in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes.</a> Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).</li><li>Coburn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthranilate+Fluorescence+Marks+a+Calcium-Propagated+Necrotic+Wave+That+Promotes+Organismal+Death+in+C.+elegans.">Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hub-and-spoke+circuit+drives+pheromone+attraction+and+social+behaviour+in+C.+elegans.">A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans.</a> Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).</li><li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+structure-specific+and+promiscuous+G-protein-coupled+receptors+mediates+small-molecule+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).</li></ol>

저자는 공개 없다.

남성 적응 후 각 칩 좁은 로드 포트 방향 제어 및 남성 C. 선 충의 효율적인 트래핑 수 있는 회전을 채택 하고있다. Z-스태킹에 대 한 필요 없이 신경 양자 쌍의 왼쪽 및 오른쪽 회원의 시각화에 대 한 수 있습니다. 이 곡선 벌레에 시간의 수직 100% 떨어져 방향을 하나의 양자 쌍 재 (그림 2D-E)29,30같은 형광 표시와 ?...

미세 장치 증가에 액세스할 정확 하 게 제어 환경의 점에서 동물, C. 선 충, 선 충 류 실험적 조작된1수와 같은. 이러한 연구는 행동 분석, 칼슘 이미징 연구, 또는 특정 고기, 실험 결과1,2,3,4,의 더 정확한 측정 결과 대 한도 검 진 5,6. 마이크로 소규모 액체 상태는 상세한 실험 시 약의 최소한의 금액을 이용 하는 동안 실행 될 수 있습니다 제공 합니다. 거기는 새로운 미세 장치 디자인의 지속적인 생산 다르며 각각의 사용, 자연 정현파 모션 C. 선 충 의 행동 분석 및 신경 영상 연구, 신경 이미징에 사용 되는 장치를 함정을 허용 하는 경기장에서 그리고 후 각 연구, 유전자에서 높은 처리량 phenotypic 분석 화면4,5,,67대 한 허용 하는 장치. 마스터 몰드의 제작, 다음 미세 장치는 건설 비용이-마스터의 재사용성을 제공-사용 하기 쉬운, 높은 처리량 연구를 통해 빠른 데이터 생성에 대 한 허용. 등입니다 (PDMS) 폴리머를 사용 하 여 장치의 제조 시간 이내 신제품의 창조에 대 한 수 있습니다.
칼슘 이미징 연구 대상 세포에 표현 된 유전자 인코딩된 칼슘 지표 (GECIs)를 사용 하 여 실시간으로8,9,,1011에 그 세포의 신경 역학 측정. C. 선 충 의 투명 한 자연 동물에이 단백질의 형광 레벨의 기록에 대 한 수 있습니다. GECIs 녹색 형광 단백질 (GFP)을 의존 하는 전통적으로,-하지만 더 최근의 연구 더 나은 신호 대 잡음 비율 및 레드 이동 여기 프로필 있도록 이러한 센서 적응 센서 GFP Calmodulin M13 펩 티 드 (GCaMP)를 기반으로. GCaMP3의 개발에 따라 단백질이 규격 다양, GCaMP6s 및 GCaMP6f 같은 센서를 포함 하 여 (느린 빠르고 형광 오프 비율, 각각), RFP Calmodulin M13 펩 티 드 (RCaMP), 뿐만 아니라 빨간색 이동 있다 활성화 프로필입니다. C. 선 충 세포 관련 유전자 발기인 시퀀스와 이러한 GECIs 조합의 관심사, 특히 감각 신경12,13,,1415 의 세포를 타겟팅 할 수 있습니다. , 16.
미세 연구에 선 충 C. 사용의 용이성 명백한 동안, 거의 모든 연구는 광고에 나온 것에 집중 했다. 남성만 0.01-0.02에 대 한 회계에 불구 하 고 야생 형식 인구의 %, 귀중 한 발견 그들의 특성에서 발생할 수 있습니다. 자웅 동체 신경 시스템의 물리적 텀 수십 년17완벽 하 게 매핑 되었습니다, 반면 남성 텀 동물18의 머리 지역에서 특히 불완전, 남아 있습니다. 칼슘 이미징 남성에서의 사용은 남성 신 경계와 두 남녀 사이 발생 하는 차이 대 한 이해를 생성 하는 데 도움이 됩니다. 선 충 C. 성인 남성의 더 작은 크기는 큰 광고에 나온 것을 위한 전통적인 후 각 장치의 로드 포트에 효과적이 고 신뢰할 수 있는 트래핑 방지할 수 있습니다. 이 해결 하기 위해 Chronis 후 각 칩19 의 수정된 된 버전 좁은 로드 포트, 낮은 채널 높이, 개발 되었다 고 웜 로드 포트 (이 동물 회전), 양자 왼쪽/오른쪽의 시각화에 대 한 허용에 신경 쌍입니다. 이 디자인 허용: 젊은 성인 남성 (1) 효과적인 트랩핑, 양자 쌍된 뉴런의 두 멤버와 남성 뉴런에서 신경 활동의 정확한 영상 (3)의 시각화에 대 한 동물의 보다 안정적인 방향 (2).
점점, 연구 선 충 C. 남성 ascarosides (ascr), 또는 선 충 류 페로몬20,,2122,23의 다양 한 광고에 나온 것 보다 다르게 응답 표시 ,24. 따라서, 신경 역학과 남성 텀 내 표현에 대 한 이해를 개발 훨씬 더 관련 되고있다. 남성 선 충 C. 포함 자웅 동체25,26에 없음 87 섹스 관련 신경으로에 텀을 변경-아직 불확 실한 방법. 이러한 독특한 신경 역학 이미지를 수 있는 더 나은 섹스 관련 응답 및 신경 표현 이해 하 고 우리 수 있습니다.
이 프로토콜은 남성 C. 선 충 의 신경 영상에 대 한 남성 적응 후 각 칩의 사용을 설명 합니다 chemosensation. 재 1 M 글리세롤 남성, 이전 일치에 자웅 동체에 안정적으로 응답 nociceptive 신경 연구27. Ascarosides에 노출은 변수 동물 동물에서 시험 될 동물의 많은 수를 요구 하는 응답을 유도 수 있습니다. 남성 전용 CEM 뉴런의 응답 이전 표시 되었습니다, 전기 생리학 및 칼슘 이미징 연구를 통해 변함없이 ascaroside #323응답.

<table><tbody><tr><td>Silicon Wafer</td><td>University Wafer</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2035</td><td>MicroChem</td><td>Y111070-0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100-4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>Wafer Mask</td><td>Cad/Art Services</td><td>-</td><td>Custom order. Printed at 25,000 dpi.</td></tr><tr><td>Sylgard-184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm Dermal Punches</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P150</td><td></td></tr><tr><td>Soft Tubing</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-06419-01</td><td></td></tr><tr><td>Hard Tubing</td><td>IDEX Health &amp;amp; Science</td><td>1622</td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td>New England Small Tube</td><td>NE-1027-12</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Pins</td><td>New England Small Tube</td><td>0.415/0.425&quot; OD x .500 Long</td><td>Batch PB07027</td></tr><tr><td>3 mL syringes</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>30 mL syringes</td><td>Vitality Medical</td><td>302832</td><td>Used as buffer reservoirs.</td></tr><tr><td>Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer</td><td>Component Supply Company</td><td>NE-231PL-50</td><td></td></tr><tr><td>Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-30600-07</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Mercator Control System LF-5 Plasma System</td><td>Mercator</td><td>LF-5</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Tape</td><td>Scotch</td><td>BSN43575</td><td></td></tr><tr><td>Series 20 Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>P-2</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Desicator</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>420250000</td><td>24 cm inner diameter.</td></tr><tr><td>Weigh Boats</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-01017-27</td><td></td></tr><tr><td>Classic Plus Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1501-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipettes</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-25554-06</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Genesee Scientific</td><td>30-202</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Sheldon Manufacturing Inc</td><td>9120993</td><td>Model Number: 1500E.</td></tr><tr><td>60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes</td><td>TriTech Research</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.A1</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS</td><td>Hammamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Blue Fluorescent Light</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM6-LCR-SA</td><td>24-30V/7.9A DC.</td></tr><tr><td>Illumination Adaptor</td><td>Zeiss</td><td>423302-0000</td><td></td></tr><tr><td>Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve</td><td>Parker</td><td>001-0017-900</td><td>3-way valve for controlling flow.</td></tr><tr><td>ValveLink8.2&amp;reg;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>01-18</td><td>Flow Switch Controller</td></tr><tr><td>Micro Manager</td><td>Micro-Manager</td><td>-</td><td>Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>ImageJ</td><td>-</td><td>Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Agar, Bacteriological Grade</td><td>Apex</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Apex</td><td>20-260</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>BDH0224-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270741-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756-10(G)</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fluorescein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S-250mg</td><td>Light Sensitive. Store in photoprotective vials.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ascaroside #3</td><td>-</td><td>-</td><td>Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University).</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-215</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>BDH</td><td>BDH9268.25</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-025</td><td></td></tr><tr><td>ASH GCaMP3 line</td><td>-</td><td>-</td><td>CX10979 (KyEx2865 [p&lt;em&gt;sra&lt;/em&gt;-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library.</td></tr><tr><td>CEM GCaMP6 line</td><td>-</td><td>-</td><td>JSR49 (FkEx98[p&lt;em&gt;pkd&lt;/em&gt;-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; &lt;em&gt;pha&lt;/em&gt;-1(e2123ts); &lt;em&gt;him&lt;/em&gt;-5(e1490); &lt;em&gt;lite&lt;/em&gt;-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; (OP50)</td><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis&lt;/em&gt; Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>&quot;Reservoir&quot;</td><td>-</td><td>-</td><td>To create a Reservoir: A &quot;30 mL syringe&quot;, is connected to a &quot;Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile&quot;, which is connected to a &quot;3 mL syringe&quot; and a &quot;Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer&quot;. The &quot;Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer&quot; is then inserted into &quot;Soft Tubing&quot; approximately 1/3 of the way down the needle.</td></tr></tbody></table>

using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male c. elegans head neurons

칼슘 지표의 사용은 크게 신경 역학 및 규칙의 우리의 이해를 강화 했다. 완전히 매핑된 신 경계와 투명 한 해부학, 선 충 류 꼬마 선 충, 칼슘 표시기를 사용 하 여 실시간 신경 역학을 이해 하기 위한 이상적인 모델을 제공 합니다. 미세 기술 및 실험 설계와 함께, 자유로운 이동 및 덫을 놓은 동물 칼슘 이미징 연구가이 표시기를 사용 하 여 수행 됩니다. 그러나, Chronis 그 외 여러분에서 설명한 후 각 칩 등의 트랩 장치를 이용 하 여 대부분 이전 연구는 보다 적게 일반적인 남성은 둘 다 형태학 상으로 그리고 구조적으로 더 일반적인 자웅 동체에 사용 하기 위해 설계 된 장치 비슷하지. 적응된 후 각 칩 설계와 젊은 성인 동물을 사용 하 여 남성 신경 이미징에서 증가 효율성에 대 한 조작. 차례는 웜 포트 동물 회전 하 고 2D 영상에서 양측 쌍 개별 뉴런의 분리에 대 한 로드로 통합 되었다. 벌레는 자웅 동체 연구 이전에 설명 된 대로 odorant 미세 소자 내에서 제어 흐름에 노출 됩니다. 칼슘 과도 다음 ImageJ의 오픈 소스 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다. 여기에 설명 된 절차는 남성 기반 C. 선 충 의 증가 금액에 대 한 허용 해야 칼슘 이미징 연구, 섹스 관련 신경 신호 전달의 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 심화.

그림 1A-B에서 전체 장치 설치의 예를 볼 수 있습니다. 그림 1A 는 적절 한 저수지 건설 및 설치를 보여 줍니다. 그림 1B 미세 장치에 저수지의 연결을 보여 줍니다. 그림 1C 는 개별 포트 선명도 대 한 분류와 미세 장치를 묘사 한다.
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Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

using-an-adapted-microfluidic-olfactory-chip-for-imaging-neuronal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

8.0K 조회수.  Worcester Polytechnic Institute. C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.

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Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

연구

생체공학

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

신경과학

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

선충 집단에 기반한 화학 감응도 선호 분석의 자동화 된 분석

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

행동분석학

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

라이브 이미징 및 상해 응답의 연구에 대한 마이크로 유체 칩을 사용<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

의 장기 강한 적응의 분자 판독<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; Schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

<meta charset="utf8"></head><body>예쁜꼬마선충(C. elegans)의 휘발성 성 페로몬 반응의 추출 및 정량화

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and computations governing these signals remains an active area of research. The nematode Caenorhabditis elegans provides a powerful model for studying these processes as it produces a volatile sex pheromone. This pheromone is synthesized by virgin females or sperm-depleted hermaphrodites and serves as an attractant for males.
This protocol describes a detailed method for isolating the volatile sex pheromone from several C. elegans strains (WT strain N2, daf-22, and fog-2) and C. remanei. We also provide a protocol for quantifying the male chemotaxis response to the volatile sex pheromone. Our analysis utilizes measurements such as chemotaxis index (C.I.), arrival time (A.T.), and a trajectory plot to compare male responses under various conditions accurately. This method allows for robust comparisons between males of different genetic backgrounds or developmental stages. Furthermore, the experimental setup outlined here is adaptable to investigating other chemoattraction chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 수컷 예쁜꼬마선 충 행동에 대한 휘발성 성 페로몬 영향 조사

This protocol establishes methods for extracting and quantifying responses to the volatile sex pheromone in C. elegans, providing tools to study chemical communication and navigation trajectory.

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 휘발성 성 페로몬 추출 및 화학매력 분석)

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

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에 대한 간단한 마이크로 유체 장치

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

선충 집단에 기반한 화학 감응도 선호 분석의 자동화 된 분석

라이브 이미징 및 상해 응답의 연구에 대한 마이크로 유체 칩을 사용

의 장기 강한 적응의 분자 판독

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 휘발성 성 페로몬 추출 및 화학매력 분석)

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 휘발성 성 페로몬 추출 및 화학매력 분석)

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 휘발성 성 페로몬 추출 및 화학매력 분석)

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여