Name: imaging mycobacterium tuberculosis in mice with reporter enzyme fluorescence
Uploaded: 2018-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence at JoVE.com

동물 연구 지침 및 규정에 명시 된 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 텍사스 A & M 대학에 의해 수행 되었다. 검토 및 생물 안전 요원 또는 위원회에서 승인이 필요할 수 있습니다.
주의: 모든 절차 BSL3 포함을 해야합니다. 직원은 항상 개인 보호 장비를 착용 해야 합니다. 모든 조작은 Biosafety 내각 (BSC) 안에 수행 되 고 모든 sharps sharps 용기에 삭제 됩니다. 작업을 시작 하기 전에, 작업 후 작업 표면 및 BSC 버퍼링 된 페 놀 및 70% 에탄올으로 청소 됩니다. 절차는 일반적으로 결핵균, biosafety 수준 3에서 할 것 이라고 하지만 일러스트 레이 션 및 촬영 목적에 대 한 저자 덜 악성 박테리아와 biosafety 수준 2에서이 절차를 보여.
1. 긴장 조건 문화
참고: M. 결핵 변형 CDC1551는이 연구에 사용 되지만 어떤 M. 결핵 긴장 든 지 같은 방식으로 사용할 수 있습니다.
<ol><li>M-OADC-TW에 박테리아를 성장 (7 H 9 국물 0.5% 글리세롤, catalase, 없이 복잡 한 10% 올레산 포도 당 0.05와 보충 트윈-80%) 0.5 세600 를 37 ° C에 중간 서 (~ 0.2 x 107 CFU).</li>
	<li>M-OADC-TW에 문화를 희석 (1시 10분의 시리즈는 박테리아의 희석). 접시는 박테리아의 희석 (105, 106, 107, 108) CFU의 수 있도록 선택적 7 H 11 접시에 3 중에.</li>
	<li>37 ° C에 또는 식민지 정확 하 게 계산 될 수 있는 때까지 4 주에 대 한 번호판을 품 어.</li>
	<li>8,534 x g는 펠 렛을 얻기 위해 5 분 동안에 세균성 inoculum 원심 한 번 식 염 수 10 mL와 펠 릿을 세척 (0.9 %NaCl) 염 분의 15 mL에 펠 릿을 다시 중단 (0.9 %NaCl).</li>
</ol>2.에 어로 졸 감염 매디슨 챔버를 사용 하 여 마우스의
<ol><li>1 주일에 대 한 새로운 환경에 적응 하는 쥐를 수 있습니다.</li>
	<li>챔버에 그들을 로드 하기 전에 마우스 무게.</li>
	<li>3 코드 전원 스트립에 연결: 메인 챔버 전원, 진공 펌프와 공기 압축기를 순서 대로.</li>
	<li>유리 용기는 조심 스럽게 나사. 유리 항아리 biosafety 내각에 고 염 분의 15 mL에 도전 inoculum을 추가 (0.9 %NaCl) 달성 하기 ~ 104 -106 CFU 폐에 박테리아의.</li>
	<li>Biosafety 내각에서 유리 항아리의 뚜껑을 닫습니다. 분무기 단위에 항아리를 연결 하 고 (입구) 하단은 항아리에서 액체의 수준 아래 인치의 4 분의 1에 대 한 수직 스테인리스 튜브를 조정.</li>
	<li>챔버로 (챔버는 최대 90 마우스를 수용할 수) 실험에 필요한 모든 동물을 로드 하 고 문을 모든 래치를 닫습니다.</li>
	<li>메인 (룸) 확인 공기 흐름 미터. (공) 부동의 센터 약 50 L/분으로 왼쪽에 규모 측정 실행 확인 하십시오.</li>
	<li>챔버의 제어판에서 시작 단추를 누릅니다. 규모에 4 L/min으로 압축기 공기 흐름 미터 (왼쪽에 작은 미터)를 통해 공기 흐름 속도 설정 합니다. 시각적으로 도전 inoculum는 되 고 nebulized 되도록 확인 합니다.</li>
	<li>15 분 후 제어판의 앞에 빨간 불이 나타나고 음성 신호는 실행의 끝을 나타냅니다 때 타이머를 다시 설정 하려면 제어판의 오른쪽 아래 모서리에 리셋 버튼을 누릅니다.</li>
	<li>출시 진공 챔버의 문에 작은 빨간 버튼을 누른.</li>
	<li>약 실 문 열고 동물을 제거 합니다. 다시 그들의 감 금 소에는 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>유리 분무기 단지를 제거 하 고, 누설 방지 운송 컨테이너에 배치. 생물 안전 캐비닛 내부의 컨테이너를 놓고 지정된 폐기물 컨테이너에 도전 정지를 삭제.</li>
	<li>생물 학적 가방 안에 사용된 분무기 단지를 놓고는 압력솥에 수송을 위한 부 대를 밀봉 합니다.</li>
	<li>감염 프로시저의 끝에, 버퍼링 된 페 놀 및 70% 에탄올과 챔버의 내부를 스프레이 하 고 10 분 동안 앉아 챔버를 허용 합니다.</li>
	<li>그런 다음 모든 액세스할 수 있는 내부 표면 아래로 매우 철저 하 게 닦아. 모든 오염 된 종이 타 올, 등의 처분. 생물 학적 쓰레기. 압력솥에서 쓰레기 컨테이너를 낭비 하 고 분무기 항아리를 사용.</li>
	<li>영상 시간 포인트까지 제약 실에서 다시 동물을 놓습니다.</li>
	<li>이미징의 날, 이미징 방에 보조 용기에 동물을 전송 합니다.</li>
</ol>3. 동물 마 취
<ol><li>쥐와 isoflurane 사용자 정의 가스 마 취 시스템을 사용 하 여 anesthetize.</li>
	<li>각 마 취 단위 위에 있는 두 개의 숯 필터 용기 무게.</li>
	<li>무게는 초기 무게 위에 50 g 경우 새로운 용기를 바꿉니다.</li>
	<li>절차에 대 한 충분 한 isoflurane 되도록 기화 장치를 확인 하십시오.</li>
	<li>챔버 내부에 이미징 코 콘 홀더를 배치 합니다. 코 콘 절차에 필요한 수 놓고 코 콘 차단제와 나머지 오프닝을 밀봉 합니다.</li>
	<li>고압 실린더에서 산소 공급을 켭니다 고 55 psi에 그것을 설정 합니다.</li>
	<li>마 취 단위 있는 피난 펌프를 켜고 8 L/min으로 설정.</li>
	<li>마 취 단위 있는 산소 토글 설정.</li>
	<li>마 취 유도 실 1.5 L/분 차례에 가스의 흐름 가스 흐름을 설정 하에 가스 흐름을 켭니다.</li>
	<li>가스 흐름 0.25 L/분 차례에 가스의 흐름 가스 흐름을 설정 하려면 이미징 챔버를 켭니다.</li>
	<li>켜고 isoflurane 기화 기 2-2.5%에 설정 합니다. 수와 isoflurane 기화 (~ 20 g의 무게는 마우스에 대 한 2-2.5%, 무게 300 g 기니 피그에 대 한 4%)에 다이얼을 회전 하 여 실험을 위해 사용 되는 동물의 무게에 따라 isoflurane 수준을 조정 합니다.</li>
	<li>마 취 약 실에 쥐를 놓고 뚜껑을 닫습니다. 마 취 유도 약 실에 가스 흐름을 켭니다.</li>
	<li>5-10 분까지 완전히 마 취 마 취 유도 실에서 쥐를 둡니다.</li>
	<li>일단 쥐 취는 이미징 동안 그들을 보호 하기 위해 눈에 광 연 고를 적용.</li>
	<li>그들의 코는 이미징 절차 동안 쥐의 마 취를 촉진 하기 위하여 원뿔에 배치 되도록 복 부 또는 sternal recumbency에 쥐를 놓습니다.</li>
</ol>4. 기자 효소 형광 (REF) 이미징
<ol><li>주사는 감염으로 복 주입 제어 마우스에 의해 기판 (20 µ M, 무게의 2.5 µ L/g). 쥐 1 분 미만 대 한 이미징 챔버 내부 마 취 받고 있다.</li>
	<li>이미징 시스템을 시작 합니다.</li>
	<li>초기화를 클릭 하 여 시스템을 초기화 합니다. 온도 바 녹색으로 바뀝니다 때까지 기다립니다. 참고: 이미징 챔버 이미징 동안 동물의 체온을 유지 하기 위해 온수 플랫폼으로 구성 됩니다.</li>
	<li>영상 수집 설정, 형광을 선택 | 전체 동물에 대 한 트랜스-조명 또는 폐 조직에 대 한 피 조명 수집 컨트롤 패널에서 오버레이 및 구조.</li>
	<li>단일 마우스 및 램프 수준 높은 b 보기의 필드를 설정 합니다.</li>
	<li>780에서 자동, 중간 binning, 2-3 f/정지, 그리고 여기 745 nm 및 방출 필터에 필터에 대 한 노출 시간을 설정 840 nm nm.</li>
	<li>시퀀스 설정에 대 한 시퀀스 설정 클릭, 폐 지역에서 9-12 트랜스 조명 포인트를 선택 합니다.</li>
	<li>이미지 수집에 대 한 취득을 클릭 합니다.</li>
	<li>케이지 후 이미징에 다시 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>완전히 복구 될 때까지 마우스를 모니터링 하거나 실험의 시간 포인트에서 이미징 하는 경우 CFU 측정을 위해 희생. 수정된 Karnofsky 점수 후 이미징 쥐의 모니터링을 수행 합니다.</li>
</ol>5입니다. REF 이미징 분석
<ol><li>이미징 소프트웨어를 엽니다.</li>
	<li>찾아보기 아이콘을 클릭 하 여 이미지 파일을 로드 합니다.</li>
	<li>스펙트럼 unmixing 스펙트럼 Unmixing 도구 팔레트에서 클릭을 unmix 하는 데 필요한 스펙트럼을 클릭 합니다. 시작 unmixing 클릭 하십시오.</li>
	<li>광학 표면 재건에 대 한 표면 지형 클릭.</li>
	<li>에 등, 모피 마우스 따라를 선택 하 고, 표면 생성을 클릭 합니다.</li>
	<li>이미지 자르기 그리고 관심 영역에 대 한 임계값 이미지를 설정 합니다. 완료를 클릭 합니다.</li>
	<li>장기 등록에 대 한 3 차원 광학 도구 드롭다운 메뉴에서 등록 탭으로 이동 합니다.</li>
	<li>등록 기관 아틀라스의 장기.</li>
	<li>기관 크기 또는 패널 등록 도구에 있는 온/오프 변환 도구를 사용 하 여 생성 된 표면 지형에 위치를 조정 합니다.</li>
	<li>형광 단층 (휙) 3D 재구성, 이동한 선택 분석 탭 선택 이미지 분석에 대 한 포함 될, 이미지 전송 형광 정규화 (NTF) 효율성을 종류, 시작을 클릭 합니다.</li>
	<li>모든 선택에 확인 하 고 데이터 미리 보기 탭에서 재구성.</li>
	<li>형광 정량화에 대 한 관심의 기관에 투자 수익 큐브 관심 영역 (ROI) 도구를 추가 하 고 관심의 장기를 큐브 크기 조정 이동 합니다. 클릭 3D ROIs를 측정.</li>
	<li>투자 수익 측정 창에서 3D ROI 측정 이동, pmolM-1c m-1을 소스 복 및 측정 단위를 데이터 형식을 선택 합니다.</li>
	<li>저장 하거나 날아다니는 3D 재구성 분석 결과 그림 또는 데이터 파일로 내보내기.</li>
</ol>6입니다. CFU로 박테리아의 정량화
<ol><li>0.1 mL pentobarbital 나트륨 (390 mg/mL)의 복 주입 하 여 쥐를 안락사.</li>
	<li>반사 반응이 있는지 확인 하는 쥐의 발 패드를 압박 하 여 페달 반사를 확인 합니다.</li>
	<li>소독 집게와가 위를 사용 하 여 마우스에서 폐 조직 explant 폐 조직 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 1 mL에 균질</li>
	<li>살 균 1 x PBS에서 폐 homogenate의 10 연속 희석을 확인 합니다.</li>
	<li>도금, 대 한 천 배지에서 20 µ L 각의 각각 희석의 3 aliquots 자리.</li>
	<li>세균성 성장 위한 37 ° C와 모니터 인큐베이터에 접시를 품 어.</li>
	<li>수 각 식민지 보육 시간 후 고 CFU로 표현 / mL 및 희석에 대 한 수정 하 여 다음 식을 사용 하 여: CFU / mL (C/V) = M x 어디 C 자리, V 당 식민지 카운트 = = 볼륨 샘플 각 접시 (mL), 및 M 주사 = 곱셈 요인 (희석 사용의 역). 참고: 경우 11 식민지 10-4의 샘플 희석에 0.002 mL의 샘플 볼륨에 대 한 한 자리에서 세 어진다, 방정식를 사용 하 여 식민지 수 산출 될 것 이다로 (11/0.02) x 104 = 5.5 x 106 CFU / mL</li>
</ol>

<ol>
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REF, 같은 이미징 기술을 사용 하 여 강력 하 고 일관 된 데이터의 생성을 허용 하는 주요 전략 있습니다. 광학 이미징 이후 모든 방향으로 방출 하는 빛을 포착 하기 어려운, 침투의 깊이 영향을 줄 수 있는 조직에 흩어져 빛을 생성 합니다. 사용 근처 적외선 fluorophore (NIR)의 REF 700-900 nm의 Querange에 여기 및 방출 하는 파장을 갖는 이미징에 대 한 기판 포유류 조직에 의해 형광 신호의 최소한의 흡수를 용이 하 게 한다. 사용자 정의 설계 기판 NIR fluorophore, IRDye 800Cw를 끄는에 연결 하 여 건설 되었다 IRDye QC-1, 형광 공명 에너지 전송 기반 냉각 허용 락탐 반지에 의해. IRDye 우수한 조직 침투는 빛 산란 특성 및 포유류36에 분명 어떤 유해한 효과 없습니다, 24 h 형광 혈액과 기관에서 허가 되 고 신호 크게 증가 시작 후 4 h 기판 관리, 관리 후 6 h 레벨 최대에 도달.
세균 감염 복용량, 감염 복용량과 기판의 관리 시간 게시물 감염 파일럿 연구를 수행 하 여 이미징의 포인트의 모드는 크고, 복잡 한, 실험에 착수 하기 전에 표준화 되어야 한다. 파일럿 연구 크게 줄일 수 시간 및 비용 표준 절차 주요 실험 하 고 이전에 최적화 될 수 있기 때문에 동물의 많은 수를 이미징 하는 경우. 세균 중 관심 몸 전체 이미징 트랜스 조명과 epi 조명 신호 소스를 확인 하 고 상관 관계의 품질을 결정을 사용 하 여 폐 이미징 비보 전 을 사용 하 여 다음의 기관/조직에 결정 되어야 한다 박테리아와 함께 현재8번호. 파일럿 연구는 탐지의 문 턱, 기술의 동적 범위 이미징에 대 한 최적의 실험 조건의 결정에 대 한 통찰력을 제공할 것입니다.
그것의 높은 감도 자연 M. 결핵 을 이미지 하는 능력으로 이미징 REF를 사용 하 여의 주요 장점은 다른 형광 및 발광 전략에 비해 긴장. REF 이미징 모든 M. 결핵 임상 격리 및 결핵-복잡 한 긴장에 보존 BlaC 촉매로 강력한 효소를 사용 합니다. REF 이미징의 큰 감도 촉매 그만큼 BlaC의 조합에 주인 세포에 의해 쪼개진된 형광 제품의 유지와 함께 예정 이다. 신호 지속적으로 증가 기판은 결과 감염 된 세포와 조직 내에서 신호의 거의 무한 한 빌드에 사용할 수 있습니다. 이미징 REF의이 증가 된 감도 이미징의 다른 방법에 비해 두 시험관에 M. 결핵 의 특정 검색 허용 한다 vivo에서8,,2324, 29.
REF 이미징 세균 검출 감염 모델, 어느 실험실 동물8,37 또는 인간의 임상 자료29,38 의 직접 응용 프로그램을 사용 하는 유전 수정 없이 사용할 수 있습니다. . REF는 fluorogenic 기판 kinases, 프로 테아 제, β-galactosidases, ureases, 등 BlaC 이외의 수많은 효소 목표를 위해 개발 될 수 있기 때문에 다양 한 병원 체39,40, 이미지를 감지 하 사용할 수 있습니다. 그러나, 주의 생각 있도록 대상에 주어져야 한다 그것은 이미징에 대 한 최적의 특성 표시 합니다. BlaC이이 전략의 성공적인 응용 프로그램을 보장 하는 특성에 대 한 좋은 모델 효소를 나타냅니다. REF 이미징 제공 즉시 읽어 폐에 존재 하는 세균 중에 감염, 시의 결핵 병, 세균성 수의 결심은 일반적으로 3 ~ 6 주, 필요로 하기 때문에 하지만 더에 크게 진행 속도 이 이렇게 훌륭한 제의로 저장할 것 이다 급속 한 성장 하는 생물 시간. REF는 carcinomas 결핵, 결 절 성 병 변 환자41,42의 진단에 중요 한 문제에서에서 차별 또한 사용 수 있습니다. REF 가속 변환 결핵 영상 소설 도구 역할 하 고 심지어 잠재적으로 치료 결과의 빠른 예측을 허용 하는 인 간에 게 적용할 수 있습니다.

M. 결핵 의 느린 성장 속도 결핵1,2,3의 신속한 진단에 주요 장애물입니다. 문화 기반 진단 소요 주 결과를, 반면 acid-fast 얼룩은 어린이5 와 인간 면역 결핍 바이러스6,7공동 감염 환자에서 진단 제한4 . 광학 이미징 기술은 최근 결핵8,9를 위한 전통적인 진단 방법의 대 안으로 인정 되었습니다. 형광 및 생물 발광 광학 실시간10,11,12,,1314, 살아있는 동물에 M. 결핵 의 이미지를 사용할 수 있습니다. 15,,1617,,1819. 광학 이미징 M. 결핵20,,2122감염의 신속 하 고 구체적인 평가의 이점이 있습니다.
우리는 REF를 사용 하 여 라이브 쥐에 M. 결핵 의 광학 이미징에 대 한 세부 정보를 설명 합니다. 이 방법은 매우 구체적이 고 민감한23,24 이며, 다른 광학 방법에 유사한 적은 결핵 (TB) 이미징25, 단층 촬영 (CT)26, 자석 등의 다른 방법 보다 비싼 공명 영상 (MRI)27, 그리고 F-fluorodeoxyglucose 양전자 방출 단층 촬영/CT (F FDG PET/CT)28. REF 세균성 효소에 의해 쪼개 짐에 따라 형광 제품8,29를 생산 하는 사용자 지정 형광 또는 발광 기질을 활용 합니다. 따라서, 재조합 mycobacterial 기자 스트레인30,31를 요구 하지 않기의 이점이 있다. 설명 무서 워 기판은는 형광 색소와 끄는 BlaC (β-lactamase), 자연스럽 게 결핵-복잡 한 진 균8, constitutively 표현에 의해 분해 되는 β 락탐 반지에 의해 연결 된로 구성 32. 박테리아는 직접 많은 크기 순서와 M. 결핵의 민감한 감지에 의해 증폭 수 REF 촉매 활동으로 인해 신호를 생성.
이 연구에 사용 된 REF 기판 생체에 우수한 조직 침투 있으며 감소의 긴 파장 때문에 배경. 이 긴 파장 기판으로 그것은 거의 100의 M. 결핵 에 대 한 탐지의 문 턱을 달성 하는 것 콜로 니 형성 단위 (CFU) 생체 외에서 그리고 < 쥐 vivo에서 (전체 동물)8, 폐에서 1000 CFU 33. REF가 래, 임상 자료와 환자 마이크로 내 시경 시스템16,32,,3334 그것의 높은 감도 및 특이성 때문에 직접 진단 도구로 사용할 수 있습니다. REF는 BlaC, 자연스럽 게 생산된 세균 효소를 사용 하 여 검색 모든 긴장에 때문에 어떤 결핵 임상 스트레인에 적용할 수 있습니다. 이러한 특성 pathogenesis의 분석 뿐만 아니라 REF 일반적 치료 촉진 하기 전 임상 결핵 연구에 유용한 도구를 이미징 및 백신 평가 하지만 또한 궁극적으로 결핵 진단에 적용할 수 있습니다. 환자입니다.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>CNIR800</td><td>Custom synthesized</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fatal Plus solution</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7H9 Middlebrook broth</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC Middlebrook enrichment</td><td>BD</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Sporcidin</td><td></td><td>RE-1284F</td><td></td></tr><tr><td>7H11 Middlebrook Agar</td><td>BD</td><td>212203</td><td></td></tr><tr><td>Madison Chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8-gas Anesthesia System</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging software</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transparent nose cones</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;M. tuberculosis&lt;/em&gt; strain CDC1551</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Female BALB/C mice, 5-7 weeks</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging mycobacterium tuberculosis in mice with reporter enzyme fluorescence

기자 효소 형광 (REF) 효소 이미징 또는 형광 또는 생물 발광에 의해 감지에 대 한 관심의 대상 생물에 존재에 대 한 관련 된 기질을 활용 합니다. 우리는 BlaC, constitutively 모든 M. 결핵 종자로 표현 하는 효소를 이용 한다. REF는 감염 된 쥐의 폐에 있는 박테리아의 급속 한 정량화를 허용 한다. 쥐의 동일한 그룹 많은 시간 포인트, 크게 비용 절감, 보다 신속 하 게 박테리아를 열거, 호스트 병원 체 상호 작용에 비 발한 관측을 허용 하 고 통계적 인 힘을 증가 하는 그룹 당 더 많은 동물을 쉽게 유지 됩니다 때문에 몇 군데 있습니다. . REF는 매우 BlaC 효소 기자의 촉매 특성으로 인해 과민 하 고 특정 사용자 지정 flourescence 공명 에너지 전달 (무서 워) 또는 fluorogenic 기판 사용. REF 필요 하지 않습니다 재조합 종자, 일반 호스트 병원 체 상호 작용을 보장. 800에서 최대한 방출 무서 워 기판 사용 M. 결핵 감염의 영상 설명 nm. 기판의 파장 포유동물에 중요 한 깊은 조직 이미지를 수 있습니다. 우리는 어로 졸 감염 M. 결핵, 쥐의 마 취, REF 기판, 광학 이미징의 관리와 쥐의 개요 것입니다. 이 방법은 호스트 병원 체 상호 작용 및 M. 결핵를 대상으로 하는 항생제의 효능 평가를 성공적으로 적용 되었습니다.

REF 감염된 제어 마우스 함께 M. 결핵 감염 쥐의 영상 그림 1A에 나와 있습니다. 감염 된 쥐 생성을 크게 (P = 0.0057) 높은 형광 신호 제어 기판 관리 시에 비해 감염 된 후 6 주에 폐에서. M. 결핵 REF를 사용 하 여에 대 한 치료 효능을 공부 하는 전형적인 시간 코스 1, 2, 4, 6, 15, 그 주에 이미징 수 24 후 감염. 형광 강도 피 조명 폐 조직 (그림 1B)에 대 한 사용 하 여 정량 이다. 감염 된 쥐의 폐에서 주 6 주 2에서에서 일관 되 게 증가 신호 REF 성공적으로 M. 결핵 vivo에서감지할 수 나왔다. 나중에 시간 (그림 1B) 컨트롤 마우스의 배경 신호에 한 방울 몸에 있는 증가에 표시 될 수 수 질량과의 여기 파장 침투를 줄여 6 주 동안 쥐의 볼륨. M. 결핵 감염 된 생쥐에서 형광 소스의 3D 날아다니는 재건은 그림 2A에 표시 됩니다. 이미지 시퀀스는 여러 개의 트랜스 조명 시점에 동일한 여기 및 방출 필터의 시리즈를 사용 하 여 마우스에 획득 됩니다. 이러한 이미지 시퀀스는 동물 주제 내에서 형광 소스 배포를 위한 3D 날아다니는 재건을 위해 사용 됩니다. 그림 2 A-D 마우스 단층 촬영 폐 기관 등록의 서로 다른 방향 (코로나, 화살 및 transaxial)을 보여 줍니다. NTF 효율 재건 품질 그림 2E에서 표시 됩니다 확인 하기 위해 매핑됩니다. NTF 중립 밀도 필터 캡처한 빼서 추가 이미지를 통해 트랜스 조명 이미지에서 배경 빛 누설 수 있습니다. 동일한 방출 필터와 오픈 여기 필터 (그림 2E-시뮬레이션)을 주고 측정 전송 이미지에 특정 여기 필터 (그림 2전자 측정)로 찍은 이미지 정규화 제작한 기판 혼자 신호입니다. 유사한 측정 및 시뮬레이션 NTF 효율 모두 수평 (그림 2F) 프로필과 거의 0% 비율 오류 (그림 2E % 오류)와 세로 (그림 2G) 프로필 감소 및 향상 된 신호 지역화 유물과 감도와 좋은 품질의 3 차원 재구성의 증거를 제공합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> 그림 1 . 참고로 M. 결핵 의 이미징 (A) vivo에서 이미지 마우스 감염 되지 않은 및 2, 4, 그리고 6 주 후 감염에 M. 결핵 감염의입니다. 색상 막대 낮은 (노란색)에서 높은 (레드) c m2 당 초당 광자에 형광 성 신호의 강도를 나타냅니다. (B) 마우스 M.결핵 감염에서 형광 강도의 정량화. 형광 두 컨트롤 (블랙)에 대 한 값을 하 고 감염된 (레드) 각 시간 지점에 대 한 표준 오류와 함께 표시 됩니다. 결과의 의미는 학생 t에 의해 결정 되었다-테스트, p 값의 < 0.05 중요 하 게 고려 했다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> 그림 2 . M.결핵 감염 된 생쥐에서 형광 소스의 3D 날아다니는 재건. 마우스 단층 촬영에서 서로 다른 방향으로; A) 화관, B) 화살, 및 C) transaxial D) 폐 기관 등록. 관심 (ROI) 3D 영역 소스 측정을 위한 폐에서 빨간색 큐브로 표시 됩니다. (E) NTF 효율 측정 및 재건 품질 검사에 대 한 시뮬레이션의 지도. 3D 재구성 (유사한 측정 및 시뮬레이션 NTF 효율)의 좋은 품질을 제공 하는 측정 및 시뮬레이션 NTF 효율 프로 파일 비교 되었다. F) 수평 및 G) 수직 신호 대표 측정된 (파란색) 프로필 (빨간색) NTF 효율 곡선을 시뮬레이션 하며 수평 및 수직 빨간 막대는 소스 위치를 나타냅니다. 색상 막대 낮은 (파란색)에서 높은 (레드) c m2 당 초당 광자에 형광 성 신호의 강도를 나타냅니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

결핵균 (M. 결핵) 기자 효소 형광 (REF)를 사용 하 여 감염 된 쥐의 광학 이미징을 설명 합니다. 이 프로토콜 pathogenesis, 치료 및 백신 연구에 대 한 전 임상 동물 모델에 M. 결핵 의 과민 하 고 특정 탐지를 촉진 한다.

기자 효소 형광와 쥐에서 이미징 결핵균

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

7.3K 조회수.  Texas A&M Health Science Center. 결핵균 (M. 결핵) 기자 효소 형광 (REF)를 사용 하 여 감염 된 쥐의 광학 이미징을 설명 합니다. 이 프로토콜 pathogenesis, 치료 및 백신 연구에 대 한 전 임상 동물 모델에 M. 결핵 의 과민 하 고 특정 탐지를 촉진 한다.

비디오: Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

연구

면역학 및 감염병학

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

유전학

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

의 4D 좌석 Multimodality 이미징<em&gt; Citrobacter rodentium</em마우스에서&gt; 감염

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. Multiphoton microscopy (MPM) has become one of the most popular imaging modalities for biomedical study at cellular levels in vivo, advantages include high resolution, deep tissue penetration and minimal phototoxicity. We have designed an MPM imaging platform with a customized mouse eye holder and a stereotaxic stage for imaging ocular surface in vivo. Dual fluorescent protein reporter mouse enables visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers, and capillaries within the ocular surface. In addition to multiphoton fluorescence signals, acquiring second harmonic generation (SHG) simultaneously allows for the characterization of collagenous stromal architecture. This platform can be employed for intravital imaging with accurate positioning across the entire ocular surface, including cornea and conjunctiva.

Presented here is a multiphoton microscopic platform for live mouse ocular surface imaging. Fluorescent transgenic mouse enables the visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers and capillaries within the ocular surface. Non-linear second harmonic generation signals derived from collagenous structures provide label-free imaging for stromal architectures.

마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

생체공학

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

기능 리포터 시스템으로 특정 진 균의 오 번역 비율 측정

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, studying IAV requires the use of laborious secondary approaches to detect the presence of the virus in infected cells and/or in animal models of infection. This limitation has been recently circumvented with the generation of recombinant IAVs expressing easily traceable fluorescent or bioluminescent (luciferase) reporter proteins. However, researchers have been forced to select fluorescent or luciferase reporter genes due to the restricted capacity of the IAV genome for including foreign sequences. To overcome this limitation, we have generated a recombinant replication-competent bi-reporter IAV (BIRFLU) stably expressing both a fluorescent and a luciferase reporter gene to easily track IAV infections in vitro and in vivo. To this end, the viral non-structural (NS) and hemagglutinin (HA) viral segments of influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) were modified to encode the fluorescent Venus and the bioluminescent Nanoluc luciferase proteins, respectively. Here, we describe the use of BIRFLU in a mouse model of IAV infection and the detection of both reporter genes using an in vivo imaging system. Notably, we have observed a good correlation between the expressions of both reporters and viral replication. The combination of cutting-edge techniques in molecular biology, animal research and imaging technologies, provides researchers the unique opportunity to use this tool for influenza research, including the study of virus-host interactions and dynamics of viral infections. Importantly, the feasibility to genetically alter the viral genome to express two foreign genes from different viral segments opens up opportunities to use this approach for: (i) the development of novel IAV vaccines, (ii) the generation of recombinant IAVs that can be used as vaccine vectors for the treatment of other human pathogen infections.

Influenza A viruses (IAVs) are contagious respiratory pathogens that cause annual epidemics and occasional pandemics. Here, we describe a protocol to track viral infections in vivo using a novel recombinant luciferase and fluorescence-expressing bi-reporter IAV (BIRFLU). This approach provides researchers with an excellent tool to study IAV in vivo.

루시퍼라제-형광 리포터 인플루엔자 바이러스 감염 의 실시간 이미징 및 정량화

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Reporter Enzyme Fluorescence Imaging for In Vivo Tracking of Bacterial Infection

Source: Sharan, R., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56801">Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the reporter enzyme fluorescence (REF) imaging for in vivo detection of Mycobacterium tuberculosis infection. The infected mice are intraperitoneally injected with a substrate for REF imaging. Upon being hydrolyzed by bacterial &#946;-lactamase enzyme, the substrate emits fluorescence, the detection of which aids evaluation of infection.

Reporter Enzyme Fluorescence Imaging for In Vivo Tracking of Bacterial Infection(세균 감염의 생체 내 추적을 위한 Reporter Enzyme Fluorescence Imaging)

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

Fluorescence Molecular Tomography: An Imaging Technique for In Vivo Imaging of Fluorescent Protein-tagged Glioblastoma Xenografts in Mouse Model

Source: Benitez, J. A. et al., <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/57448" target="_blank">Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe fluorescence molecular tomography or FMT for in vivo imaging of fluorescent protein-tagged glioblastoma xenografts in mouse models. The technique is useful for elucidating the effects of anti-tumor therapeutics at the molecular level.

형광 분자 단층 촬영: 마우스 모델에서 형광 단백질 태그가 지정된 교모세포종 이종이식편의 생체 내 이미징을 위한 이미징 기술

Source: Benitez, J. A. et al., Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we ...

암 연구학

Cancers of the Nervous System

In vivo studies

A Technique to Detect Extrapulmonary Tuberculosis via Superparamagnetic Nanoprobes

Source: Lee, C., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58227">Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a technique for the detection of extrapulmonary tuberculosis. Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoprobes, conjugated to Mycobacterium-specific antibodies, are injected into a mouse previously infected with Mycobacterium bovis BCG, labeling the granuloma and providing a better imaging contrast for its detection.

기자 효소 형광와 쥐에서 이미징 결핵균

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