Name: evaluation of injury-induced senescence and in vivo reprogramming in the skeletal muscle
Uploaded: 2017-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
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彼女の優れたテクニカル サポートの Clemire Cimper にお世話になっております。H.L. の研究室での仕事は、パスツール研究所、凝った科学センターの注ぐラ ・ アジャンス ナシオナル デ ラ凝った (フランス d'Excellence リバイブ、Investissement d'Avenir; によって賄われていたANR-10-LABX-73)、アジャンス ナシオナル デ ラ抜き (ANR-16-CE13-0017-01) および財団アーク (PJA 20161205028)。C. c. と交流は、博士・復活のコンソーシアムからドクターによって賄われています。

欧州共同体ガイドラインとの Institut パスツール (CETEA) 承認プロトコルの倫理委員会に従って処理された動物。
 1。 在庫ソリューションの準備 <ol><li>筋サンプル固定のための材料を準備します。筋固定のため凍結埋め込み媒体に RT で 20 mL の水で tragacanth ガムの 0.5 g を溶解します</li>。
	<li>SA β Gal の汚損のためのソリューションを準備します。
	<ol><li>溶液 K 3 Fe(CN) 6 (100 mM)、K 4 Fe(CN) 6 (100 mM)、MgCl 2 (1 M) 蒸留水でそれぞれの粉末を溶解することにより準備します</li>。
		<li>0.2% C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5 (エオジン) の原液を水で希釈して準備します</li>。
		<li>ない (ジメチルホルムアミド、DMF) C 3 H 7 X gal 粉末を溶解することにより原液 C 14 H 15 BrClNO 6 (X-gal) (50 mg/mL) を準備します</li>。
		<li>ストア K 3 Fe(CN) 6 と 4 ° c、K 4 Fe(CN) 6 ソリューションと室温 MgCl 2 
		注: X gal に格納できる因数-20 ° C で最大 6 ヶ月。エオシン ソリューションは常温保管し、必要に応じてフィルター処理後に再利用できます。K 3 Fe(CN) 6 K 4 Fe(CN) 6 ソリューションは、protectedfromthe ライト。光から保護するため、耐水性ではない X gal ソリューションです</li>。
	</ol></li> <li>Nanog 染色溶液の調製: 透過ソリューションを含む 0.1% Na 3 C 6 H 5 O 7 (クエン酸ナトリウム)、0.1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9 10) (トリトン X-100) 蒸留水 4 で貯えられるべき ° C は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、右に格納する必要がありますでブロッキング溶液 5% ウシ胎児血清 (FBS) を準備</li>
</ol> 2。TA 筋部の凍結に SA β Gal 染色 <ol><li>コルクのスライスにガム、tragacanth の少量を置くことによって脛骨筋の固定材料を準備します</li>。
	<li>負傷マウス雌雄 (2 ヶ C57/B6) の負傷した cardiotoxin (CDX) と 10 日前に 13 を前述のよう。負の制御として同じマウスから非負傷した (PBS インジェクション) TA を使用します。生体内で 書き換えが必要な場合治療 Dox (1 mg/mL) と各マウス水を飲んで (光から保護)、同じ日に CTX 損傷直後後 。
	注: Dox ソリューション 3 日総治療日数を 7 日に変更する必要があります。
	<ol><li>は、( 図 1 a) 13 を前述のマウスから両方の TA 筋肉 (負傷および制御) を分離します。横断切片を確保、tragacanth ガムに TA 筋の遠位腱を挿入し、( 図 1 b) 外筋の約 ¾ 一部を残して、液体窒素にて凍結する冷却のイソペンタン &#60; 1分 
		注: 脛骨筋が垂直な位置で、コルクの中心部にされていることを確認します。-80 ° C または直接 10 μ m のセクションで cryosectioned でサンプルを格納できます</li>。
	</ol></li> <li> 図 1 b のように TA 筋肉を処理します。
	各スライドの上部の左位置に 10 の異なるスライドに正しい順序で <ol><li>配布、1 st-10 th セクション。11 番目 のセクションを配置するには、1 st セクションに隣接して最初のスライド12 番目 のセクション、2 番目のスライドの 2 nd セクション以外にも右を配置する同じ順序に従います。10 セクション/スライドが 10 スライド (合計で 100 セクション) の最初のセクションと前のセクション間の最小 1 mm を確実に得られるまでこのプロセスを繰り返します</li>。
	</ol></li> <li>1% パラホルムアルデヒドと 0.2% グルタルアルデヒドを含む PBS では 4 分のセクションを修正します。2 x 10 分、PBS で洗浄します。次に、PBS でセクションを孵化させなさい (pH 5.5 を =) 30 分室温のすべての手順を実行します 。
	注: 固定は、酵素活性を維持するために軽度でなければなりません。この手順では、フードの下で。PBS の pH が重要であり X gal ソリューションは光から保護する必要があります</li>。
	<li>X gal のソリューションを含む加温セクション: pbs は、400 μ g/mL X Gal MgCl2、2 mM、4 mM K4Fe(CN) 6 4 mM K3Fe(CN) 6 pH 5.5 を =。孵化 24 時間洗浄の最小値の 37 ° C で暗闇の中、pbs 室温の 3 × 10 分のスライド 
	注: 孵化 24 時間の最小値を必要とし、SA β Gal 信号を最大にする 48 時間の最後のことができます。ソリューションは培養 24 時間後に変更する必要があります。スライドは、光から保護する必要があります。SA β Gal の染色が必要な場合にのみは、2.5 の手順に進みます。Nanog 染色が必要な場合してくださいにスキップ ステップ 3.1</li>。
	30 分洗浄 PBS の <li>修正スライド 1% パラホルムアルデヒドの 3 × 10 分 0.2% エオシン対比染色、pbs スライドします。エオシン溶液 1 分間のスライドを浸すし、簡単に蒸溜水でそれらをすすいでください。最後に、非蛍光剤取り付けの水溶液でのスライドをマウント (材料の表 を参照してください). 
	注: それはポストの固定を行うために不可欠です。この手順では、フードの下で。ルートですべての手順を実行</li>
</ol> 3。免疫組織化学を使用して反 Nanog 抗体 <ol><li>、スライドに直接透過液の 2 x 10 分追加 200 μ L の PBS で 10 分洗浄 4% パラホルムアルデヒドを含む PBS でスライドを固定し、5 分間インキュベートします。 <ol><li>洗浄スライド PBS、2 x 5 分と最後の洗浄、使用 200 μ L の PBS のスライドで直接 0.25 %bsa を含みます。室温のすべてのこれらの手順を実行します 
		注意: は、フードの下で固定の手順を実行します</li>。
	</ol></li> <li>主アンチ Nanog 抗体 加温スライド (最終濃度: 1.25 μ G/ml) 4 ° c 5% を含む PBS で一晩 FBS。PBS、2 x 10 分でスライドを洗って最後の洗浄で 5 分実行 0.25 %bsa を含む使用 200 μ L の PBS をすべての洗浄を室温ステップ 
	注: インキュベート蒸発を防ぐために湿らせたペーパー タオルをボックスのスライドです</li>。
	使用する準備ができてから rAb HRP 二次抗体の 100 μ L で <li>加温スライド キット (材料の表 を参照してください) に PBS、3 x 5 分付き 45 分洗浄用スライドの二次抗体を削除します。光から保護と RT ですべての手順を実行します</li>。
	<li>可視化 <ol><li>最初に、希釈、3, 3 &#39;-ジアミノベンジジン (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl) 軽くたたく) 基板バッファー内キット (基板バッファー溶液 1 mL のために軽打の 20 μ L) を使用する準備ができてによって提供されます。各スライドに直接 DAB 溶液 100 μ L を追加し、最大室温 10 分間インキュベート 
		注意: DAB 薄めたたて準備する必要があります、4 ° C で最大一週間保存することができます。インキュベーション時間バック グラウンド信号を最小限に抑えるために調整することができますが、すべてのスライドの同じを保持する必要があります</li>。
		<li>は、水ですすいで DAB ソリューションを削除します。Counterstain 速い赤ソリューション (準備 材料の表 を参照) を持つスライド 20 分洗浄水スライド再度簡潔にします</li>。
		<li>は 95% のエタノール 5 m のによってそれらを脱水します。100% エタノール, 2 x 5 分後に。最後に、迅速な硬化取付中のスライドをマウント (材料の表 を参照してください).</li>
		<li>は、バック グラウンドを避けるために 20 X に明視野顕微鏡でスライドを観察 。
		注: 高速赤色溶液常温保管して再使用できるフィルタ リングの後</li>。
	</ol></li></ol> 4。分析と定量化 <ol><li>SA β Gal 定量化 <ol><li>スライドをスキャンし、取得した画像に基づく各スライドのベスト セクションを選択します。定量化のため少なくとも 2 セクション/TA を使用します。セクションを判断 &#39; s 質組織の整合性、染色、counterstaining の品質に基づいています。定量化, 全体の TA 筋を通して SA β Gal 定量化のより豊かな表現を可能にするサンプル間に最大可能距離と 2 つの最高品質のセクションを選択します</li>。
		<li>SA β Gal 陽性細胞 ( 図 2) の定量化。
		<ol><li>の最小と最大の肯定的な SA β Gal セルを手動で選択してピクセルのサイズ ランクを決定します。
			<ol><li>ImageJ ソフトウェアを使用してスキャンしたスライドのデジタル画像を開きます</li>。
				<li>インターフェイスでは、をクリックして &#39; 分析 &#39; &#62; &#39; ツール &#39; &#62; &#39; ROI マネージャー &#39; &#62; &#39; 分析 &#39; &#62; &#39; 測定を設定 &#39; &#62; &#39; 領域を選択 &#39;。選択ツールを使用し、サラウンド、最小および最大正 SA-β-Gal 携帯しをクリックして ROI マネージャーに追加 &#39; 追加 &#39;。使用してサイズを測定、&#39; 測定 &#39; ボタンをクリックし、後で使用する値を保存します</li>。
			</ol></li> <li>すべての表示されている肯定的なセルが選択されてを確認するしきい値パラメーターを調整します。
			<ol><li>変換をクリックしてグレースケール画像 &#39; 画像 &#39; &#62; &#39; タイプ &#39; &#62; &#39; 8 ビット &#39; ( 図 2 a)。次へ &#39; 画像 &#39; &#62; &#39; 調整 &#39; &#62; &#39; しきい値 &#39;、すべての肯定的な SA β Gal のセルは赤 ( 図 2 b) で覆われるまで 2 番目のカーソルを移動し、クリックして &#39; 適用 &#39;.</li>
				<li>をクリックして分析粒子 &#39; 分析 &#39; &#62; &#39; 粒子の分析 &#39; &#62; &#39; サイズ (ピクセル ^2) &#39;、4.1.2.1 のステップで定義された値を適用して、入力 &#39; 循環 &#39;: &#39; 0.00 1.00 &#39;、クリックして &#39; ok &#39;; すべての概要が、カウント粒子が ROI マネージャー ( 図 2 D) で表示されます</li>。
			</ol></li> <li>元の画像を選択したすべての粒子を転送します。定量の正確さを確認する手動で選択範囲を調整します。陽性細胞 (緑色の矢印、 図 2 e) を追加および偽陽性細胞 (赤矢印、 図 2 e) を削除します。最後に、アウトラインのセクション ( 図 2 D) 使用によって区域を測定、&#39; 選択ツール &#39;。クリックして &#39; ROI マネージャー &#39; &#62; &#39; 追加 &#39; &#62; &#39; メジャー &#39;.</li>
			<li>重要なは、断面の面積によって陽性細胞数を正規化します</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>Nanog 定量化 <ol><li>20 倍の倍率で手動で明視野顕微鏡 Nanog 陽性細胞をカウントします 。
		注: 高速赤 counterstaining TA 筋の形態の良い評価が可能します。ただし、染色は非常に軽い、セクションの明確な輪郭を欠いています。スキャナーは、しばしばセクションの境界を識別するために失敗し、フォーカスを正しくことはできません。マーカーを使用して、スキャンする前に、断面図のエッジを円またはセクションを検出するより敏感なスキャナーを使用することが可能です。現在のプロトコルの Nanog 陽性細胞を手動でカウントする効率的です</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+from+physiology+to+pathology.">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).</li><li>Baker, D. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li><li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase.">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li><li>Krishna, D. 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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ここでは、リプログラマブル マウスの骨格筋の老化の両方を検出する方法と、多能性幹細胞を提示します。このメソッドは、評価、両方老化を定量化し体内細胞の可塑性、誘発して組織の修復・再生老化の役割を調べるに使用可能性があります。
現在のプロトコル老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β Gal) 試金を使用して、骨格筋における体内老化細胞を検?...

細胞の老化は、安定した細胞周期の阻止によって特徴付けられるストレス反応の形式です。研究は過去 10 年間で、老化が萌芽期の開発、線維化、生物1,2の高齢化などさまざまな生物学的および病理学的プロセスに関連付けられていることをしっかりと確立しています。細胞の老化は、テロメアの短縮3によって引き起こされる彼らの分裂寿命の終わりに線維芽細胞で初めて確認されました。複製ストレスのほか、DNA 損傷、酸化ストレス、がん化シグナル ゲノム ・ エピゲノムの変化、うちのどれかが最終的に p21/p53 および pRB の細道を起動などの老化を引き起こすことができる他の多くの刺激があります。確立し、永続的な成長逮捕1を強化します。老化細胞の重要な特性の 1 つは、彼らは代謝活性が維持され老化関連の分泌形質 (SASP) を力強く表現: 多くの炎症性サイトカイン、増殖因子、細胞外マトリックスの分泌要因4。SASP の要因は、媒介と増幅老化作用、免疫細胞を集め、ローカルおよび全身の組織調査1を変更することで、強力な効果のために重要な役割を果たすに提案されている.興味深いことに、老化が最近組織修復と再生5,6の重要であると提案されています。さらに、我々 を含む、いくつかのラボからのデータは組織損傷が誘導する老化が再生7-9を促進するために、SASPs による細胞の可塑性を高める可能性を示唆しています。したがって、すべての新たなデータは、老化で生体を調査する重要性を強調表示します。
細胞の可塑性は、ポスト誘導多能性幹細胞 (iPSC) 時代文化とin vivoの10の異なる刺激にさらされると代替運命を採用する新しい id を取得するセルの能力です。におけるリプログラミング達成体内11,12, をすることができます知られている場所の表現、山中 4 因子を含むカセット: Oct4、 Sox2、 Klf4、C-myc (OSKM) が誘導体内の複数の臓器の奇形の形成を促進することができます。したがって、重要な規制当局と細胞の可塑性11にとって重要な経路を識別するために、強力なシステムとして再マウス モデル (i4F) を使用できます。
適切かつ敏感な体内システムがどのように細胞老化の理解に不可欠な組織再生における細胞の可塑性が調節します。ここでは、堅牢なシステムと老化と組織再生における細胞の可塑性の間のリンクを評価する詳細なプロトコルを提案します。(TA) 脛骨前方筋群、組織再生や i4F マウス モデルを研究する万全の体制で cardiotoxin (CTX) の組み合わせによる筋肉の損傷により細胞老化のin vivo検出筋再生中にプログラムし直します。
老化と細胞の可塑性の間のリンクを評価するには、i4F マウスは急性の筋肉の損傷を誘発する CTX と負傷、生体内でリプログラミングを誘発するドキシサイクリン (0.2 mg/mL) 7 日間で治療します。CTX 誘発急性筋肉の損傷、再生プロトコルは、倫理的な理由の最近公開された13をされている、現在のプロトコルでこの手順が省略されます。老化細胞のピークが以前14を観察されているとき、10 日間のポスト傷害13TA 筋サンプルが収集されます。ここでは、この詳細なプロトコルは、(SA β Gal) を経由して老化のレベルと (IHC 染色 Nanog) 経由でリプログラミングを評価するために必要なすべての手順を説明します。
老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β Gal) アッセイは、文化とin vivoの15の両方老化細胞を検出する最も一般的に使用される試金です。その他の試金に比べると、SA β Gal 試金はそのまま組織アーキテクチャでは、生体内で調査のため特に重要です彼らのネイティブ環境における老化細胞の同定をことができます。また、カップルは IHC を使用して他のマーカーと SA β Gal 試金することが可能です。ただし、SA β Gal 試金は、主な制限のまま新鮮なまたは冷凍のサンプルを必要は。新鮮なまたは冷凍の組織は TA 筋サンプルを冷凍など、日常的に使用できるが、SA β Gal は明らかに老化細胞を検出する最も適切な試金です。Nanog は 2 つの理由 reprogramed の細胞を検出するために使用されるマーカー: 1); 多能性の重要なマーカーは2) もっと重要なは、その表現はないドキシサイクリン (dox) によって駆動される、山中カセットの強制発現ではなく誘導多能性を検出するため。
本論文で示したプロトコルを汚す定量化手順を簡素化する個別に行うことができるが、また老化の両方を可視化する共同染色手順と同じセクションを多能性幹細胞で行うことができます注意してくださいが重要です。

<table><tbody><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>13746-66-2</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td>For SA-&amp;beta; Gal staining solution</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma</td><td>D3447</td><td>For inducing in vivo reprogramming</td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Lotaxan Valence, France</td><td>L8102</td><td>For muscle injury</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>111-30-8</td><td>For Fixation solution</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron microscopy science</td><td>50-980-487</td><td>For Fixation solution</td></tr><tr><td>NaCitrate : &lt;br/&gt;Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre</td><td>Sigma</td><td>18996-35-5</td><td>For permeabilization solution</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>For permeabilization solution</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A3608</td><td>Washing solution</td></tr><tr><td>Antibody anti- Nanog</td><td>Cell signalling</td><td>8822S</td><td>Rabbit monoclonal antibody</td></tr><tr><td>EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+)</td><td>Dako</td><td>K4010</td><td>For Nanog revelation</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Leica</td><td>380159EOF</td><td>Counterstainning</td></tr><tr><td>Fast red</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3403</td><td>Counterstainning</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Immu-Mount</td><td>Fisher scientific</td><td>9990402</td><td>Mounting solution</td></tr><tr><td>Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt&amp;reg;</td><td>Sigma</td><td>25608-33-7</td><td>Mounting solution</td></tr><tr><td>Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Microscope for Nanog quantification</td></tr><tr><td>Mouse: i4F-A</td><td>Abad et al., 2013</td><td>N/A</td><td>Reprogrammable mouse model</td></tr><tr><td>Skeletal muscle, Tibialis Anterior</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan Z1</td><td>slides scanning</td></tr></tbody></table>

evaluation of injury-induced senescence and in vivo reprogramming in the skeletal muscle

細胞の老化は、がんや高齢化など多くの生理学的および病理学的プロセスのために重要である安定した細胞増殖停止によって特徴付けられるストレス反応です。最近では、老化は組織の修復と再生にも関与しています。したがって、それは体内老化細胞を識別するますます重要になっています。老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β Gal) アッセイは、老化細胞の文化とin vivoの両方を検出する最も広く使われている試金です。この試金は、ライソゾームの β-ガラクトシダーゼ活性の組織化学的検出 (6 または 5.5) 以下の pH でことができます老化細胞のライソゾーム含量の増加に基づいています。これにより形態, 組織アーキテクチャに関する場所など貴重な情報を提供しています彼らの居住環境における老化細胞の同定、フローサイトメトリーなど、他の試金と比較して、免疫組織染色 (IHC) を介して他のマーカーとの結合の可能性。SA β Gal 試金の主要な制限は、新鮮なまたは冷凍サンプルの要件です。
ここで、どのように細胞老化を理解するための詳しいプロトコルは提示細胞の可塑性と組織再生の生体を促進します。怪我の組織再生を研究するのに確立されたシステムに骨格筋の老化細胞を検出するのに SA β Gal を使用します。さらに、トランスジェニック マウス モデルの Nanog、多能性幹細胞のマーカーを検出するのに IHC を使用します。このプロトコルを調べるし、細胞の老化誘導細胞の可塑性と生体内でリプログラミングのコンテキストでを定量化することが出来ます。

筋肉傷害による細胞老化の検出
最近では筋損傷が細胞の老化が過渡14を誘導すること示されています。10 日後に損傷 (DPI)、損傷した筋線維の大部分は、中心部にある核、再生、筋線維の特徴と再生を受けているし、筋のアーキテクチャが再確立されました。浸潤炎症細胞が特定の地域で表示を維持しながら...

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Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

ここで生体内でリプログラミングを誘導しながら傷害時に骨格筋の老化の両方を検出するための詳しいプロトコルおよび多能性幹細胞を提示します。このメソッドは、組織の再生中に細胞の老化の役割を評価し、生体内リプログラミングに適しています。

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

evaluation-injury-induced-senescence-vivo-reprogramming-skeletal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

9.5K ビュー.  Institut Pasteur. ここで生体内でリプログラミングを誘導しながら傷害時に骨格筋の老化の両方を検出するための詳しいプロトコルおよび多能性幹細胞を提示します。このメソッドは、組織の再生中に細胞の老化の役割を評価し、生体内リプログラミングに適しています。

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Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

発生生物学

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Analyzing Satellite Cell Function During Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injury and Injection of Self-delivering siRNA In Vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite cells. Satellite cells are characterized by the expression of the transcription factor Pax7 and their location underneath the basal lamina in the resting skeletal muscle. Upon injury, satellite cells get activated, undergo self-renewal or differentiation to either form new myofibers or to fuse with damaged ones. The functionality of satellite cells in vivo can be investigated using a cardiotoxin based injury model of skeletal muscle. To study the function of one gene during the regeneration of skeletal muscle, transgenic mouse models are mostly used. Here, we present an alternative method to transgenic mice, to investigate the gene function in satellite cells during regeneration, e.g., in cases where transgenic mice are not available. We combine the cardiotoxin mediated injury of a specific skeletal muscle with the injection of a self-delivering siRNA into the regenerating muscle which is then taken up by satellite cells among other cells. Thereby, we provide a method to analyze gene function in satellite cells during regeneration under physiological conditions without the need for transgenic mice.

We describe an in vivo method to investigate the functional loss of a specific gene in satellite cells by using a combination of cardiotoxin mediated injury of skeletal muscle and the injection of a self-delivering siRNA.

カーディオトキシン損傷による骨格筋再生中の衛星細胞機能の解析と生体内での自己送出型siRNAの注射

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite ...

遺伝学

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

の応用<em&gt;インビボ</em組織工学骨格筋の修復を評価するためのラット前脛骨の&gt;機能テスト

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

生物工学

Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME) - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new muscle fibers under the right conditions. Although SCs can be harvested from muscle tissue and cultured in vitro, the resulting myoblast cells are not very effective in promoting myogenesis when transplanted into host muscle. Surgically exposing the host muscle and grafting segments of donor muscle tissue, or the isolated muscle fibers with their SCs onto host muscle, promotes better myogenesis compared to myoblast transplantation. We have developed a novel technique that we call Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME). MIME involves passing a surgical needle through the host muscle, drawing a piece of donor muscle tissue through the needle track, and then leaving the donor tissue embedded in the host muscle so that it may act as a source of SCs for the host muscle. Here we describe in detail the steps involved in performing MIME in an immunodeficient mouse model that expresses a green fluorescent protein (GFP) in all of its cells. Immunodeficiency in the host mouse reduces the risk of immune rejection of the donor tissue, and GFP expression enables easy identification of the host muscle fibers (GFP+) and donor-cell-derived muscle fibers (GFP-). Our pilot data suggest that MIME can be used to implant an extensor digitorum longus (EDL) muscle from a donor mouse into the tibialis anterior (TA) muscle of a host mouse. Our data also suggest that when a myotoxin (barium chloride, BaCl2) is injected into the host muscle after MIME, there is evidence of donor-cell-derived myogenesis in the host muscle, with approximately 5%, 26%, 26% and 43% of the fibers in a single host TA muscle showing no host contribution, minimal host contribution, moderate host contribution, and maximal host contribution, respectively.

Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

We describe a novel experimental technique that we call Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME), which is based on the evidence that skeletal muscle tissue contains viable myogenic cells that can facilitate donor-cell-mediated myogenesis when implanted into a host muscle.

低侵襲の筋肉 (MIME) の埋め込み - ドナー細胞の筋を容易にする新しい実験手法

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new ...

医学

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

生物学

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

マウス骨格筋を採取して幹細胞とそのニッチを培養

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and recovery from injuries depend on a multitude of cell types and on molecular signals between the core muscle cells (myofibers, muscle stem cells) and their niche. Most experimental settings do not preserve this complex physiological microenvironment, and neither do they allow the ex vivo study of muscle stem cells in quiescence, a cell state that is crucial for them. Here, a protocol is outlined for the ex vivo culture of muscle stem cells with cellular components of their niche. Through the mechanical and enzymatic breakdown of muscles, a mixture of cell types is obtained, which is put in 2D culture. Immunostaining shows that within 1 week, multiple niche cells are present in culture alongside myofibers and, importantly, Pax7-positive cells that display the characteristics of quiescent muscle stem cells. These unique properties make this protocol a powerful tool for cell amplification and the generation of quiescent-like stem cells that can be used to address fundamental and translational questions.

著者スポットライト:ニッチ成分で静止筋幹細胞を培養するためのEx Vivoプロトコル 

Skeletal muscle comprises multiple cell types, including resident stem cells, each with a special contribution to muscle homeostasis and regeneration. Here, the 2D culture of muscle stem cells and the muscle cell niche in an ex vivo setting that preserves many of the physiological, in vivo, and environmental characteristics are described.

マウス骨格筋の未分画バルク培養によるニッチおよび幹細胞の静止を再現

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

傷害による老化と生体内での骨格筋におけるリプログラミングの評価

要約

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心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

成人および高齢人間の骨格筋から筋原性前駆細胞/一次筋芽細胞の調製と文化

カーディオトキシン損傷による骨格筋再生中の衛星細胞機能の解析と生体内での自己送出型siRNAの注射

の応用

低侵襲の筋肉 (MIME) の埋め込み - ドナー細胞の筋を容易にする新しい実験手法

筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

マウス骨格筋の未分画バルク培養によるニッチおよび幹細胞の静止を再現

マウス骨格筋の未分画バルク培養によるニッチおよび幹細胞の静止を再現

マウス骨格筋の未分画バルク培養によるニッチおよび幹細胞の静止を再現