저자 에릭 Fonteyn 우수한 기술 지원에 대해 감사 하 고 싶습니다. 이 일 구 루벤에 의해 지원 되었습니다 (no를 부여 합니다. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, no를 부여. G.485.08)와 Fondation Dormeur 파두츠.

1입니다. 세포 배양의 유지 보수
참고: 1과 2에 설명 된 모든 단계는 층 류 캐비닛에 무 균 조건 하에서 수행 됩니다.
<ol><li>37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터 T75 문화 플라스 크에 세포 성장. 참고:이 분석 결과에서 Jurkat 세포 (즉, 인간의 leukemic T 림프 구 세포 endogenously CXCR417익스프레스)는 사용 됩니다. 세포 표면에 CXCR4 표현의 cytometry에 의하여 세포 배양을 통해 평가 되어야 한다. 그러나 교류 cytometry 절차 및 셀 표면에 수용 체 식 수준 아니다,,이 프로토콜의 범위 내에서 하지만 되었습니다 확인 시 약의 설명 설명 이전17.</li>
	<li>하자 Jurkat 세포 성장에 80-85%에 도달할 때까지 confluency. 소설 플라스 크에 세포를 뿌리고, 하기 전에 실내 온도 (RT)를 도달 하는 모든 시 약을 하실 수 있습니다.</li>
	<li>소설 T75 문화 플라스 크를 신선한 완전 한 성장 매체 (RPMI-1640 매체, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2mm 글루타민) 20 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>소설 T75 문화 플라스 크를 (세포 현 탁 액 25 mL를 포함 하는) 원래 T75 플라스 크에서 Jurkat 세포 현 탁 액 5 mL를 추가 합니다. 습도 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2 에서 품 어.</li>
</ol>2. 경쟁 분석 결과 바인딩 CXCL12, 분석 결과 버퍼 및 Jurkat 세포의 준비.
<ol><li>동결 건조 된 시 약 (어둠 속에서-80 ° C에 저장) 초순 0.01% (볼륨/볼륨) 폴 20의 보충에 용 해 하 여 CXCL12AF647 (20 µ g/mL, 참조 테이블의 재료 및 시 약)의 재고 솔루션을 준비 합니다. 단일 저장소-80 ° c, 빛 으로부터 보호이 재고 솔루션에서 aliquots를 사용 합니다.</li>
	<li>200 mL 행 크의 균형 소금물 (HBSS, 10 배, 페 놀 레드과 나트륨 중 탄산염, 최종 농도 x 1 없이) 40 mL HEPES (1 M, 20mm 최종 농도)를 추가 하 여 분석 결과 버퍼를 준비 합니다. 추가 초순 2 L. 추가 4 g (0.2% 무게/볼륨) 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 최종 볼륨을 가져오고 자기 통해 BSA를 분해 하는 감동. 마지막으로, pH 7.4 (NaOH을 사용 하 여이 대 한)를 조정 하 고 참조 테이블의 재료 및 시 약0.2 µ m 숨 구멍을 통해 솔루션 필터 진공 매니폴드를 사용 하 여. 참고:이 분석 결과 버퍼 프로토콜의 모든 추가 단계에 사용 됩니다.</li>
	<li>수와 세포의 생존 능력을 계산 합니다. 이 위해, 세포 현 탁 액의 샘플 고 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 희석. 참고: 우리 정기적으로 사용 하 여 자동된 세포 생존 능력 분석 ( 테이블의 재료 및 시 약참조) 다양 한 농도에서 세포 정지 계산의 능력. 셀 계산에 대 한 세포 현 탁 액 1.5 ml PBS (다른 희석, 예를 들어, 1.9 ml PBS, 0.1 mL 있습니다 가능) 0.5 mL를 희석. Trypan blue 염료 제외 방법에 근거 하는이 메서드의 사용 되었습니다26위에서 설명한. 다른 여러 장치 계산 셀 번호와 동일 하 게 작동 하는 생존에 대 한 상업적으로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>5 분에 대 한 400 x g에서 원심 (사용 하는 원심 분리기의 종류에 대 한 재료 및 시 약의 표 참조)에 의해 살 균 50 mL 튜브에 셀 (즉, ~ 24 x 106 셀 하나의 완전 한 96 잘 접시와 분석 결과 실행)의 원하는 번호를 수집 실시간</li>
	<li>부드럽게 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 붓는 다. 신선한 분석 결과 버퍼를 추가 (예: 20 mL)와 부드럽게 위아래로 pipetting으로 셀 resuspend.</li>
	<li>실시간에서 5 분에 대 한 400 x g에서 다시 셀을 원심</li>
	<li>상쾌한 떨어져 다시와 5 x 106 셀/mL의 조밀도를 신선한 분석 결과 버퍼에서 셀 펠 릿 resuspend.</li>
</ol>3. 경쟁 의무적인 분석 실험
참고: 실제 경쟁 바인딩 분석 결과 RT에서 수행 되 고 비 살 균 조건 하에서 수행할 수 있습니다.
<ol><li>조사 분석 결과 버퍼에서 화합물을 희석 (2.2 참조) 원하는 농도를. 자세한 화합물의 특성에 대 한 초기 심사 (예를 들어, 10 µ M 최종 농도)에 대 한 화합물의 농도 고정된 하거나, 또는 농도의 직렬 희석 시리즈 준비 중 (예를 들어, 1/3, 1/4 또는 1 / 5 희석 시리즈 1 µ M, 최종 농도에서 시작). 복합 솔루션 궁극적으로 2 x 분석 결과;에 희석 될 다는 것을 명심합니다 따라서, 집중된 솔루션 x 2를 준비 합니다.</li>
	<li>바닥판 라운드 분명 96-잘으로 복합 솔루션 (2 배 농축) 100 µ L를 분배 ( 테이블의 재료 및 시 약참조) 밖으로 (예를 들어, 그림 1C) 미리 정의 된 실험 배치에 따르면. 참고:이 단계에서 부정과 긍정적인 제어 샘플 분석 결과에 포함 됩니다. 부정적인 컨트롤 샘플분석 결과 버퍼의 100 µ L 96 잘 접시의 우물에 화합물 대신 추가 됩니다. 긍정적인 컨트롤 샘플에 대 한 분석 결과 버퍼는이 단계에 추가 됩니다. 또한 여러 가지 화합물의 희석 시리즈 테스트는 일반적인 실험 레이아웃에 대 한 그림 1C 참조.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 50 µ L 추가 (2.7; 참조 106 셀 x 0.25) 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시에 시 약 저수지에서. 어둠 속에서 RT에서 15 분 동안 접시를 품 어.</li>
	<li>붙일 레이블된 CXCL12의 50 µ L 추가 (CXCL12AF647 분석 결과 버퍼, 집중 하는 4 x 25 ng/mL의 최종 농도에즉, 100 ng/mL) 96 잘 접시의 우물에 비슷한 시 저수지에서. 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 품 어. 주: 부정적인 컨트롤 샘플에 대 한 추가 분석 결과 버퍼 대신 합니다. 따라서, 부정적인 컨트롤 샘플에서 검출 하는 형광 신호 autofluorescent 배경 신호 (그림 1A)에 대응 됩니다. 긍정적인 통제 견본CXCL12AF647의 50 µ L/잘 추가 합니다. 긍정적인 통제 견본 최대한 형광 신호 감지, 이후 아무 잠재적인 억제 화합물과 사전 외피에 의해 포함 되었다 (그림 1A)를 얻을 것입니다.</li>
	<li>접시를 뒤집어 여 실시간 제거 수송과 세포에서 상쾌한에 5 분에 대 한 400 x g에서 96 잘 접시를 원심. 조직에 접시를 건조.</li>
	<li>멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 우물을 시 저수지에서 신선한 분석 결과 버퍼의 200 µ L를 추가 합니다. 바로 진행 합니다.</li>
	<li>접시를 뒤집어 여 실시간 제거는 상쾌한에 x 400g에 5 분 동안 다시 접시를 원심 하 고 조직에 다시 그것을 건조.</li>
	<li>부드럽게 1% paraformaldehyde PBS에 용 해의 200 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend. 이 단계는 셀 해결 됩니다.</li>
	<li>Cytometry 여 형광의 정량화와 즉시 프로토콜을 계속 합니다.</li>
</ol>4. cytometry에 의해 샘플의 분석
CXCL12AF647 얼룩이 고 집착된 셀 cytometry 사용 하 여 분석할 준비가 됩니다. 교류 cytometers의 여러 종류를 사용할 수 있습니다, 하지만 그들은 정확한 레이저 (즉, 빨간색 레이저, 여기 범위 ~ 630 nm) 여기와 fluorophore 탐지에 대 한 적합 한 필터 장착 해야 (방출 필터 ~ 660 nm). 그들은 96 잘 접시 형태로 샘플을 처리할 수 있이 필요가 있다. 적당 한 흐름 cytometry 장치의 예는 테이블의 재료 및 시 약에부여 됩니다.
<ol><li>장치를 시작 하 고 해당 소프트웨어를 열고 ( 테이블의 재료 및 시 약참조).</li>
	<li>점 오 점 형식으로 시각을 다음 세포 매개 변수 선택: 산포 (FSC), 측면 살포 (SSC) 및 fluorophore (CXCL12AF647) 검색 채널 전달. 참고: FSC 매개 변수를 사용 하는 세포는 차별 그들의 크기에 따라 감지 된 빛 흡수 셀의 직경에 비례 이기 때문. SSC 매개 변수를 90 ° 각도로 산란 측정 셀의 세분성에 대 한 정보를 제공 합니다.</li>
	<li>FSC 그리고 SSC 매개 변수를 기반으로 정의 된 동질적인 셀 인구의 게이팅을 수행 하려면 하나의 샘플 (예를 들어, 부정적인 컨트롤 샘플)을 선택 합니다.<ol>
<li>교류 cytometer에 집착 셀 ~ 100 µ L의 자동 주입이 부정적인 컨트롤 샘플에서 선택 합니다. 옵션 "혼합" 주입 하기 전에 선택한 1.5 µ L/s의 샘플 유량을 사용 합니다.</li>
		<li>"취득 데이터."를 선택 하 여이 샘플을 실행 이 샘플에 대 한 FSC 그리고 SSC 매개 변수는 화면에 표시 됩니다.</li>
		<li>소프트웨어의 제어 도구를 선택 합니다. 미리 FSC 그리고 SSC 점 오 점 시각에 따라 달라 집니다, 게이팅 하 여 균일 하 고 가능한 세포 인구를 정의 합니다. 이렇게 하려면 homogenously 분산된 단일 셀 (이 하 "행사")이 두 차원에 따라 포함 (를 사용 하 여 소프트웨어의 제어 도구) 다각형을 만듭니다. 참고: 제어 절차는 추가 분석을 위해 사용 될 것 이다 균질이 고 실행 가능한 세포 인구를 정의 하는 것을 목표로. 게이팅 가능한 세포의 대다수 FSC 그리고 SSC 매개 변수에 따라 동종 세포 인구를 형성할 것 이다 가정에 의존 합니다. 이 단계를 수행 하 여 세포질 파편, 죽은 세포, 및 셀 집계 수 주로에서 제외 추가 분석. 제어 프로세스의 그림은 그림 1B에서 제공 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20000 "" (즉, 단일 셀) 당 이벤트 샘플 분석을 선택 합니다. 참고:이 각 샘플에 대 한 미리 정의 된 게이트 내에 있는 20000 셀 결국 분석 될 것 이다 의미 합니다. 각 샘플에 대 한 데이터 수집 이벤트의이 수 분석 될 때까지 계속 됩니다.</li>
	<li>실행 (선택 "레코드 데이터")를 시작 합니다. 교류 cytometry 장치 각 샘플에 대 한 평균 형광 강도 (MFI)을 기록 하 여 지금 모든 샘플 하나 하나를 분석 합니다. 이 MFI 의미 형광 신호에 해당 하는 미리 정의 된 게이트 내에 있는 20000 셀에 해당 합니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
각 샘플에 대 한 얻은 MFI를 사용 하 여 모든 추가 계산을 수행 하. 교류 cytometry 데이터의 분석 ( 테이블의 재료 및 시 약참조) 여러 상용 소프트웨어 패키지에서 수행할 수 있습니다.
<ol><li>복합 사전 인큐베이션 결과로 형광 바인딩 신호의 비율 억제를 결정 하려면 다음 수식을 적용. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq1.jpg"> 장소: MFI특급 (= 화합물 취급) 실험의 MFI = 샘플 MFIPC 긍정적인 통제의 MFI를 = MFINC 부정적인 컨트롤의 MFI를 =</li>
	<li>(즉, 50%에 의해 형광 바인딩 신호를 줄일 수 있는 화합물의 농도) 화합물의 IC50 값을 확인 하려면 다음 수식을 적용: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57271/57271eq2.jpg"> 장소: 로그conc.2 = 50% 미만에서 발생 하는 화합물의 농도의 로그 PC와 NC의 MFI 값의 차이의 저해 로그conc.1 = 50% 이상에서 발생 하는 화합물의 농도의 로그 PC와 NC의 MFI 값의 차이의 저해 참고: 또는, 높은 활성 화합물의 경우 규모의 여러 로그를 다루는 복용량 응답 곡선 생성할 수 있습니다 화합물의 각 시험된 농도에 해당 MFI에 기반. 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 비선형 회귀 곡선 맞춤을 적용 하 여 (참조 테이블의 재료 및 시 약), IC50 값 다음 생성 된 커브에서 연 역 될 수 있습니다. 이 분석 방법의 예는 그림 3에 표시 됩니다.</li>
</ol>

<ol>
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Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1/CXCL12+binds+to+and+signals+through+the+orphan+receptor+RDC1+in+T+lymphocytes.">The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes.</a> J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).</li><li>Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chemokine+receptor+for+SDF-1+and+I-TAC+involved+in+cell+survival,+cell+adhesion,+and+tumor+development.">A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development.</a> J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).</li><li>Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptors+with+fluorescent+ligands.">Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands.</a> Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).</li><li>Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+small-molecule+fluorescent-conjugate+toolbox+for+Class+A+GPCRs.">The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs.</a> Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).</li><li>Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-+and+bioluminescence-based+approaches+to+study+GPCR+ligand+binding.">Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding.</a> Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

바인딩 분석 (즉, 채도 바인딩 및 바인딩 운동 실험)의 다른 유형에 비해, 경쟁 의무적인 분석 실험은 심사 목적에 가장 적합. 실제로, 그들은 레이블이 지정 된 수용 체 ligand의 고정 된 금액의 바인딩을 방해 하는 그들의 기능을 채 점 하 여 레이블이 없는 화합물, 예를 들어 작은 분자의 큰 배치의 평가 허용. 레이블이 리간드 보다 다른 수용 체 사이트에 바인딩되는 화합물 분석 결과에 들 ?...

G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)는 세포 표면 단백질 (예를 들면, 펩 티 드, 단백질 호르몬, 아민) extracellular ligands에 의해 활성화 될 수 있는, 많은 생리 적 그리고 발달을 조절 함으로써 처리1. 한 길 항 제는 GPCR 바인딩 주머니 차지 하 고, 수용 체 단백질에 유도 구조적 변화 Gα의 구성 된 세포내 수용 체 관련 된 heterotrimeric G 단백질의 바인딩을 촉진-GDP와 Gβγ 소 단위. Gα 소 단위 결과 G 단백질 소 단위 (Gα-GTP와 Gβγ)를 차례로 추가 시작 하류의 분리에 GDP에 대 한 GTP의 후속 교환 신호 경로2,3. Gα-GTP 분해 된다 때 다시 협회 Gα의 GDP와 Gβγ 소 단위 변환 G 단백질 다시는 휴식 상태3,4. G 단백질의 다른 종류 (Gs, Gi/o, Gq, G12/13), 존재는 Gα 소 단위5시퀀스 유사성에 따라 분류 한다. 모두 이러한 G 단백질 수용 체 활성화에 생물학 응답 기초 정의 된 세포내 신호 통로 유도. 수용 체 활성화 후 GPCR kinases (GRKs) 함으로써 β-arrestins와의 상호 작용을 촉진 하는 GPCRs의 세포내 꼬리 phosphorylate. 이 프로세스는 G 단백질 신호, 수용 체 탈 감 작과 국제화6의 종료에 리드. Β-arrestins는7을 신호 하는 G 단백질의 독립적인 폭포 트리거 신호 다 분자 복합물의 부분 있습니다.
GPCRs는 치료 적 개입에 대 한 가장 유효한 분자 표적 사이 많은의 병 인에 기여 하 고 규제 완화 GPCR 중재 신호, 예를 들면 수용 체 유전자 또는 수용 체 overexpression에 이득의 기능 돌연변이 때문으로 인간의 질병8. 따라서, GPCRs 제약 산업8,,910조사 약물 목표의 가장 중요 한 클래스 중 하나를 나타냅니다. 임상 관련 GPCR의 주목할 만한 보기는 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4) CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)11유일한 자연 리간드에 의해 활성화 될 수 있는 이다. 때문에 인간 면역 결핍 바이러스 1에 대 한 주요 공동 수용 체로 서의 설립된 역할 (HIV-1) 항목 및 클러스터 차별화 4의 (CD4) 긍정적인 T 세포12, CXCR4 항 바이러스 약물 대상으로 조사에 처음에 감염. 더 골에서 CXCL12 CXCR4 상호 작용 조절 유지 그리고 줄기와 뿌리의 유도 세포13. 또한, 암 생물학 (예: 종양 세포 생존, 전이, 종양 관련 신생)14 의 여러 측면에 몇 가지 다른 인간의 질병 (예를 들어, 염증 성 질환)15, CXCR4의 개입을 주어진 약물 발견에 대 한 유망 대상으로 상당한 관심을 발생합니다. AMD3100, 특히 표적으로 CXCR4, 작은 분자 항 HIV 약물 후보16 처음 밝혀졌다 이며 여전히 가장 강력한 CXCR4 길 항 근 날짜17에 설명 중 하나. 그러나 개발으로는 항 바이러스 약물은,,18를 중단. 현재이 분자 다 발성 림프 종 환자18의 치료 중 줄기 세포 동원 에이전트로 사용 됩니다. 다른 여러 가지 화학적으로 관련이 없는 작은 분자와 다양 한 효능 가진 CXCR4 기능을 억제 하는 생물 의약품 설명된19되었습니다.
수용 체 바인딩 메서드는 관심의 GPCR와 직접 상호 작용 하는 화합물 (예를 들어, 작은 분자)의 id를 허용 하는 약리학에 귀중 한 도구입니다. 바인딩 연구를 수행 하기 위해서는 세포내 신호 속성 또는 특정된 GPCR의 기능에 관한 사전 지식에 대 한 필요가 있다. 이 이점을로 간주 될 수 있습니다, 하지만 그것은 화합물 바인딩 설명 될 수 있는 수용 체에 대 한 그들의 잠재적인 agonistic 또는 대립 활동을 평가 하 여 특징 추가 될 필요가 의미. 이 활동은 GPCR 연구에 관련 된 약리학 또는 생물학 분석 실험을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 그들의 작업 프로필에 의존, 수용 체 바인딩 분자 수 있습니다 다음 잠재적으로 진화 될 전 임상 및 임상 연구에 조사에 대 한 소설 리드 화합물. 예를 들어 종양 세포20, 비 침 투 적인 vivo에서 이미징 radiolabeling 여 치료 또는 진단 도구를 생성 하는 건설 기계 또는 잠재력으로 특히 높은 선호도와 수용 체에 묶는 분자도 사용할 수 있습니다. 치료제21의 대상 배달 차량. CXCR4, 경우 종양 세포의 이미징 vivo에서 이미 입증 되었습니다 레이블이 CXCR4 타겟팅 분자 인간 암 xenografts20,22,23의 시각화를 허용 하는 어떤 점에서 마우스 모델을 사용 하 여 .
이 보고서에서 우리는 작은 분자와 방해 하는 직접 길 항 제 (CXCL12) 바인딩 CXCR4 biologics의 식별을 가능 하 게 경쟁 바인딩 분석 결과 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 분석 결과의 기본 원리는 붙일 레이블된 ligand의 고정 된 금액 간의 경쟁 (CXCL12AF647, 참조 테이블의 재료 및 시 약)과 화합물 바인딩 수용 체 단백질17, 에 대 한 레이블 없음 24. 레이블이 ligand CXCR4 표현 하는 단일 셀에 바인딩된에서 특정 형광 신호 다음 cytometry에 의해 분석 됩니다. 이 형광 신호 레이블 없는 작은 분자 CXCL12AF647 와 CXCR4 간의 상호 작용을 방해 하는 경우에 줄어들 것입니다. 분석 결과 endogenously 익스프레스 CXCR4 조작 아닌 살아있는 세포를 사용 하 여 (즉, Jurkat 세포). 따라서, 아무 세포 막 준비는 필요 하 게 분석 결과 편리, 신속 하 고 늘어난된 처리량과 호환. 붙일 레이블된 ligand 사용 되므로 방사능은 피 한다.
분석 결과에서 CXCL12AF647 바인딩을 방해 하는 작은 분자 화합물 (즉, 바인딩 사이트는 자연에 의해 점령 orthosteric 수용 체 바인딩 사이트와 상호 작용을 확률이 CXCL12 CXCR4 위한 자연 길 항 제 이므로 주 작동 근)입니다. 그들은 CXCL12의 바인딩을 좌우 하지 않는다 것 세 orthosteric 바인딩 사이트에서 고유 수용 체 바인딩 사이트와 상호 작용 하는 분자 들 키 지 않고, 남아 있습니다. 예를 들어, 긍정적이 고 부정적인 allosteric 변조기, 분자 allosteric 바인딩 사이트25에 행동을 타겟팅 하는 GPCR의 중요 하 고 신흥 카테고리 것입니다 잠재적으로 하지 주워이 분석 결과 함께. 또한, 수용 체 길 항 제 또는 촉진제로는 화합물이 바인딩 분석 기능으로 식별 여부를 파생 수 없습니다. 추가적인 약리 또는 기능 수용 체 관련 분석 실험에서 확인 된 화합물의 조사 따라서 하셔야 합니다. 이 분석 실험의 (조합) 포함 될 수 있습니다 두 번째 메신저 (예를 들어, 캘리포니아2 +, 순환 아데노신 monophosphate (캠프)), phenotypic의 검출에 대 한 분석 실험 세포 형광 또는 발광 기반 또는 생물학 분석 실험 및 β-arrestin GPCR 연구의 특정 신호 속성에 따라 어떤 선택 채용 분석 실험 따라서, 주로 여기에 설명 된 경쟁 바인딩 분석 결과 초기 심사 분석 결과 수용 체 바인딩 힘으로 화합물의 깊이 특성을 사용 하도록 다른 세포 기반 분석으로 보완 하는 역할을 합니다.

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>Becton Dickinson</td><td>Not applicable</td><td>Flow cytometry device</td></tr><tr><td>BD FACSDIVA Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSArray</td><td>Becton Dickinson</td><td>Not applicable</td><td>Flow cytometry device</td></tr><tr><td>BD FACSArray System Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td>software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vi-CELL</td><td>Beckman Coulter</td><td>Not applicable</td><td>cell viability analyzer</td></tr><tr><td>Sigma 3-18 KS</td><td>Sigma</td><td>Not applicable</td><td>centrifuge</td></tr><tr><td>AMD3100</td><td>Sigma</td><td>A5602-5mg</td><td>specific CXCR4 antagonist</td></tr><tr><td>Maraviroc</td><td>Pfizer</td><td></td><td>antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)</td></tr><tr><td>h-SDF1a (AF647)</td><td>ALMAC</td><td>CAF-11-B-01</td><td>fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1933-25G</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14065-049</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat cells</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagent reservoir PP</td><td>Sigma</td><td>BR703411</td><td></td></tr><tr><td>Rapid flow filter: 0.2 &amp;micro;m aPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear</td><td>Thermo Scientific</td><td>611U96</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes, 50ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask (T75)</td><td>Corning</td><td>353024</td><td></td></tr></tbody></table>

a flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled cxc chemokine ligand 12 to cxc chemokine receptor 4

G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)의 약리 타겟팅으로 많은 질병의 진행에 기여 장애 GPCR 중재 신호 인간의 건강에 매우 중요입니다. 수용 체의 ligand 쌍 CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) / CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4) 암 및 염증 성 질환의 치료에 대 한 잠재적인 대상으로 예를 들어 중요 한 임상 관심을 제기 하고있다. 특히 CXCR4 대상 및 수용 체의 기능을 억제 하는 치료 항 체로 서 작은 분자 약리학 유용한 도구 간주 됩니다 따라서. 여기, 흐름 cytometry 기반 셀룰러 분석 결과 CXCL12 바인딩을 CXCR4, 파기 화합물 (예를 들어, 작은 분자) 수 있도록 설명 되어 있습니다. 기본적으로, 분석 결과 붙일 레이블된 CXCL12, CXCR4, 자연 chemokine 주 작동 근의 고정 된 금액 및 레이블이 없는 화합물 사이의 바인딩 수용 체에 대 한 경쟁에 의존 합니다. 따라서, 방사성 레이블이 프로브를 사용 하 여 바람직하지이 분석 결과에 피 한다. 또한, 살아있는 세포 수용 체 (CXCR4) 세포 막 준비 대신의 원본으로 사용 됩니다. 처리량을 증가 플레이트 형식으로 분석 결과의 쉬운 적응 수 있습니다. 이 분석 결과 CXCR4 대상 화합물을 식별 하 귀중 한 제네릭 약물 발견 분석 결과 되도록 표시 되었습니다. 프로토콜 가능성이 적용할 수 있습니다 다른 GPCRs에 적어도 붙일 레이블된 ligands 사용할 수 있습니다 또는 생성 될 수 있습니다. 이러한 GPCRs의 활성화 유도 된 세포내 신호 통로 관한 사전 지식이 필요 하지 않습니다.

바인딩 분석 결과의 일반적인 워크플로 그림 1A에 제공 됩니다. 다른 샘플 형식 (즉, 부정적인 컨트롤, 긍정적인 제어 및 실험 샘플) 표준 실험에 대 한 얻은 흐름 cytometry 데이터 유형의 그림은 묘사 그림 1B을 가능한 접시 레이아웃을 수행 하 96 잘 접시 형태로 분석 결과 그림 1C에서 주어진 다. Endogeno...

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A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4

한 흐름 cytometry 기반 셀룰러 바인딩 분석 결과 설명 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)에 붙일 레이블된 CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)의 바인딩을 억제 하는 화합물을 식별 하는 검사 도구로 주로 사용 되는.

CXC Chemokine 수용 체 4에 붙일 레이블 CXC Chemokine Ligand 12의 바인딩 중단 하는 화합물을 식별 하는 흐름 Cytometry 기반 시험

Pharmacological targeting of G protein-coupled receptors (GPCRs) is of great importance to human health, as dysfunctional GPCR-mediated signaling ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K 조회수.  KU Leuven. 한 흐름 cytometry 기반 셀룰러 바인딩 분석 결과 설명 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)에 붙일 레이블된 CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)의 바인딩을 억제 하는 화합물을 식별 하는 검사 도구로 주로 사용 되는.

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Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

연구

면역학 및 감염병학

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many proteins. Classic imaging techniques have been used to study these phenomena. However, they required the manual acquisition of many cells followed by time consuming quantification of the morphology and the co-localization of the staining of tens of cells. Here, a rapid and powerful method is described to study these phenomena on samples consisting of several thousands of cells using an imaging flow cytometry technology that combines the advantages of a microscope with those of a cytometer. Using T lymphocytes stimulated with CCL19 and staining for MHC Class I molecules and filamentous actin, a gating strategy is presented to measure simultaneously the degree of shape alterations and the extent of co-localization of markers that are affected by CCL19 signaling. Moreover, this gating strategy allowed us to observe the segregation of filamentous actin (at the front) and phosphorylated Ezrin-Radixin-Moesin (phospho-ERM) proteins (at the rear) in polarized T cells after CXCL12 stimulation. This technique was also useful to observe the blocking effect on polarization of two different elements: inhibition of actin polymerization by a pharmacological inhibitor and expression of mutants of the Par6/atypical PKC signaling pathway. Thus, evidence is shown that this technique is useful to analyze both morphological alterations and protein redistributions.

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

케모카인 시그널링에 의해 유도 된 세포 및 분자 양극화의 신속하고 강력한 분석

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target protein. Due to its several advantages over monoclonal antibodies, aptamer development has gained enormous popularity among cancer researchers. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) is the most common method of developing aptamers specific for proteins of interest. Following SELEX, a quick and efficient binding assay accelerates the process of identification, confirming the selectivity and specificity of the aptamer. 
This paper explains a step-by-step flow cytometric-based binding assay of an aptamer specific for epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM). The transmembrane glycoprotein EpCAM is overexpressed in most carcinomas and plays roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Therefore, it is a valuable candidate for targeted drug delivery to tumors. To evaluate the selectivity and specificity of the aptamer to the membrane-bound EpCAM, EpCAM-positive and -negative cells are required. Additionally, a non-binding EpCAM aptamer with a similar length and 2-dimensional (2D) structure to the EpCAM-binding aptamer is required. The binding assay includes different buffers (blocking buffer, wash buffer, incubation buffer, and FACS buffer) and incubation steps. 
The aptamer is incubated with the cell lines. Following the incubation and washing steps, the cells will be evaluated using a sensitive flow cytometry assay. Analysis of the results shows the binding of the EpCAM-specific aptamer to EpCAM-positive cells and not the EpCAM-negative cells. In EpCAM-positive cells, this is depicted as a band shift in the binding of the EpCAM aptamer to the right compared to the non-binding aptamer control. In EpCAM-negative cells, the corresponding bands of EpCAM-binding and -non-binding aptamers overlap. This demonstrates the selectivity and specificity of the EpCAM aptamer. While this protocol is focused on the EpCAM aptamer, the protocol is applicable to other published aptamers.

A necessary step in anticancer aptamer development is to test its binding to the target. We demonstrate a flow cytometric-based assay to study this binding, emphasizing the importance of including a negative control aptamer and cancer cells that are positive or negative for that particular protein.&#160;

항암 압타머의 선택성 및 특이성을 평가하기 위한 유세포분석 기반 세포 표면 단백질 결합 분석

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

암 연구학

High-Content Screening Assay for the Identification of Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Modifying Compounds

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells expressing the epidermal growth factor receptor HER2 can be targeted by the anti-HER-2 antibody trastuzumab. Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) is an important mechanism implicated in the antitumor action of HER-2. Trastuzumab bound to cancer cells can be recognized by the Fc receptors of ADCC effector cells (e.g., natural killer (NK) cells, macrophages, and granulocytes), triggering the cytotoxic activity of these immune cells leading to cancer cell death. We set out to develop an image-based assay for the quantification of ADCC to identify novel ADCC modulator compounds by high-content screening. In the assay, HER2 overexpressing JIMT-1 breast cancer cells are co-cultured with NK-92 cells in the presence of trastuzumab, and target cell death is quantified by automated microscopy and quantitative image analysis. Target cells are distinguished from effector cells based on their EGFP fluorescence. We show how compound libraries can be tested in the assay to identify ADCC modulator drugs. For this purpose, a compound library test plate was set up using randomly selected fine chemicals off the lab shelf. Three microtubule destabilizing compounds (colchicine, vincristine, podophyllotoxin) expected to interfere with NK cell migration and degranulation were also included in the test library. The test screen identified all three positive control compounds as hits proving the suitability of the method to identify ADCC-modifying drugs in a chemical library. With this assay, compound library screens can be performed to identify ADCC-enhancing compounds that could be used as adjuvant therapeutic agents for the treatment of patients receiving anticancer immunotherapies. In addition, the method can also be used to identify any undesirable ADCC-inhibiting side effects of therapeutic drugs taken by cancer patients for different indications.

This protocol presents an automated, image-based high-throughput technique to identify compounds modulating natural killer cell-mediated breast cancer cell killing in the presence of a therapeutic anti-HER-2 antibody.

항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include well-validated targets for therapeutic intervention. Discovery of lead compounds, including small synthetic molecules, that specifically inhibit the receptor&#39;s function, is an important initial step in drug development and relies on sensitive, specific, and robust cell-based assays. Here, we describe a kinetic cellular assay with a fluorescent readout primarily designed to identify receptor-specific antagonists that inhibit the intracellular Ca2+ release evoked upon the activation of the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) by its endogenous ligand, the CXC chemokine ligand 12 (CXCL12). A key advantage of this method is that it also enables screening of compounds endowed with intrinsic agonistic properties (i.e., compounds eliciting an increase in intracellular Ca2+ concentration in the absence of CXCL12) or compounds modulating the receptor&#39;s function via interaction with allosteric binding sites (i.e., positive and negative allosteric modulators (PAMs and NAMs, respectively)). On the down side, autofluorescent compounds might interfere with the assay&#39;s readout, thereby hampering reliable data interpretation. Most likely this assay can be implemented, with minimal adaptations, as a generic drug discovery assay for many other GPCRs of which the activation leads to a release of intracellular Ca2+.

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

The described cellular assay is designed for the identification of CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interacting agents that inhibit or stimulate, either competitively or allosterically, the intracellular Ca2+ release initiated by CXCR4 activation.

운동 형광 기반 Ca2 + 동원 분석 결과 G 단백질 결합 된 수용 체 주 작동 근, 길 항 근, 그리고 Allosteric 변조기를 식별 하

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

의학

인간 호중구에서 β2 Integrin Activation Inhibitors의 스크리닝

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

저자 스포트라이트: β2 Integrin 활성화의 소분자 길항제를 식별하는 방법 개발 

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.

CXC Chemokine 수용 체 4에 붙일 레이블 CXC Chemokine Ligand 12의 바인딩 중단 하는 화합물을 식별 하는 흐름 Cytometry 기반 시험

요약

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이 비디오의 챕터

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

케모카인 시그널링에 의해 유도 된 세포 및 분자 양극화의 신속하고 강력한 분석

항암 압타머의 선택성 및 특이성을 평가하기 위한 유세포분석 기반 세포 표면 단백질 결합 분석

항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

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인테그린 억제 약물 스크리닝을 위한 유세포 분석 기반 고처리량 기법

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