Name: evaluation of injury-induced senescence and in vivo reprogramming in the skeletal muscle
Uploaded: 2017-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle at JoVE.com

우리는 Clemire Cimper에 그녀의 우수한 기술 지원에 대 한 빚을입니다. H.L.의 연구실에서 작업 파스퇴르, 검색 과학 센터 국가 부 라와 직원 회 드 라 검색 (응용 d'Excellence, 소생 Investissement d'Avenir;에 의해 투자 되었다 ANR-10-LABX-73), 직원 회 드 라 검색 (ANR-16-CE13-0017-01) 및 Fondation 호 (PJA 20161205028). 참조 및 교류는 박사에 의해 부활 컨소시엄에서 박사 장학 자금을.

동물 인 파스퇴르 (CETEA) 승인 프로토콜의 윤리 위원회와 유럽 공동체 지침에 의하여 처리 했다.
 1. 재고 솔루션의 준비 <ol><li>근육 샘플 고정을 위한 자료 준비. 20 mL 물 근육 고정을 위한 동결 포함 매체 수 있도록 RT에서 tragacanth 껌의 0.5 g을 녹.</li>
	<li>SA-β-Gal 얼룩에 대 한 솔루션을 준비.
	<ol><li>재고의 솔루션 K 3 Fe(CN) 6 (100 m m), K 4 Fe(CN) 6 (100 m m), MgCl 2 (1m) 증류수에 각각 분말을 용 해 하 여 준비.</li>
		<li>물에 희석 하 여 0.2% C 20 H 6 Br 4 나 2 O 5 (오신)의 재고 솔루션을 준비.</li>
		<li>없음 (dimethylformamide, DMF) C 3 H 7에서 X-여자 분말을 용 해 하 여 C 14 H 15 BrClNO 6의 재고 솔루션 (X-gal) (50 mg/mL)를 준비.</li>
		<li>저장소 K 3 Fe(CN) 6 및 4 ° C에서 K 4 Fe(CN) 6 솔루션 및 MgCl 2 실시간 
		참고: X 걸 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 약 수에 최대 6 개월. 오신 솔루션 RT에서 보관 하 고 필요한 경우 필터링 후 다시 사용할 수 있습니다. K 3 Fe(CN) 6 및 K 4 Fe(CN) 6 솔루션 protectedfromthe 빛을 있습니다. X gal 솔루션 물에서 불안정과 빛 으로부터 보호 되어야 했다.</li>
	</ol></li> <li>Nanog 얼룩에 대 한 솔루션의 준비: permeabilization 솔루션 포함 0.1% 나 3 C 6 H 5 O 7 (trisodium 시트르산), 0.1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton X-100) 증류수에 4에 저장 한다 ° c. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 실시간에 저장 한다 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 포함 된 차단 솔루션 준비</li>
</ol> 2. 냉동 따 근육 섹션에 SA-β-Gal 얼룩 <ol><li>껌 코르크의 조각에는 tragacanth의 작은 금액을 삽입 하 여 타 근육에 대 한 고정 재료 준비.</li>
	<li>부 상자는 쥐 (2 달 오래 된, C57/B6) 남녀의 13 위에서 설명한 cardiotoxin (CDX)와 10 일 전에 부상을 했다. 동일한 마우스에서 아닌 부상 (PBS 주입) TA를 사용 하 여 부정적인 제어. Vivo에서 프로그래밍을 원하는 경우 치료 Dox (1 mg/mL)와 각 마우스 식 수에서 (빛에서 보호), 같은 날에 CTX 부상 직후. 
	참고: Dox 솔루션 7 일의 총 치료 기간 동안 3 일 마다 변경 될 필요가 있다.
	<ol><li>쥐 앞에서 설명한 ( 그림 1A) 13에서 두 따 근육 (부상 및 제어)를 분리. 가로 섹션을 확인, tragacanth 껌 따 근육의 원심 힘 줄을 삽입 하 고 ( 그림 1B) 밖에 서 근육의 약 ¾ 부분 두고 액체 질소에 직접 고정을 위한 isopentane 냉각 &#60; 1 분 
		참고: TA 근육은 코르크의 센터에 수직 위치에 다는 것을 확인 하십시오. 샘플-80 ° C 또는 직접 10 µ m 섹션에서 cryosectioned에 저장 될 수 있다.</li>
	</ol></li> <li>따 근육 그림 1B에 설명 된 대로 처리.
	각 슬라이드의 상단 왼쪽된 위치에 10 다른 슬라이드에 올바른 순서로 <ol><li>분포는 1 st-10 번째 섹션입니다. 첫 번째 슬라이드;에 11 번째 섹션 1 세인트 섹션에 인접 한 장소 12 번째 섹션 외에 두 번째 슬라이드에 2 nd 섹션 오른쪽 배치 순서를 따를 것 이다. 10 섹션/슬라이드 10 슬라이드 (총 100 섹션)에 대 한 첫 번째 섹션 및 마지막 섹션 사이의 최소 1 m m 거리를 보장 하기 위해 가져온 때까지이 프로세스를 반복 합니다.</li>
	</ol></li> <li>1 %paraformaldehyde 및 0.2%도 포함 하는 PBS에 4 분에 대 한 섹션을 수정. PBS, 2 x 10 분 씻어. 다음, PBS에 섹션을 품 어 (pH = 5.5) 30 분에 대 한 실시간에 모든 단계를 수행 
	참고: 고정 효소 활동을 유지 하기 위해 가벼운 수 있다. 후드 아래이 단계를 수행 합니다. PBS의 pH 중요 하 고 X-여자 솔루션 빛 으로부터 보호 되어야 합니다.</li>
	<li>X gal 솔루션 포함 하 품 섹션: 4 m m K3Fe(CN) 6, 4 m m K4Fe(CN) 6, 2 m MgCl2, m 및 400 µ g/mL X Gal에서 PBS, pH = 5.5. 3 x 10 분, 실시간에 PBS 가진 슬라이드 24 h. 세척의 최소 37 ° C에서 어둠 속에서 품 어 
	참고:는 인큐베이션 최소 24 시간을 필요 하며 SA-β-Gal 신호를 최대화 하기 위해 48 시간 동안 지속 될 수 있다. 솔루션 24 시간의 외피 후 변경 될 필요가 있다. 슬라이드는 빛 으로부터 보호 되어야 한다. SA-β-Gal 얼룩을 원하는 경우에 2.5 단계로 진행 합니다. 공동 Nanog와 얼룩을 원하는 하시기 바랍니다 앞으로 단계로 건너뜁니다 3.1.</li>
	<li>수정 슬라이드 1% paraformaldehyde PBS에서 30 분 세척에 대 한 슬라이드와 함께 PBS, 0.2% 오신와 3 x 10 분 Counterstain. 1 분 오신 솔루션에 슬라이드를 담가 그리고 증류수로 간단히 씻. 마지막으로, 수성 비 fluorescing 장착 매체와 슬라이드 마운트 (재료의 표 참조). 
	참고: 후 고정을 수행 하기 위해 필수적 이다. 후드 아래이 단계를 수행 합니다. 모든 단계를 실시간에 수행</li>
</ol> 3. Immunohistochemistry 안티 Nanog 항 체 <ol><li>PBS PBS, 슬라이드에 직접 permeabilization 솔루션의 2 x 10 분 추가 200 µ L 10 분 세척에 대 한 4 %paraformaldehyde 포함 된 슬라이드를 수정 하 고 5 분 동안 품 어. <ol><li>세척 PBS, 2 x 5 분와 마지막 세척, 사용 200 µ L PBS 포함 하는 슬라이드에 직접 0.25 %BSA에서 슬라이드. 실시간에서 이러한 모든 단계를 수행 
		주의: 후드 고정 단계 수행.</li>
	</ol></li> <li>기본 안티-Nanog 항 체와 품 슬라이드 (최종 농도: 1.25 ug/mL) 5%를 포함 하는 PBS에 4 ° C에서 하룻밤 FBS. PBS, 2 x 10 분와 슬라이드를 세척 하 고 마지막 세척에 사용 200 µ L PBS 0.25% BSA 5 분 수행에 대 한 포함 된 모든 세척 단계에서 실시간 
	참고: 증발을 방지 하기 위해 젖은 종이 타월로 상자에서 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>품 슬라이드 랩 HRP 이차 항 체의 100 µ L 사용 하 여 준비 키트 (재료의 표 참조) 45 분 세척에 PBS, 3 x 5 분와 슬라이드에 대 한 2 차 항 체를 제거. 빛에서 보호와 RT에서 모든 단계를 수행 하십시오.</li>
	<li>시각화 <ol><li>먼저는 3, 3을 희석 &#39;-diaminobenzidine (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), 소량) 기판 버퍼에 키트 (20 µ L DAB의 기판 버퍼 솔루션의 1 ml)을 사용 하 여 준비에 의해 제공. 각 슬라이드에 직접 소량 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 실시간에 10 분의 최대 품 어 
		참고: 희석된 DAB 솔루션 갓 준비 한다 및 4 ° c.에 1 주까지 동안 저장 될 수 있다 보육 시간 배경 신호를 최소화 하기 위해 조정할 수 있지만 모든 슬라이드에 대 한 동일을 유지 합니다.</li>
		<li>물으로 rinsing 하 여 DAB 솔루션을 제거 합니다. Counterstain 빠른 빨간 솔루션 (준비가 사용 테이블의 자료를 참조 하십시오) 슬라이드 20 분 세척에 대 한 물 슬라이드 다시 짧게.</li>
		<li>5 m 95% 에탄올과 그들을 탈수합니다100% 에탄올, 2 x 5 분 뒤에. 마지막으로, 빠른 경화 설치 매체와 슬라이드 마운트 (재료의 표 참조).</li>
		<li>관찰 20 X 피하기 위해 배경에서 밝은 분야에서 현미경 슬라이드. 
		참고: 빠른 빨간 솔루션 RT에서 보관 및 다시 사용할 수 필터링 후.</li>
	</ol></li></ol> 4. 분석 및 정량화 <ol><li>SA-β-Gal 정량화 <ol><li>슬라이드를 검사 하 고 인수 이미지에 따라 각 슬라이드에 최고의 섹션을 선택 하십시오. 2 섹션/TA를 사용 하 여는 정량화에 대 한. 판사는 섹션 &#39; s 품질 조직 무결성, 얼룩, 및 counterstaining의 품질에 따라. 정량화에 대 한 전체 타 근육에 걸쳐 SA-β-Gal 정량화의 더 나은 표현 수 있는 샘플, 사이 최대 가능한 거리와 두 개의 최고 품질 섹션 선택.</li>
		<li>SA-β-Gal 긍정적인 세포 ( 그림 2)의 부 량.
		<li>확인 수동으로 작고 큰 긍정적인 SA-β-Gal 셀을 선택 하 여 픽셀 크기의 순위 <ol>.
			<ol><li>ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 스캔 한 슬라이드의 디지털 이미지를 엽니다.</li>
				<li>인터페이스에서 클릭 &#39; 분석 &#39; &#62; &#39; 도구 &#39; &#62; &#39; ROI 관리자 &#39; &#62; &#39; 분석 &#39; &#62; &#39; 측정을 설정 &#39; &#62; &#39; 선택 영역 &#39;. 선택 도구를 사용 하 고 작은 서라운드 및 큰 긍정적인 SA-β-Gal 셀을 클릭 하 여 ROI 관리자에 추가 &#39; 추가 &#39;. 측정 하는 사용 하 여 크기는 &#39; 측정 &#39; 버튼 하 고 나중에 사용에 대 한 값을 저장.</li>
			</ol></li> <li>모든 보이는 긍정적인 셀 선택 되도록 임계값 매개 변수를 조정.
			<li>변환을 클릭 하 여 그레이 스케일 이미지 <ol>&#39; 이미지 &#39; &#62; &#39; 유형 &#39; &#62; &#39; 8 비트 &#39; ( 그림 2A). 다음에 서 &#39; 이미지 &#39; &#62; &#39; 조정 &#39; &#62; &#39; 임계값 &#39;, 모든 긍정적인 SA-β-Gal 셀 레드 ( 그림 2B)에 덮여 때까지 두 번째 커서를 이동한 다음 클릭 합니다 &#39; 적용 &#39;.</li>
				<li>클릭 하 여 분석 입자 &#39; 분석 &#39; &#62; &#39; 분석 입자 &#39; &#62; &#39; 크기 (픽셀 ^2) &#39;, 그리고 단계 4.1.2.1에에서 정의 된 값을 적용, 입력 &#39; 순환 &#39;: &#39; 0.00-1.00 &#39;, 클릭 &#39; 확인 &#39;; 모든 요약 한는 계산된 입자 ROI 관리자 ( 그림 2D)에 표시 됩니다.</li>
			</ol></li> <li>원본 이미지에 모든 선택 된 입자를 전송. 정확한 부 량을 수동으로 선택 영역을 조정 합니다. 긍정적인 세포 (녹색 화살표, 그림 2E)를 추가 및/또는 거짓 긍정적인 세포 (빨간 화살표, 그림 2E) 제거. 마지막으로, 사용 하 여 섹션 ( 그림 2D)으로 표시 하 여 영역을 측정에서 &#39; 선택 도구 &#39;. 클릭 &#39; ROI 관리자 &#39; &#62; &#39; 추가 &#39; &#62; &#39; 측정 &#39;.</li>
			<li>섹션의 영역에 의해 긍정적인 셀의 수를 중요 한 것은, 정상화.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Nanog 정량화 <ol><li>20 배 확대에 수동으로 밝은 분야에서 현미경 Nanog 긍정적인 셀. 
		참고: 빠른 빨간 counterstaining TA 근육의 형태학의 좋은 평가 수 있습니다. 그러나, 얼룩이 지는 아주 가벼운 이며 명확한 개요 섹션의 부족. 스캐너는 종종 섹션의 경계를 식별 하 실패 하 고 제대로 초점을 수 없습니다. 스캔 하기 전에 섹션의 가장자리를 원 하거나 더 민감한 스캐너 섹션을 사용 하 여 마커를 사용 하 여 가능 하다. 현재 프로토콜에 대 한 그것은 가장 효율적 Nanog 긍정적인 세포를 수동으로 계산.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+from+physiology+to+pathology.">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+p16(Ink4a)-positive+cells+shorten+healthy+lifespan.">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+senescence-associated+secretory+phenotype:+the+dark+side+of+tumor+suppression.">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).</li><li>Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+turnover+of+senescent+cells+during+regeneration+of+a+complex+structure.">Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+senescent+cells+in+optimal+wound+healing+through+secretion+of+PDGF-AA.">An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li><li>Mosteiro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+damage+and+senescence+provide+critical+signals+for+cellular+reprogramming+in+vivo.">Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo.</a> Science. 354 (6315), (2016).</li><li>Chiche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-Induced+Senescence+Enables+In+Vivo+Reprogramming+in+Skeletal+Muscle.">Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle.</a> Cell Stem Cell. , (2016).</li><li>Ritschka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+senescence-associated+secretory+phenotype+induces+cellular+plasticity+and+tissue+regeneration.">The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration.</a> Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency.">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).</li><li>Abad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+in+vivo+produces+teratomas+and+iPS+cells+with+totipotency+features.">Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features.</a> Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).</li><li>Ohnishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+Termination+of+Reprogramming+In+Vivo+Leads+to+Cancer+Development+through+Altered+Epigenetic+Regulation.">Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation.</a> Cell. 156 (4), 663-677 (2014).</li><li>Guardiola, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Acute+Skeletal+Muscle+Regeneration+by+Cardiotoxin+Injection.">Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li><li>Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+is+required+to+prevent+p53-dependent+senescence+following+skeletal+muscle+injury.">Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury.</a> Nat Commun. 6, 8528 (2015).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li><li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase.">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li><li>Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+pH+6+beta-galactosidase+activity+indicate+cell+senescence?.">Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?.</a> Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).</li><li>Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SA+beta+Gal+staining:+biomarker+or+delusion.">SA beta Gal staining: biomarker or delusion.</a> Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

여기, 선물이 모두 노화를 검출 하는 방법 및 pluripotent 줄기 세포 재프로그래밍 쥐의 골격 근육. 이 방법은 평가 척도 모두 노화 세포가 소성에 vivo에서, 유도 그리고 조직 수리 및 재생에 노화의 역할을 검토 사용 될 수 있습니다.
현재 프로토콜 골격 근육에 노화 세포 vivo에서 감지 하 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-Gal) 분석 결과 사용 합니다. 이 분석 결과 중형 p...

세포 노화 스트레스 응답 안정적인 세포 주기 검거가 특징의 한 형태입니다. 지난 10 년간에서 연구는 단단히 설립 노화 배아 개발, 섬유 증, 및1,2노화 하는 유기 체를 포함 하 여 다양 한 생물 학적 및 병 적인 프로세스와 연결 된. 세포 노화는 그들의 일차 수명 telomere 단축3에 의해 실행의 끝에 인간의 섬유 아 세포에서 처음 확인 되었다. 일차 스트레스, 노화, DNA 손상, 산화 스트레스, 종양 신호는의 결국에 p53/p21 또는 pRB 통로 활성화 하는 게놈/epigenomic 변경 등을 일으킬 수 있는 다른 많은 자극 있습니다. 설정 하 고 영구 성장 체포1강화. 노화 세포의 중요 한 특성 중 하나는 그들은 metabolically 활성 상태로 유지 하 고 견고 하 게 표현 하는 노화에 관련 된 분 비 형 (SASP): 많은 염증 성 cytokines, 성장 인자, 세포 외 매트릭스의 분 비 요인4. SASP 요소를 중재 하 고 면역 세포를 유치 하 고 지역 및 조직의 조직 milieus1변경에 그들의 강력한 효과 인해 노화 효과 증폭에 중요 한 역할을 제안 되었습니다. 흥미롭게도, 노화 최근 제안 되었습니다 조직 수리 및 재생5,6에 대 한 중요 한 것. 또한, 우리를 포함 한 여러 연구소에서 데이터 조직 손상-유도 노화 세포가 소성, SASPs, 재생7-9홍보를 통해 강화 수 있습니다 제안 했다. 따라서, 모든 신흥 데이터 노화 비보의 중요성을 강조 표시 합니다.
게시물 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 시대에 세포가 소성은 새로운 정체성을 획득 하 고 두 문화 그리고 vivo에서10에 다른 자극에 노출 되 면 대체 운명 채택 셀의 능력 이다. 그것은 알려져 그 전체 프로그래밍 하 달성 vivo에서11,12, 수 어디의 표현은 4 야 마나카 요소를 포함 하는 카세트: Oct4, Sox2, Klf4및 c-Myc (OSKM) 유도 수 비보에 여러 장기에 teratomas 형성을 촉진. 따라서, 중요 한 레 귤 레이 터와 셀룰러 소성11에 대 한 중요 한 경로 식별 하는 강력한 시스템으로 재프로그래밍 마우스 모델 (i4F)를 사용할 수 있습니다.
적합 하 고 민감한 vivo에서 시스템은 어떻게 세포 노화를 이해에 필수적인 조직 재생의 맥락에서 세포가 소성을 조절. 여기, 우리는 강력한 시스템 및 노화와 조직 재생의 맥락에서 셀룰러 소성 사이의 링크를 평가 하는 상세한 프로토콜 제시. 유도 하는 cardiotoxin (CTX)의 조합 근육 손상 Tibialis 앞쪽 (TA) 근육 그룹, 조직 재생, i4F 마우스 모델을 공부 하 고 잘 설립 시스템에에서 수 세포 노화와 생체 내에서 의 검색 근육 재생성 하는 동안 프로그래밍.
세포가 소성 및 노화 사이의 링크를 평가 하려면 i4F 마우스 급성 근육 손상을 유발 하는 CTX 부상 되며 doxycycline (0.2 mg/mL) 7 일 이상 vivo에서 재프로그래밍을 유도 하는 것으로 치료. CTX 급성 근육 손상을 유발 하는 동안 재생 프로토콜 윤리적인 이유를 위해 최근에 출판 된13되었습니다 현재 프로토콜에이 절차를 생략 됩니다. 노화 세포의 피크 이전 관찰 되었습니다14때 따 근육 샘플 10 일 게시물 부상13, 수집 됩니다. 여기,이 상세한 프로토콜 (SA-β-Gal)를 통해 노화의 수준 및 재활 (IHC Nanog의 얼룩)를 통해 평가 하는 데 필요한 모든 단계를 설명 합니다.
노화 관련 베타-galactosidase (SA-β-Gal) 분석 결과 문화 그리고 vivo에서15에 노화 세포 모두를 감지 하는 가장 일반적으로 사용 되 분석 결과가 이다. 다른 분석 실험에 비해, SA-β-Gal 분석 결과 그대로 조직 아키텍처, vivo에서 학문에 대 한 특히 중요 한 그들의 네이티브 환경에서 노화 세포의 식별 수 있습니다. 또한, IHC를 사용 하 여 다른 표식으로 SA-β-Gal 분석 결과 하 가능 하다. 그러나, SA-β-Gal 분석 결과 주요 제한 남아 있는 신선 또는 냉동 샘플 필요지 않습니다. 신선 또는 냉동 조직 냉동된 따 근육 샘플 같은 정기적으로 사용할 수 있을 때, SA-β-Gal은 명백히 노화 세포를 감지 하는 가장 적합 한 분석 결과 이다. Nanog는 두 가지 이유로 reprogramed 셀을 검출 하는 데 사용 하는 마커: 1) 그것은 pluripotency;에 대 한 필수적인 마커 2) 더 중요 한 것은, 그 표현 doxycycline (dox)에 의해 구동 하지 않으면, 따라서 유도 pluripotency 보다는 야 마나카 카세트의 강제 식 감지.
그것은 중요 한 것,이 연구에서 제시 하는 얼룩 프로토콜 정량화 절차를 단순화 하기 위해 별도로 실시 될 수 있지만 모두 노화를 시각화 하는 공동 얼룩 절차 및 pluripotent 줄기 세포 동일한 섹션에서 수행할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>13746-66-2</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma</td><td>D3447</td><td>For inducing in vivo reprogramming</td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Lotaxan Valence, France</td><td>L8102</td><td>For muscle injury</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>111-30-8</td><td>For Fixation solution</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron microscopy science</td><td>50-980-487</td><td>For Fixation solution</td></tr><tr><td>NaCitrate : &lt;br/&gt;Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre</td><td>Sigma</td><td>18996-35-5</td><td>For permeabilization solution</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>For permeabilization solution</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A3608</td><td>Washing solution</td></tr><tr><td>Antibody anti- Nanog</td><td>Cell signalling</td><td>8822S</td><td>Rabbit monoclonal antibody</td></tr><tr><td>EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+)</td><td>Dako</td><td>K4010</td><td>For Nanog revelation</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Leica</td><td>380159EOF</td><td>Counterstainning</td></tr><tr><td>Fast red</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3403</td><td>Counterstainning</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Immu-Mount</td><td>Fisher scientific</td><td>9990402</td><td>Mounting solution</td></tr><tr><td>Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt&amp;reg;</td><td>Sigma</td><td>25608-33-7</td><td>Mounting solution</td></tr><tr><td>Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Microscope for Nanog quantification</td></tr><tr><td>Mouse: i4F-A</td><td>Abad et al., 2013</td><td>N/A</td><td>Reprogrammable mouse model</td></tr><tr><td>Skeletal muscle, Tibialis Anterior</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan Z1</td><td>slides scanning</td></tr></tbody></table>

evaluation of injury-induced senescence and in vivo reprogramming in the skeletal muscle

세포 노화는 안정적인 세포 성장 체포, 암과 노화 등 많은 생리와 병리학 과정에 대 한 중요 한 특징은 스트레스 반응이 다. 최근, 노화 또한 조직 수리 및 재생에 연루 되었습니다. 따라서, 그것은 점점 노화 세포에 vivo에서식별에 중요 한 되고있다. 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-Gal) 분석 결과 노화 세포 모두 문화에 vivo에서감지 하는 가장 널리 사용 되 분석 결과가 이다. 이 분석 결과 기반 노화 세포에서 증가 lysosomal 내용을 lysosomal β-galactosidase 활동의 조직화 학적인 탐지 중형 pH 6 (5.5)에서 수 있습니다. 다른 분석 실험, cytometry, 같은 비교 관련 조직 구조, 형태, 위치와 같은 중요 한 정보를 제공 합니다 그들의 거주 환경에 노화 세포의 식별 수 있습니다 그리고 커플링 immunohistochemistry (IHC)를 통해 다른 마커와 가능성. SA-β-Gal 분석 결과의 주요 한계는 신선 또는 냉동 샘플의 요구 사항입니다.
여기, 우리가 어떻게 세포 노화를 이해 하는 상세한 프로토콜 현재 셀룰러 소성 및 조직 재생 비보를 촉진. SA-β-Gal 사용 하 여 조직 재생 연구에 기초가 튼튼한 시스템은 부상 시 골격 근육에 노화 세포를 감지. 또한, IHC 사용 하 여 유전자 변형 마우스 모델에서 Nanog, 만능 줄기 세포의 마커를 감지. 이 프로토콜 검사 하 고 세포 노화 유발된 세포가 소성 그리고 vivo에서 프로그래밍의 맥락에서 정할 수 있습니다.

근육 부상 유발 세포 노화를 감지
그것은 최근에 입증 되었습니다 근육 부상을 과도 세포 노화14유도. 10 일 후 부상 (DPI)에서 손상 된 myofibers의 대부분 위치 핵, myofibers, 재생의 품질 증명으로 재생을 겪고 있다 그리고 근육의 아키텍처는 다시 설립. 침투 염증 세포는 특정 지역에 표시 하면서 극적으로 감소 된다...

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Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

여기 선물이 모두 노화를 감지 하는 상세한 프로토콜 및 만능 줄기 세포 유도 vivo에서 프로그래밍 하는 동안 부상에 골격 근육. 이 메서드는 조직 재생성 하는 동안 세포 노화의 역할을 평가 하 고 vivo에서프로그래밍에 적합 합니다.

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

evaluation-injury-induced-senescence-vivo-reprogramming-skeletal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

9.5K 조회수.  Institut Pasteur. 여기 선물이 모두 노화를 감지 하는 상세한 프로토콜 및 만능 줄기 세포 유도 vivo에서 프로그래밍 하는 동안 부상에 골격 근육. 이 메서드는 조직 재생성 하는 동안 세포 노화의 역할을 평가 하 고 vivo에서프로그래밍에 적합 합니다.

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Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Cardiotoxin 주입에 의한 급성 골격 근육 재생 유도

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

연구

발생학

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

성인 및 노인 인간의 골격 근육에서 근육 조직 전구체 세포 / 차 근육 아세포의 준비 및 문화

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Analyzing Satellite Cell Function During Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injury and Injection of Self-delivering siRNA In Vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite cells. Satellite cells are characterized by the expression of the transcription factor Pax7 and their location underneath the basal lamina in the resting skeletal muscle. Upon injury, satellite cells get activated, undergo self-renewal or differentiation to either form new myofibers or to fuse with damaged ones. The functionality of satellite cells in vivo can be investigated using a cardiotoxin based injury model of skeletal muscle. To study the function of one gene during the regeneration of skeletal muscle, transgenic mouse models are mostly used. Here, we present an alternative method to transgenic mice, to investigate the gene function in satellite cells during regeneration, e.g., in cases where transgenic mice are not available. We combine the cardiotoxin mediated injury of a specific skeletal muscle with the injection of a self-delivering siRNA into the regenerating muscle which is then taken up by satellite cells among other cells. Thereby, we provide a method to analyze gene function in satellite cells during regeneration under physiological conditions without the need for transgenic mice.

We describe an in vivo method to investigate the functional loss of a specific gene in satellite cells by using a combination of cardiotoxin mediated injury of skeletal muscle and the injection of a self-delivering siRNA.

심장 독소 부상에 의한 골격 근육 재생 중 위성 세포 기능 분석 및 생체 내 자체 전달 siRNA 주입

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite ...

유전학

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

의 응용 프로그램<em&gt; 생체</em&gt; 조직 평가를위한 쥐 앞정 전방의 기능 테스트는 골격근 수리 엔지니어링

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

생체공학

Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME) - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new muscle fibers under the right conditions. Although SCs can be harvested from muscle tissue and cultured in vitro, the resulting myoblast cells are not very effective in promoting myogenesis when transplanted into host muscle. Surgically exposing the host muscle and grafting segments of donor muscle tissue, or the isolated muscle fibers with their SCs onto host muscle, promotes better myogenesis compared to myoblast transplantation. We have developed a novel technique that we call Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME). MIME involves passing a surgical needle through the host muscle, drawing a piece of donor muscle tissue through the needle track, and then leaving the donor tissue embedded in the host muscle so that it may act as a source of SCs for the host muscle. Here we describe in detail the steps involved in performing MIME in an immunodeficient mouse model that expresses a green fluorescent protein (GFP) in all of its cells. Immunodeficiency in the host mouse reduces the risk of immune rejection of the donor tissue, and GFP expression enables easy identification of the host muscle fibers (GFP+) and donor-cell-derived muscle fibers (GFP-). Our pilot data suggest that MIME can be used to implant an extensor digitorum longus (EDL) muscle from a donor mouse into the tibialis anterior (TA) muscle of a host mouse. Our data also suggest that when a myotoxin (barium chloride, BaCl2) is injected into the host muscle after MIME, there is evidence of donor-cell-derived myogenesis in the host muscle, with approximately 5%, 26%, 26% and 43% of the fibers in a single host TA muscle showing no host contribution, minimal host contribution, moderate host contribution, and maximal host contribution, respectively.

Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

We describe a novel experimental technique that we call Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME), which is based on the evidence that skeletal muscle tissue contains viable myogenic cells that can facilitate donor-cell-mediated myogenesis when implanted into a host muscle.

최소한 침략 적 근육 (MIME) 포함-기증자 세포 중재 하는 Myogenesis를 촉진 하기 위하여 새로운 실험 기법

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new ...

의학

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

근육 줄기 세포에서 Autophagy의 원위치 Immunofluorescent 얼룩

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

생물학

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

성인 근육 줄기 세포 기능 전 비보의 평가를위한 단일 근섬유 배양 분석

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

줄기세포와 그 틈새를 배양하기 위한 쥐의 골격근 수확

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and recovery from injuries depend on a multitude of cell types and on molecular signals between the core muscle cells (myofibers, muscle stem cells) and their niche. Most experimental settings do not preserve this complex physiological microenvironment, and neither do they allow the ex vivo study of muscle stem cells in quiescence, a cell state that is crucial for them. Here, a protocol is outlined for the ex vivo culture of muscle stem cells with cellular components of their niche. Through the mechanical and enzymatic breakdown of muscles, a mixture of cell types is obtained, which is put in 2D culture. Immunostaining shows that within 1 week, multiple niche cells are present in culture alongside myofibers and, importantly, Pax7-positive cells that display the characteristics of quiescent muscle stem cells. These unique properties make this protocol a powerful tool for cell amplification and the generation of quiescent-like stem cells that can be used to address fundamental and translational questions.

저자 스포트라이트: Niche Components를 이용한 정지 근육 줄기 세포 배양을 위한 Ex Vivo 프로토콜 

Skeletal muscle comprises multiple cell types, including resident stem cells, each with a special contribution to muscle homeostasis and regeneration. Here, the 2D culture of muscle stem cells and the muscle cell niche in an ex vivo setting that preserves many of the physiological, in vivo, and environmental characteristics are described.

틈새 및 줄기 세포 정지를 재현하기 위한 쥐 골격근의 분획되지 않은 대량 배양

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

요약

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Cardiotoxin 주입에 의한 급성 골격 근육 재생 유도

성인 및 노인 인간의 골격 근육에서 근육 조직 전구체 세포 / 차 근육 아세포의 준비 및 문화

심장 독소 부상에 의한 골격 근육 재생 중 위성 세포 기능 분석 및 생체 내 자체 전달 siRNA 주입

의 응용 프로그램

최소한 침략 적 근육 (MIME) 포함-기증자 세포 중재 하는 Myogenesis를 촉진 하기 위하여 새로운 실험 기법

근육 줄기 세포에서 Autophagy의 원위치 Immunofluorescent 얼룩

성인 근육 줄기 세포 기능 전 비보의 평가를위한 단일 근섬유 배양 분석

틈새 및 줄기 세포 정지를 재현하기 위한 쥐 골격근의 분획되지 않은 대량 배양

틈새 및 줄기 세포 정지를 재현하기 위한 쥐 골격근의 분획되지 않은 대량 배양

틈새 및 줄기 세포 정지를 재현하기 위한 쥐 골격근의 분획되지 않은 대량 배양