저자는 크게 피에르 Bourdoncle, 토마스 길버트와 코친 이미징 시설의 루이스 Rimbault을 인정합니다. 이 작품은 INSERM, CNRS와 리그 국립 contre 르 암 (퀴프의 labellisée)에 의해 지원되었다.

T 림프구의 1. 준비 <ol><li> 10, 11 설명 된대로 기본 마우스 또는 인간 T 세포를 준비합니다. </li><li> 3 × 106 세포 / ml - (2)의 농도에서 10 % 인간 AB 혈청 완전한 RPMI 배지에서 인간 T 세포를 배양. 주 : 배양 인간 T 세포의 많은 부분의 자발 분극을 유도 할 수 소 태아 혈청 (FCS) 대신에 인간 혈청을 사용. 이 기간 동안 언제든지 5 일 추가로 과정을 - 4 문화에서 이러한 세포를 보관하십시오. </li><li> 유사한 세포 밀도로 10 % FCS가 보충 된 완전 RPMI 배지에서 마우스 T 세포를 유지한다. 10 NG / ㎖ IL7의 존재하에 37 ℃에서 즉시 또는 다음 날, O / N에서 배양 한 후 사용한다. </li><li> 완전한 RPMI 10 % FCS로 보충 된 CEM 인간 T 세포주를 배양. </li></ol> 2. 케모카인 자극 <ol><li> 10 mM의 Hepe 보충 따뜻한 HBSS 매체에 실험 조건 당 5 × 10 5 세포를 씻으의. 몇 가지 실험을 위해, 2 μg의 pmaxGFP 8 μg의 한 pcDNA3.1 + (빈 벡터 제어), 죽은 PKCζ 키나아제, 또는 N- 말단 Par6 플라스미드로 전날 차 인간 T 세포를 공동 형질. </li><li> 따뜻한 HBSS - 헤 페스 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁 (실험 조건 0.3 ㎖의 X 번호를 사용). </li><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포를 배포합니다. 주 : 따라서 단일 실험 조건에 대응 한 튜브를 0.3 ㎖의 HBSS - 헤 페스 매체에 5 × 105 세포를 포함 할 것이다. 일부 실험에서, 500 nM의 Latrunculin 또는 비히클 (DMSO)를 첨가하고, 케모카인 자극 전에 30 분 동안 세포를 배양한다. </li><li> 각 튜브에 10 NG / ㎖의 CCL19 또는 CXCL12 케모카인 (500)에 추가합니다. 참고 : 우리는 보통 10 사용 - 인간 T 세포에 대한 200 NG / ml의 케모카인을. CEM 세포는 CCL19 결합 CCR7 수용체를 발현하지 않습니다. 따라서, CEM 세포 만 CXCL12 자극에 응답 할 수있다. 500 N - 또한, 높은 케모카인 농도 ((300)를 사용하여g / ml)를 마우스 T 세포를 편광 시키. </li><li> 튜브를 수회 뒤집고 각각 일차 T 세포 또는 CEM을 8 또는 10 분 동안 37 ° C까지 수조에서이를 부화. </li><li> 각 튜브에 2 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 PBS의 10 mM의 Hepes를 함유 따뜻한 용액 0.3 ㎖를 첨가하여 분극 처리를 중지. 튜브를 뒤집어 5 분 동안 37 ° C에서 그들을 부화. </li></ol> 3. 염색과 <ol><li> 튜브 유동 세포 계측법하기 위해 마이크로 원심 튜브에서 세포를 전송합니다. </li><li> 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.5 mM의 EDTA PBS 및 10 mM의 Hepes를 함유 RT 용액으로 완전히 관을 채운다. </li><li> 4 분 동안 460 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 PBS에서 5 % FCS를 함유 RT 용액 100 ㎕에 세포를 재현 탁. </li><li> 멀리 빛, 소용돌이를, 각 튜브에 FITC-항 HLA-ABC의 5 μl를 추가하고, 실온에서 30 분 동안 그들을 품어. </li><li> , PBS 5 %를 FCS를 함유 한 번 세포를 씻으한 번만 PBS와 ND. </li><li> RT에서 : 다음 1 % BSA, 0.5 mM의 EDTA와 PBS에서 10 mM의 HEPES를 포함하는 용액으로 세포를 씻어 10 분 동안 품어, 500 ㎕의 1 % PFA를 추가합니다. </li><li> 상층 액을 버리고 PBS는 0.2 % BSA, 0.1 % 사포닌, 0.5 mM의 EDTA 10 mM의 헤 페스 (투과성으로 버퍼)를 포함하는 용액으로 완전히 튜브를 입력합니다. </li><li> 이 매체에 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 배지를 제거하고 세포 펠릿을 해리하도록 와류 튜브 플립. </li><li> 각각의 튜브에 방지 P-ERM 항체의 100 희석, 소용돌이를하고 실온에서 30 분 동안 품어 : 및 / 또는 1 0.25 ㎍ / ㎖의 TRITC-Phalloidin의를 추가합니다. </li><li> 투과성으로 버퍼와 세포를 씻으십시오. 형광 이차 항체로 인큐베이션 필요한 경우. </li><li> 200 μl의 PBS에 세포를 재현 탁하고 마이크로 원심 튜브로 전송. 참고 : 세포는 획득을위한 준비가되어 있습니다. 튜브에 200 μL의 최대 총 부피를 유지하면서 선택적으로, 최종 1 %로 농축시켜 추가 PFA세포는 추가 처리를 위해 당일 사용되지 않아야하는 경우, 순서의 염색 농도를 유지한다. </li></ol> 4. 이미지 수집 및 분석 <ol><li> 장치 (특정 시약 / 장비의 표 참조)로 전환하고 제조업체의 지침에 따라 자체를 교정 할 수 있습니다. 참고 : INSPIRE 소프트웨어는 40 배 목표 (0.75 NA)로 사용되었다. IDEAS 3.0 소프트웨어는 모든보고 정량화에 사용되었다. </li><li> 미래의 실험 템플릿에 저장할 수 있습니다 획득 일련의 창을 준비합니다. RMS 그라데이션 값을 정량화 히스토그램을 그립니다. RMS 그라데이션 막대 그래프에서 선택한 &quot;초점에서&quot;인구에서, 지역의 히스토그램에서 &quot;단일 셀&quot;인구 경계를 정하다. 마이크로 원심 튜브가 기기에 삽입되면, 각 셀에 대한 게이트 레이저 파워를 조정하고 5000 T 림프구를 취득. </li><li> 부드러운 아이디어도자기, 인수 파일을 열고 각 셀에 대해 얻은 밝은 필드 이미지의 그라데이션 RMS 값의 값을 표시하는 막대 그래프 (채널 1)을 만듭니다. 57 위의 RMS에게 그라데이션 값을 나타내는 세포를 고려 RMS 그라데이션 히스토그램에 게이트를 그립니다. 참고 : RMS 구배 분석 초점면에있는 경우에만 T 림프구에서 고려 허용합니다. 우리는 (57)에 우수한 그라데이션 RMS 값을 나타내는 각각의 세포는 초점면에 있고, 정확하게 고려 될 수 있음을 경험적으로 결정했다. </li><li> 분석 / 마스크 메뉴에서, 2 픽셀의 침식 시야 이미지 M01,의 형태 마스크에서 (M01,2)을 침식라는 새로운 마스크를 만들 수 있습니다. 그런 다음, 분석 / 침식 (M01,2) 마스크 계산 영역의 새로운 기능을 만들 메뉴를 갖추고 있습니다. 게이트 이전에 선택된 셀로부터,이 새로 만든 마스크를 이용하여 상기 셀 영역을 나타내는 히스토그램을 연다. 참고 :에 의해 사용할 수있는 형태의 마스크디폴트는 셀의 실제 크기보다 훨씬 더 크다. 따라서,이 화소로까지 침식 더 정확하다. </li><li> 교정 구슬과 이물질 (작은 지역)과 이중선 (대형 지역)을 제외한 개별 T 세포에 게이트를 그립니다. 각 인수에서이 게이트를 조정합니다. 주 : 셀 크기에 변동이 게이트의 위치에 영향을 미칠 것이다. 마우스 T 세포가 스스로 CEM 세포보다 작은 인간 T 세포보다 작은 같이, 각 세포 유형의 면적의 크기에 비례한다. </li><li> 이전 단계에서 게이트 된 하나에 초점 세포를 감안하면, 팔로이 딘의 원시 최대 픽셀의 함수로 HLA-ABC 염색에 원시 최대 픽셀의 (채널 2, X 축)로 구성되는 점 음모를 엽니 다 염색 (채널 4, Y 축). 흠 또는 포화 형광 이벤트를 제외 게이트를 만듭니다. 원시 최대 HLA-ABC를위한 픽셀 (채널 2) 팔로이 딘 (채널 4)의 염색을 보여주는 열기 두 히스토그램. </li><li> 분석 / 마스크 메뉴, CREAT에서2 픽셀의 침식 HLA-ABC 염색 된 세포 (채널 2)의 형태 마스크에서 (M02,2)을 침식라는 개 새로운 마스크. 그런 다음, 분석 / 침식 (M02,2)에 계산 된 원형 매개 변수로 구성된 새로운 기능을 생성, 메뉴 특징. 참고 :이 매개 변수는 원에서 셀 모양의 편차를 측정합니다. 따라서, 완전한 원형 T 세포는 낮은 원형도 지수를 나타낼 것이다 편광 신장 세포 반면 높은 원형도 값을 가질 것이다. </li><li> 이어서, 이전 셀로부터 게이트 된 원형 형상의 값을보고 다른 히스토그램을 생성한다. 직접 각각의 개별 셀에 대한 원형도 값에 따라 개인 합초 세포군의 분포를 플롯이 히스토그램을 사용한다. </li><li> 비 - 자극 된 세포에 대한 히스토그램의 형상을 살펴보면, 원형 제한값까지 낮은 원형도 값에서 시작하여, 편광 된 셀을 그리 게이트 여기서 비 자극 된 세포의 대부분플롯됩니다. 게이트 인구 중 편광 세포의 비율에 대한 통계의 디스플레이를 확인합니다 (%는 정문). 참고 : 우리는 13 아래 원형 인덱스 값이 게이트를 설정했습니다. </li><li> 세포에서 액틴 염색 편광보고하기 위하여, HLA-ABC 염색 (채널 2) 및 팔로이 딘 염색을 비교 밝은 세부 비슷한 R3 값에 대한 히스토그램을 플롯 (채널 4). 주 :이 기능의 더 큰 값이 더 적 착색 개의 중첩이다. </li><li> 이전과 같은 게이팅 전략을 사용하여, 편광 액틴 염색 세포의 백분율을 나타낸다 분리 염색 비 자극 된 세포에 게이트 플롯. </li><li> 완료되면, MHC 클래스 I 및 팔로이 딘 염색에 함께 SD ± 모든 세포의 원형과 비슷한 인덱스의 평균값으로 편광 된 세포의 비율의 분포에 편석을 나타내는 세포의 비율은 corresp에 나타낸다onding 통계 패널. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.

계측법, 신속하고 유익한 게이팅 전략 케모카인 자극에 의​​해 유도 된 세포 및 분자 이벤트를 분석하는 촬상 흐름의 최신 기술을 사용하는 것이 제시된다. 케모카인 자극 분극 공정 동안 서로 다른 단백질의 세포 내 분포에 의해 유도 된 세포 형태의 변화 : 하나의 실험에서, 하나는 정보의 두 가지 유형을 얻을 수있다. 흥미로운 증거가 통계적 견고성과 전체 세포 집단의 작은 부분의 분석이 ?...

케모카인 전문 위치 1에 세포를 유치 작은 수용성 단백질이다. 따라서, 그들은 조직에서 세포의 정확한 위치, 개발 및 생리에 중요한 기능에 참여하고 있습니다. 이 효과적인 면역 반응을 탑재 콘서트 행동 많은 다른 종류의 세포의 작용에 의존으로 면역 시스템은이 규칙에 예외는 아닙니다. 외부 항원이 검출 중화되기 전에 주어진 상태에서 하나의 면역 세포 유형의 특정 위치를 제어함으로써, 케모카인 장치들이 필요하다. 특히 T 림프구에서, 케모카인은 T 세포 운동성 2,3- 호의 결합시, 다양한 세포 내 신호를 유도하는, 특정한 표면 수용체 (칼슘 증가, ERK 인산화의 Rho GTP 아제 활성, 인테그린 친화 세포 골격 변화의 증가)에 결합한다. 세포 수준에서, 하나는 케모카인 유도 자극에 형태 학적 변화를 관찰 할 수있다.세포 모양에서 이러한 변화는 T 세포에서 특히 극적 : 혈류에 여행 할 때 휴식 T 세포가 구슬처럼 둥근 형태를 가지고있다. 앞에 리딩 에지​​ : 그러나, 염증 부위에 또는 림프 기관의 근방에서 케모카인의 존재를 감지 해주기 양극성 형태로 이루어진 전형적인 &quot;핸드 미러&quot;형태를 채택하는 T 세포의 모양을 변경하려고 그리고 다시 4에서 트레일 링 에지, 또는 uropod. 또한, 균체 내 성분은 마이그레이션을 유지 편광 T 세포의 두 대향하는 영역으로 분리 할 수​​있다. 예를 들면, 케모카인 자극 5 및 액틴 중합시 액틴 필라멘트 중합 증가 편광 된 T 세포 (2)의 전방에 축적한다. 한편, 이러한 피질 F 액틴 세포 골격에 세포막 링크 Ezrin-Radixin-Moesin (ERM)과 가족의 인산화 된 단백질과 같은 여러 가지 단백질의 편광 uropod에 다시 문 지역화T 세포 (6). 흥미롭게도, 우리 등이 분극 처리는 T 세포의 이주를 위해 필요하다는 것을 보여 주었다. 실제로, 편광을 방해하는 어떤 치료는 세포의 운동성을 억제합니다. 예를 들어, 비정형 단백질 구성원의 활성의 억제는 C (PKC) 계열, 및 PKCζ PKCι 블록 T 세포와 수지상 세포 편광 7들의 이동성 스캔 과정 키나아제. T 세포 분극도의 Rho GTP 아제에 의해 조절된다. 우리는 최근에 기재된 Fam65b에서 RhoA 의한 단백질 활성의 조절이없이 Transwell 분석 6 마이그레이션 T 세포 형태의 변화 및 능력을 방해 것을 보여 주었다. 편광 세포 운동성위한 필수 단계로서, 케모카인은 응답의 메인 리드로 정량화 할 수있는 것이 결정적으로 중요하다. 세포 모양의 변화는 이전에 수동으로 8 측정 하였다. 그러나, 이러한 종류의 정량은 매우 시간 소모적이며, 그 보통 몇 그래서세포의 수만 고려된다. 여기서, 새로운 방법이 급속 케모카인 자극에 노출 된 T 림프구의 형상 변화의 정도를 정량화하기 위해 제시된다. 기술 계측법 촬상 유동은 케 모킨 자극 상이한 조건에서 효율적으로 편광 된 세포의 양을 정량화하는 유세포 및 현미경 (9)의 이점을 결합하는 데 사용된다 (특정 시약 / 장비의 도표 참조). 하나의 기술이 견고하게 측정 할 수있는 형태 학적 변화의 정량화에 또한, 케모카인 시그널링시 일부 단백질의 세포 내 위치 변화를 평가하는 것도 가능하다.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Human serum AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Human T cell nucleofactor kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8-100</td><td>This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-HLA-ABC antibody</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>clone B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream&lt;sup&gt;x&lt;/sup&gt; Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid and robust analysis of cellular and molecular polarization induced by chemokine signaling

세포는 과정이라고 편광 자신의 원형을 잃고으로 많은 단백질의 세포 내 현지화를 변경하여 자극을 케모카인에 응답합니다. 고전 이미징 기술은 이러한 현상을 연구하는데 사용되어왔다. 그러나 이러한 형태 및 세포의 수만 염색 공동 지역화 시간 소모적 정량화 하였다 많은​​ 세포의 수동 요구를 취득. 여기서, 신속하고 강력한 방법은 사이토의 것과 현미경의 장점을 결합한 기술 계측법 촬상 흐름을 이용하여 상기 셀 수천 이루어진 샘플들에 이러한 현상을 연구하기 위해 설명된다. MHC 클래스 I 분자와 사상 액틴 용 CCL19 염색 자극 T 림프구를 사용하여, 게이팅 전략 동시에 형상 변화의 정도 및 CCL19 시그널링에 의해 영향 마커의 공동 국산화 정도를 측정하기 위해 제공된다. 또한,이 게이팅 전략은 observ 우리를 허용전자 CXCL12 자극 후 편광 T 세포 (전면) 사상 액틴과 (후면) 인산화 Ezrin-Radixin-Moesin (포스 ERM) 단백질의 분리. Par6 / 비정형 PKC 신호 전달 경로의 돌연변이 발현 억제제 및 약리학 적으로 액틴 중합 억제제 등이 기술은 두 개의 서로 다른 편광 소자에 차단 효과를 관찰하는데 유용 하였다. 따라서, 증거는이 기술은 단백질의 형태 학적 변화 및 ​​재분배 모두를 분석하는 유용한 것을 알 수있다.

여기에서 선택된 첫 번째 예 CCL19 자극 인간 차 T 림프구의 용도에 관한 것이다. 그러나 동일한 전략은 기본 마우스 T 세포, T 세포 라인 또는 케모카인 자극에 응답하여 임의의 다른 세포 유형과 함께 사용될 수있다. 여기에 제시된 게이팅 전략 포커스 이벤트 후, 단일 세포를 선택하는 일련의 윈도우를 포함한다. (그림 1) 또는 CCL19 자극 (그림 2) T 림프구 휴식의 MHC 클래스 I...

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Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

케모카인 시그널링에 의해 유도 된 세포 및 분자 양극화의 신속하고 강력한 분석

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

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Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

연구

면역학 및 감염병학

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

생체공학

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

셀 마이그레이션 연구에서 수직 화학 산소 그라디언트에 대한 폴리 디메틸 실록산 - 폴리 카보네이트 미세 유체 장치

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

생물학

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

ECIS / 택시와 셀룰러 Chemotaxis 측정

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Ex Vivo 트랜스이민 시스템에서 림프구 마이그레이션 평가

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a chemical. Chemokinesis and chemotaxis are fundamental for the mobilization and deployment of immune cells. For example, chemokines (chemotactic cytokines) can rapidly recruit circulating neutrophils and monocytes to extravascular sites of inflammation. Chemoattractant receptors belong to the large family of G protein-coupled receptors. How chemoattractant (i.e., ligand) gradients direct cell migration via G protein-coupled receptor signaling is not yet fully understood. In the field of immunology, neutrophils are popular model cells for studying chemotaxis in vitro. Here we describe a real-time two-dimensional (2D) chemotaxis assay tailored for mouse resident macrophages, which have traditionally been more difficult to study. Macrophages move at a slow pace of ~1 &#181;m/min on a 2D surface and are less well suited for point-source migration assays (e.g., migration towards the tip of a micropipette filled with chemoattractant) than neutrophils or Dictyostelium discoideum, which move an order of magnitude faster. Widely used Transwell assays are useful for studying the chemotactic activity of different substances, but do not provide information on cell morphology, velocity, or chemotactic navigation. Here we describe a time-lapse microscopy-based macrophage chemotaxis assay that allows quantification of cell velocity and chemotactic efficiency and provides a platform to delineate the transducers, signal pathways, and effectors of chemotaxis.

Here we describe methods using time-lapse, phase-contrast microscopy to image mouse resident peritoneal macrophages in a chemotactic complement C5a gradient. The protocols can be extended to other immune cells.

마우스 대식세포 화학의 시간 경과 화상 진찰

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...