이 작품이 되었습니다 조종사 교부 금에 의해 동맹에서 재생 재활 연구 및 교육 (AR3T)와 교수 시작 패키지에 대 한 웨인 주립 대학에서 병을. AR3T 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소의 아동 건강 및 인간 발달 (NICHD), 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기 (NINDS), 그리고 생물 의학 이미징의 국가 연구소 고 바이오 (NIBIB에 의해 지원 됩니다. )의 수상 번호 P2CHD086843에서 건강의 국가 학회. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

살아있는 동물을 포함 하는 모든 연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 웨인 주립 대학, 디트로이트, 미시간, 미국에 의해 승인 되 고 관리 및 실험 동물의 사용 (에 대 한 가이드를 따라 8 판, 2011, 발행 국가 아카데미 압박, 500 5 거리, NW, Lockbox 285, 워싱턴, DC 20055, 미국). 승인된 IACUC 프로토콜에 의하여 통증 및 고통을 포함 하는 절차는 일반적인 마 취 유도 및 isoflurane 흡입 효과 (1.5-5%)에서 유지 관리 수행 했다. 마 취 및 종을의 부족 꼬집어, 발가락을 철수의 부족에 의해 확인 되었다 또는 털 응답 (isoflurane 비율 증가 효과 유지 하기 위해 필요에 따라). 프로토콜, 최소한 침략 적 특성상 한 &#34; 멸 균 팁 &#34; 기술 뒤를 이었다. 동물 마 취 동안, 석유 젤리 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 되었습니다. 아니 특별 한 치료 했다; 그러나, 다이어트 젤 일반 마 취. 조사 절차는 수술 노출 호스트를 포함 하지 않는 다음과 같은 MIME, 진통 하 IACUC에 의해 승인 절차를 다음 24 h에 대 한 동물을 제공 했다 근육, 그리고 많은 일반적인 진통 약물 정상적인 근육 재생에 영향을 미칠 것으로 알려진 한 hindlimb에 국한 하기 때문에 정상적인 기능에는 영향을 미치지 않습니다. 1. 동물 모델 <ol><li>MIME에 대 한 호스트 마우스 <ol><li>호스트로 사용 NSG GFP 마우스 (8-10 주, 남성) 근육 이식 연구. 
		참고: 이러한 마우스는 이상적인 호스트 수용자 근육 이식 때문에 성숙한 T와 B 림프 톨과 기능성 천연 킬러 세포 부족, 부족 한 cytokine 신호, allografting 또는 xenografting 비 근육 세포에 대 한 다른 사람에 의해 사용 되었습니다 14. 유비 쿼터 스 GFP 식 호스트 (GFP +) 및 기증자 세포 유래 (GFP) 근육 섬유의 쉽게 식별할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>MIME에 대 한 기증자 마우스 <ol><li>기증자 쥐로 사용 C57BL/6J 쥐 (12-16 주). 
		참고: 이러한 마우스는 적합 한 기증자 쥐 때문에 그들은 완전히 매핑된 게놈, 어떤 골격 근육 병 리를 알 수 없는, 쉽게 사용할 수 있고 경제적, GFP를 표현 하지 않습니다.</li>
	</ol></li></ol> 2. 기증자 근육 조직 준비 <ol><li>매 지도 봉합 및 수확 기증자 EDL 근육 <ol><li>경부 전위와 thoracotomy 탁상에 의해 관리 하는 일반적인 마 취하에 수행 하 여 기증자 마우스를 안락사 의료 산소 (흡입된 isoflurane; 2-5% 효과)에 의해 구동 isoflurane 기화.</li>
		<li>EDL 근육에 액세스 하려면 수술가 위를 사용 하 여 다리의 앞쪽 표면에 피부를 열고. 앞쪽 다리에 따 근육을 찾아서 EDL 근육 따 근육 뒤에 위치를 시각화 하기 위해 그것을 제거 합니다. EDL 근육 뒤에 집게의 쌍의 끝을 밀어 하 고 발가락 확장 보고 부드러운 견인을 적용 (이 근육은 EDL 인지 확인). &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160; &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 참고: 기증자 조직 지역 수술, aseptically 준비 전에 수확 해야.</li>
		<li>사용 ~ 10 cm의 세그먼트 4-0 실크, 꼰, 비 흡수, 무 균 봉합, 그리고 EDL 근육의 근과 원심 힘 줄을 지도 봉합을 적용 하 게 2 개의 두 배 매듭. ( 그림 1A).</li>
		<li>원심 EDL 힘 줄을 잘라 EDL 근육을 반영 하 고 근 힘 줄을 잘라.</li>
		<li>장소 기증자 EDL 근육 페 트리 접시에 가득 마우스 벨 솔루션.</li>
	</ol></li></ol> 3. MIME에 대 한 호스트 마우스를 준비 <ol><li>마 취 <ol><li>전신 마 취 (흡입된 isoflurane; 1.5-5% 효과) 의료 산소에 의해 구동 탁상 isoflurane 기화에 의해 관리 아래 호스트 마우스.</li>
		<li>유도 실에서 마 취를 유발 하 고 동물에 다른 절차를 수행 하는 동안 마 취를 유지 하기 위해 코 콘을 마우스를 전송. 동물 마 취 동안 패드를가 열 하는 등온선 젤 열 지원.</li>
	</ol></li> <li>피부 준비 <ol><li>동물을 제거 하려면 &#39; s 모피, 왼쪽된 뒷 다리의 앞쪽 측면 depilatory 크림을 적용. 후속 절차에 대 한 제어 다리는 오른쪽 다리 역할.</li>
		<li>두고는 분리와 depilatory 크림을 2 분 클린에 depilatory 크림 모피 인산에 젖은 잎사귀와 버퍼링 식 염 수 (PBS). 털 제거 후 스크럽 povidone-요오드 제거 솔루션 및 70% 에탄올의 3 번갈아 잎사귀와 피부.</li>
	</ol></li> <li>호스트 따 근육에 바늘 트랙을 만드는 <ol><li>전달 호스트의 센터를 통해 18 게이지 (1에 긴) 수술 바늘 따 근육 근육에 따라 &#39; s 긴 축 ( 그림 1B). TA 근육 및 근육 배꼽 ( 그림 1B)의 센터를 통해 길이 따라 cephalo 꼬리 방향으로 바늘을 통과. 
		참고:이 단계의 목적은 어떤 기증자 근육의 조각을 포함 수 바늘 트랙을 만드는 것입니다. TA 근육의 센터에 기증자 조직 포함 것 허용 하도록 마이그레이션 및 전체 호스트에서 myogenesis 촉진 기증자 조직에서 SCs 따 근육.</li>
	</ol></li> <li>호스트 따 근육의 바늘 트랙에 소스 기증자 조직 <ol><li>수술 바늘 호스트 따 근육 내에서 일단 통과 한쪽 끝에 수술 바늘의 루멘을 통해 기증자 조직의 지도 봉합 한 caudo 두 부 방향 ( 그림 1C).</li>
		<li>바늘 caudo 두 부 방향에서 호스트 따 근육에서 인출 됩니다 바늘 트랙을 통해 기증자 조직의 그립니다.</li>
		<li>는 기증자 조직의 꼬리와 두 부 끝에 지도 봉합을 사용 하 여 조직 기증자의 배치를 조정. 기증자 조직 호스트 따 근육 ( 그림 1D) 내에서 누렸다는 확인 하십시오.</li>
		<li>일단 기증자 조직 배치 최적화 지침 봉합 잘라 조정을 어떤 최종 기증자 조직 배치에 뾰족한 집게와.</li>
		<li>물개 피부 바늘 상처 ( 그림 1E -F) 집게와 상처 가장자리에 가깝게 27 게이지 수술 바늘의 팁과 수의 조직 접착제를 적용 하 여.</li>
	</ol></li></ol> 4. 공동으로 행 한 근육 변성 유발 및 중생을 근육 Myotoxin 주사 <ol><li>MIME 후 호스트 근육에 광범위 한 근육 섬유 손상 유도 호스트 따 근육 1.2% BaCl 2 (myotoxin)의 50-60 µ L 주입 및 기증자 조직 안에서 포함 된 15.
	<li>주사 BaCl 2 호스트 조교의 길이 따라 3 사이트 <ol>근육 (근, 중, 말 초-3 분의 1 근육 배). 
		참고: 재생 16 다음 공동된 근육 섬유 손상 유도 골격 근육에 주입 BaCl 2, cardiotoxins 및 notexin 같은 myotoxins.</li>
	</ol></li></ol> 5. 포스트 절차 동물 관리 <ol><li>후 MIME 및 BaCl 2 주입, 호스트 마우스 청소 &#39; s 왼쪽된 뒷 다리 에탄올과 다리와 피부를 보호 하기 위해 석유 젤리의 얇은 레이어를 적용.</li>
	<li>절차 후 피부 관리, 후 코 콘에서 호스트 마우스 제거.</li>
	<li>침구 없이 독방 복구에 마우스를 놓습니다. 등온선 젤 난방 패드를 통해 회복 동물에 열 지원 복구 장의 절반 아래 배치 제공. 
	참고: 하나의 절반은 하지 필요한 경우 그 동물 난방 패드에서 이동할 수 있도록가 열.</li>
	<li>호스트 마우스는 완전히 마 취에서 회복 후에 그것의 원래 감 금 소 동물을 반환 합니다. 동물 시설에 두고 동물 다시 후속 실험 수행 됩니다 때까지. 후속 준비 될 때까지 호스트 마우스를 매일 모니터링 &#8211; 예: 3 또는 14 일 후 MIME에. MIME, 다음 동물 모니터링 됩니다 실험실 직원에 의해 뿐만 아니라 수의 직원에 의해 &#8211;이 주로 동물, 경고 밝고 반응; 경우 평가 포함 또한 동물 고통의 명백한 조짐을 보이고 있다 또는 어려움을 이동, 먹이, 음주 및 정리는 데 평가.</li>
</ol> 6. 조직 컬렉션 <ol><li>수확 호스트 근육 <ol><li>경부 전위와 thoracotomy 의료 산소 (에 의해 구동 탁상 isoflurane 기화에 의해 관리 하는 일반적인 마 취하에 수행 하 여 호스트 마우스를 안락사 흡입된 isoflurane; 효과 2-5%). 탐정 IACUC 승인 전에 안락사. 전신 마 취 아래 수확 따 근육에 소재한</li> <li>호스트 따 근육에 액세스 하려면를 사용 하 여 수술가 위 다리의 앞쪽 표면에 피부를 열고. 앞쪽 다리에 따 근육을 찾아 원심 힘 줄을 잘라, 근육을 반영 하 고 근 위 근육 첨부 파일 (섹션 2.1 참조) 잘라.</li>
		<li>수집 (실험) 왼쪽 및 오른쪽 (제어) TA 근육.</li>
	</ol></li> <li>얼어 수확된 근육 스냅 <ol><li>배치 하 여 수확된 근육 무게에 종이 무게와 규모를 무게.</li>
		<li>간단히 근육 cryoprotection의 미네랄 오일에 찍어. 초과 석유 얼룩.</li>
		알루미늄 호 일, 그리고 스냅에 <li>장소 근육 빠르게는 Dewar에 채워진 액체 질소에 그들을 immersing 하 여 근육을 고정 합니다. 레이블이 지정 된 cryovials을 샘플을 전송 하 고 나중 연구-80 ° C 냉동 실에 샘플을 저장.</li>
	</ol></li></ol> 7. 조직학 연구 <ol><li>Cryosectioning 근육 조직을 직렬 횡단면 수집 <ol><li>액체 질소를 포함 하는 Dewar에 그들을 배치 하 여 한 cryostat 샘플-80 ° C 냉동 고에서 전송.</li>
		<li>Cryostat에서 한 번에 하나의 샘플을 처리. 차가운 면도기 블레이드 (블레이드 cryostat에 저장)의 경우, 두 번 근육은 약 1-2 m m 두께의 세그먼트를 생산 하기 위해 TA 근육의 중간 배꼽에서 샘플을 잘라. Cryostat 섹션을 만들기 위한이 세그먼트를 유지 하 고 그것의 cryovial를 근육의 나머지 부분을 반환.</li>
		<li>최적의 절삭 온도 (10 월) 복합 동결, cryostat 견본 디스크에 조직의 두꺼운 세그먼트 확보. 견본 홀더에 견본 디스크를 놓습니다.</li>
		<li>거친 얼굴 20 µ m 섹션 절단 샘플. Cryostat 섹션에 대 한 유리 슬라이드에 몇 가지 20 µ m 섹션을 수집.</li>
		<li>20 µ m 섹션의 품질은 만족 하는 경우 5 µ m 절단 두께 변경 하 고 품질을 평가 하기 위해 몇 가지 섹션을 수집 합니다. 5 µ m 섹션 품질에 만족 하는 경우 직렬 섹션을 수집 합니다. 슬라이드 당 2-3 섹션을 수집 하 고 수집 3 슬라이드에 대 한 충분 한 섹션.</li>
		<li>실험 (왼쪽)와 각 동물의 컨트롤 (오른쪽) TA 근육에서 섹션을 수집.</li>
	</ol></li> <li>GFP 공부 식 참고: 근육 섬유에 GFP 식 공부 준비 슬라이드 (섹션 7.1)의 1 세트를 지정.
	<li><ol>섹션에 반대로 퇴색 매체의 ~ 50 µ L을 적용 하 고 유리 coverslip 적용. 투명 매니큐어로 coverslip 가장자리를 밀봉.</li>
		<li>빛과 형광 현미경을 사용 하 여 (재료의 표 참조) 10 배 목표와 GFP를 시각화에 대 한 적절 한 필터 섹션을 공부.
		<li>수집 <ol>디지털 (~ 15)의 이미지 따 근육의 전체 횡단면을 충당 하기 위해 시각 필드를 중복. 형광에서 현미경에 위상 대비 모드로 전환 하 여 각 visual 필드에 대 한 위상 대비 이미지 수집.</li>
		</ol></li> <li>개별 이미지를 단일 복합 이미지; 타일 수 적합 한 이미징 소프트웨어 이미지를 열고 예를 들어, 사용 된 &#34; photomerge &#34; 이미징 소프트웨어에서 파일 메뉴에서 옵션 재료의 테이블에에서 나열 된.</li>
		<li>적당 한 이미지 분석 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ) GFP 형광 이미지를 엽니다. 동그라미 개별 근육 섬유를 사용 하는 &#34; ROI 도구 &#34; 각 섬유에 대 한 의미 하는 형광 강도 기록 하 고.
		<li>계산 의미 형광 강도 높은 GFP 식을 표시 하 고 정상적인 형태를가지고 10 섬유의 평균을 취하여 최대 GFP (형광) 강도 <ol>. 각 섬유에 대 한 % 최대 GFP 강도 최대 GFP 강도 의해 각 섬유에 대 한 말은 개화 강도 나누어 100을 곱한 계산 합니다. 그림 3E와 같이 각 타 근육에 GFP 분석의 결과 집계.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Desmin의 4 Immunofluorescent 라벨 근육 섬유 무결성 및 myonuclear 위치를 공부 하 고 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 각각. 
	참고: 슬라이드 준비, 위, 근육 섬유에 desmin 라벨 연구의 1 세트를 지정 합니다.
	10 분에 대 한 PBS에 2 %paraformaldehyde <ol><li>수정 섹션 세척 3 회 PBS 가진 섹션. 
		주의: 적절 한 개인 보호 장비 (PPE) 착용 paraformaldehyde 처리할 때 처리 될 때.</li>
		<li>블록 섹션 3% 소 혈 청 알 부 민 0.01%를 포함 하는 PBS에 희석 30 분 트리톤 X100. 이 차단 솔루션으로 향후 불린다 기본 희석제.</li>
		<li>기본 희석 액 (1: 200)에서 토끼 안티 desmin 면역 글로불린 G (IgG) 희석.</li>
		<li>완료 되 면 차단 섹션에 희석된 주 항 체를 적용 하 고 품 어 하룻밤 ~ 4 ° C. 세척에 냉장고에서 한 번 섹션 (5 분) 0.1%를 포함 하는 PBS와 트라이 톤 X-100. 이 솔루션 첫 번째 워시 버퍼 향후 불린다.</li>
		<li>세척 섹션 PBS로 3 회 세척 당 (5 분).</li>
		<li>준비 안티 염소를 diluting 하 여 이차 항 체 IgG (빨간색 형광 염료를 활용) 0.01%를 포함 하는 PBS에 토끼 트라이 톤 X-100.</li>
		<li>섹션에 희석된 이차 항 체를 적용 하 고 60 분에 대 한 실 온 (~ 23 ° C)에서 품 어</li>
		<li>씻어 첫 번째 워시 버퍼 섹션 한 번 (5 분). 씻어 섹션 PBS로 3 회 세척 당 (5 분).</li>
		<li>적용 DAPI 3 분 세척 섹션 PBS로 3 회 세척 당 (1 분). 적용 ~ 섹션에 반대로 퇴색 매체의 50 µ L 유리 coverslip 적용. 투명 매니큐어로 coverslip 가장자리를 밀봉.</li>
		<li>빛과 형광 현미경을 사용 하 여 (참조 테이블의 자료), 연구 직렬 섹션 10 배 목표 및 시각화에 대 한 적절 한 필터를 빨간색 형광 염료.</li>
		<li>따 근육의 전체 횡단면을 충당 하기 위해 겹치는 시각 필드의 디지털 이미지 (~ 15)를 수집 합니다. DAPI 적절 한 필터 설정으로 전환 하 여 각 visual 필드에 대 한 라벨의 형광 이미지 수집.</li>
		<li>오픈 단계 7.2.3-7.2.4에에서 설명 된 대로 적절 한 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 하 고. 
		참고: 이미지를 식별 하 고, 어떤 근육 섬유 손상된 (desmin 부정적인)는, 연구는 근육 섬유는 중앙 nucleation (desmin 긍정적인 섬유 DAPI 표시 된 핵 내부 보다는 주변 위치를 있는), 그리고, 섹션의 영역 염증 또는 섬유 증 (와 많은 DAPI 표시 된 핵을가지고 하지만 근육 섬유 없는 분야).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

여기, 우리 호스트 근육 조직으로 기증자 근육 조직을 이식 하 우리의 실험실에서 개발 된 MIME로 알려진 새로운 실험 기법에 대 한 상세한 프로토콜을 제시. 이것은 호스트 근육9,,1017에 기증자 세포 중재 하는 myogenesis를 홍보 효과가 이미 입증 된 기술을 접목 한 오픈 근육의 적응 이다.
MIME의 목표는 (우리가 현재 알 수 없습니다이 발생 합니다) 호스트 근육으로 자체 기증자 근육 조직의 engraftment를 사용 하지만 오히려 SCs myogenesis m를 자극 하는 조건 하에서 호스트 근육에 기여할 수 있는 기증자의 소스를 제공 하기 uscle의 재생 우리의 희망은 MIME을 최적화 하 고 기본 및 전 임상 연구에서 테스트, 후 귀중 한 통찰력을 높이기 조직적 근육 손실을 받은 골격 근육 근육 재생 임상 치료 안내를 제공할 수 있는 그것.
어떻게 MIME 번역 될 수 있는 임상 치료로 예에 관한 답변 아직 수많은 질문이 있다: 어떻게 우리가 기증자 조직의 품질 제어 것? 어떻게 우리 기증자 조직 및 세포의 면역 거부를 제어할 것입니다? 기증자 조직 세포를 제공 하는 myogenesis에 대 한 후 지워지거나 fibrotic 흉터의 뒤에 떠나지 않는? 기증자 및/또는 호스트 근육의 섬유 종류에 기증자 세포 중재 하는 myogenesis 영향을 줍니까? 어떤 근육 MIME에서 실질적으로 혜택을 받을 수 있습니다.? 우리는 현재 우리의 연구 경우 MIME은 안전 하 고 효과적인 평가, 식별 기증자 파생 된 myogenesis를 보강 하 고 위에 나열 된 질문의 많은 답변 수 있는 대체 치료를 확대는.
MIME 마우스 마우스 수용자 이식의 테스트를 완료 한 후 우리의 다음 단계는 싱가포르로 근육 조직의 조직적 잠재력을 평가 하기 위해 싱가포르로 인간 조직으로 인간 마우스 MIME을 수행 하는. 우리는 이러한 실험 사업 교육을 위한 몸 유 증 프로그램 등 장기 기증에 대 한 생명의 선물 프로그램에에서 등록 된 기증자 로부터 근육 조직에 관련 된 기초 및 변환 연구의 새로운 라인으로 이어질 것입니다 기대 .
이 원고는 대표적인 데이터 MIME 후 14 일에는 여러 가능한 myofibers GFP 부족 하거나 GFP의 낮은 수준을는 것이 좋습니다. 이러한 데이터의 우리의 해석은 GFP 기증자 위성 세포 myogenesis 호스트 근육에서에 기여입니다. 우리는 호스트 마우스 근육으로 인간의 시체 조직의 이식에 대 한 준비에이 실험을 수행. 유용한 표현 (예:GFP에서 쉽게 구별 될 수 있다, 형광 기자 기증자 조직 이식 기증자 위성 세포 myogenesis MIME 다음 호스트 근육에 기여할 명백 하 게 입증, 일 것 이다 빨간 형광 단백질 GFP + 호스트 근육에 이식 기증자 조직 표현).
이 기술은 주로 SCs 기증자 조직에 존재의 본질에 의해 제한 됩니다. 기증자 조직에 SCs 가능한 기술은 기증자 세포 중재 하는 myogenesis를 촉진 것입니다 있다면, 있다면 그들은 가능한, myogenesis 발생할 수 없습니다 동안. 그러나, SCs 아주 탄력 있기 때문에 약 2 주 사후에 대 한 가능한, 그것은 매우 실험적인 목적을 위해 수확 후 몇 분 이내에 이식 기증자 조직 기증자 세포 중재 하는 myogenesis13 촉진 한다 . 또한, 위의 언급, 그것은 섬유 증이 발생할 수 있습니다 호스트 근육에 포함 된 전체 근육 조직 (SCs, 성숙한 근육 섬유 뿐만 아니라 근육 상주 fibroblasts 포함) 된 이후 가능 합니다. 그러나,이 가정은 실험적으로 시험 될 필요가 있다. 유해한 수축, cryoinjury, 그리고 실험 myotoxins에서 발생 하는 근육 손상에 문학 제안 면역 세포 (주로 대 식 세포)는 효과적으로 손상 된 섬유에서 세포질 파편을 삭제 하 고 개장 수는 세포 외 기질18. 따라서,는 MIME 및 BaCl2 주입 후 호스트 면역 세포가 악화 기증자 근육 섬유에 대 한 액세스로 그들은 수 분명 파편, 기증자 SCs 그냥 뒤에 남겨두고이 가능 하다. 마지막으로, 기증자 파생 된 myogenesis의 기증자 근육 조직의 호스트 근육에 포함 되는 금액에 따라 달라 집니다. 기증자 세포 유래 myofibers에 의해 완전히 채워야 하 호스트 근육 구획에 대 한 순서, 그것은 방법 같은 X-또는 감마-방사선 호스트 근육 SCs ablate 반복된 MIME 절차 필요 필요 합니다.
그것은 수술 호스트 근육을 노출 하 고 호스트 근육에 기증자 조직의 조각을 봉합 기증자 세포 중재 하는 myogenesis9,,1017을 촉진할 수 있다 시연 하고있다. Myogenesis의 진행을 추적 하 고 인간의 근육 질병 마우스 모델을 생성 하이 오픈 수술 방법은 과거에 사용 되었습니다. MIME 기술의 혁신적인 측면은 그것은 최소한 침략 적 수술 호스트 근육 노출은 포함 되지 않습니다. 이 의원 성 감염 및 호스트 동물, 따라서 더 필요한 경우 동일한 호스트 근육에 MIME를 반복적으로 수행 가능한 만들기에 불편의 정도의 위험을 줄여줍니다.
우리는 MIME 기술은 호스트 마우스에 기증자 근육 조직 이식 다음에 현재 오픈 수술 접근법에 적합 한 상세 것 예상. 인간 답게 된 마우스 모델의 생성을 신속 하 게 호스트 마우스 근육에 biopsied 인간의 근육을 포함 하 여 수이. 또한, 우리는 MIME로 기증자 SCs 가능한 인간 시체 기증자 조직에서 기증자 세포 중재 하는 myogenesis를 달성에 효과적일 것입니다 예상 마우스 마우스 접목에서 우리의 예비 데이터를 바탕으로. 마지막으로, 추가 테스트 및 유효성 검사, 우리 MIME 기술은 근육 질병 인간에서 기증자 세포 중재 하는 myogenesis를 촉진 하기 위하여 새로운 치료법을 개발 도움이 되기를 바랍니다.
MIME 기술의 성공을 비판적으로 정확 하 게 호스트 근육의 fascial 격실 (epimysium) 내에서 기증자 조직 포함 따라 달라 집니다. 기증자 조직 호스트 근육 구획 내에 배치 하는 경우에 그것은 정확한 방식으로 호스트 근육에 SCs를 제공할 수 있게 됩니다. 기증자 조직 호스트 근육 이외의 경우, 그것은 어떤의 운명을 것으로 분명입니다. MIME에 대 한 우리의 실험 모델을 사용 하 여 TA 근육 호스트 근육으로 그것 때문에 유명 하 고 피상적으로 다리의 anterolateral 양상에 배치. 크기, 방향 및 TA 근육의 해부학 적 위치 쉽게 기증자 조직 배치 되도록 올바르게 호스트 따 근육 내에서 MIME 후 확인. 이 종이에 우리는 실험적 증거를 제공 하는 다시 기증자 조직메인 호스트 3 일 후 MIME에서 TA 근육 그리고에 거기 포함 14 일 이후 MIME에서 호스트 근육에 기증자 세포 중재 하는 myogenesis입니다.

건강 한 골격 근육, 비록 포스트 mitotic 위성 세포 (SCs)1,2;로 알려진 조직 상주 조직적 셀의 존재로 인해 우수한 재생 능력 보유 그리고3,4검토. 그러나, 근육 dystrophies, 외상 또는 가속된 노화에 의해 발생 하는 병 적인 조건 하에서 근육 재생 수 있습니다 하지와 유지할 근육 쇠 약, 그리고 따라서, 진보적인 근육 섬유 손실 발생5. 효과적인 방법은 근육에서 SCs를 격리 하 여 myoblasts (후와 myotubes)의 많은 수를 생성 하는 문화에서 그들을 확장 개발 되었습니다, 호스트 근육에 근육 섬유의 순수 관련 번호를 생성 하는 시도 최소한의 성공6만 나왔고. 로 다른 많은 세포 유형에 myoblasts 혼자 호스트 조직에 주입 하면 세포의 대부분 할 하지 engraft7,8. 우리는 신경 근육 학 전기 자극 (NMES) 인간의 myoblasts8주사 재생 불충분 한 호스트 마우스 근육에 기증자 세포 유래 myogenesis을 용이 하 게 나타났습니다. 다른 이식 수술 biopsied 근육 또는 연결 된 SCs와 단일 근육 섬유 NMES, SCs와 함께 전체 근육 섬유를 이식할 것 이식 보다 더 유리한 제안 없이 적당 한 myogenesis 촉진 증명 조직적 셀 혼자9,10. 때문에 기증자 또는 호스트 근육으로 투입 조작된 근육 조직 세포만을 이식 하는 것 보다 더 나은 결과 생산, 조직 또는 조직 구조로 기증자 세포 engraftment;에 대 한 중요 한 단서를 제공할 수 있습니다 가능 하다 세포 치료 연구와 관련 된 다양 한 세포 종류10,,1112에 점점 더 분명 되 고 있다는 개념.
최근 데이터는 인간에서 얻은 SCs 이상 2 주 사후 생성 myotubes 문화13에 것이 좋습니다. 따라서 우리는 살아있는 호스트에 근육 조직 수확 사후의 이식 근육 섬유 손실을 반전 됩니다 경우 평가 하고자 하는. MIME 기증자 세포 유래 myogenesis를 홍보 하기 위해 살아있는 호스트의 골격 근육 조직으로 기증자 근육 조직을 이식 하 라는 새로운 기술을 개발 했습니다. MIME 수술 바늘 바늘 트랙;을 만들 호스트 근육을 통해 전달 하는 것을 포함 한다. 바늘 트랙;을 통해 기증자 근육 조직의 작은 세그먼트 그리기 호스트 근육;에 포함 된 기증자 조직 떠나 그리고 조직 접착제로 바늘 구멍을 닫는입니다. 공부 안락사 쥐에서 기술을 연습 후 다른 실험에 우리 지금 immunodeficient는 살아있는 쥐에 MIME 수행한 편 녹색 형광 단백질 (GFP), 표현 그리고 3 ~ 14 일에 후속 포스트 MIME. 3 일 후 MIME에서 우리는 기증자 마우스 (GFP-) EDL 근육 호스트 마우스에 이식 (GFP +) TA 근육, 남아 호스트 근육에 포함 된 확인 합니다. 14 일 후 MIME에서 BaCl2 myotoxin 부상 손상 및 myogenesis, 유도 후 우리 확인는 약 5%, 26%, 26%와 43% 단일 호스트 따 근육 섬유의 쇼 호스트 기여, 최소한의 호스트 기여, 적당 한 호스트 기여, 그리고 최대한 기여, 각각 호스트. 중앙 nucleation (변성 및 후속 중생의 표식) MIME 및 myotoxin 주입 후 따 근육 섬유의 약 95%에서 볼 수 있다.
우리 공부 따 근육 MIME + BaCl2 후 14 일 때문에이 시간 포인트 재생된 섬유의 대부분은 중앙 nucleated 때 중생의 중간 단계를 캡처합니다. 우리는 공부 하는 GFP + 마우스 그렇게 할 때 우리는 결국 호스트 쥐로 인간의 시체 근육 이식, 우리 호스트와 기증자의 근육 섬유를 쉽게 구별할 수 있을 것입니다에 MIME에 대 한 호스트. 우리는 사용 하는 마우스 EDL 근육이이 근육에서 단일 섬유 따 근육9보다 큰 조직적 잠재력 나타났습니다 때문에 실험 기증자 조직으로. EDL 근육 따 근육에 시너지도 이며 비슷한 섬유 유형 구성 했다. 우리의 예비 데이터 MIME는 호스트 근육에 기증자 세포 유래 myogenesis를 촉진 수 것이 좋습니다.

<table><tbody><tr><td>NSG-GFP mice</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)</td><td>Stock #021937</td><td>Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein</td></tr><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)&amp;nbsp;</td><td>Stock #000664</td><td>Control donor mice</td></tr><tr><td>Tabletop isoflurane vaporizer&amp;nbsp;</td><td>VetEquip (Livermore, CA)</td><td>Item #901801</td><td>Inhaled anesthesia system</td></tr><tr><td>Magic depilatory crea</td><td>Softsheen Carson (New York, NY)</td><td>N/A</td><td>Razorless hair removal cream</td></tr><tr><td>4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures</td><td>Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD)</td><td>SUT106631</td><td>Guiding sutures for donor tissue</td></tr><tr><td>VetBond veterinary tissue adhesive</td><td>3M (Maplewood, MN)</td><td>Catalog #1469Sb</td><td>Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure</td></tr><tr><td>Barium chloride&amp;nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company (Arlington, TX)</td><td>Product #R0854000-500A 854-16&amp;nbsp;</td><td>Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration</td></tr><tr><td>Deltaphase isothermal gel heating pad&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific (Braintree, MA)</td><td>&amp;nbsp;Item #39DP</td><td>Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia</td></tr><tr><td>HM525NX cryostat&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher (Waltham, MA)</td><td>Catalog #HM525NX&amp;nbsp;</td><td>Cryostat to make frozen sections of muscle</td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Medium</td><td>Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA)</td><td>Catalog Number: H-1000</td><td>Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples</td></tr><tr><td>Rabbit anti Desmin Antibody</td><td>Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA)</td><td>RB9014P</td><td>Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling</td></tr><tr><td>Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody</td><td>ThermoFisher (Waltham, MA)</td><td>Catalog#: A-21069</td><td>Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&amp;nbsp;</td><td>Seracare (Milford, MA)</td><td>Catalog #5930-0006 or 71-03-01</td><td>Reagent for fluorescent labeling of nuclei</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1 microscope</td><td>Carl Zeiss (Peabody, MA)&amp;nbsp;</td><td>Product #Axio Scope.A1</td><td>Light and fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Photoshop CS4</td><td>Adobe Systems (San Jose, CA)</td><td>Photoshop CS4</td><td>Imaging Software for perform image tiling</td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td><td>Image J for Windows 64-bit Operating System</td><td>Imaging Software for quantitative fluorescence analysis</td></tr></tbody></table>

minimally invasive muscle embedding (mime) - a novel experimental technique to facilitate donor-cell-mediated myogenesis

골격 근육 조직-상주, 근육 섬유를 생성 (조직적) 위성 세포 때문 (SCs), 오른쪽 조건 하에서 새로운 근육 섬유를 형성할 수 있는 재생 능력을 소유한 다. SCs 근육 조직에서 수확 될 수 있다 생체 외에서배양 비록 결과 myoblast 셀 myogenesis 호스트 근육에 이식 때 홍보에 매우 효과적 되지 않습니다. 수술 호스트 근육을 노출 하 고 기증자 근육 조직, 또는 호스트 근육에 그들의 SCs와 함께 고립 된 근육 섬유의 세그먼트를 접목 myoblast 이식에 비해 더 나은 myogenesis를 승진 시킨다. 우리가 최소한 침략 적 근육 포함 (MIME) 전화 새로운 기술을 개발 했습니다. MIME 전달 호스트 근육을 통해 수술 바늘, 바늘 트랙을 통해 기증자 근육 조직의 조각 그리고 다음 떠나 그것 호스트 근육에 대 한 SCs의 소스 역할을 할 수 있도록 호스트 근육에 포함 된 기증자 조직 포함 한다. 여기 우리는 세포의 모든에서 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 immunodeficient 마우스 모델에서 MIME을 수행에 단계가 자세히 설명. 호스트 마우스 면역 결핍 기증자 조직의 면역 거부 반응의 위험을 감소 하 고 GFP 식 호스트 근육 섬유 (GFP +) 및 기증자 세포 유래 근육 섬유 (GFP-) 쉽게 식별할 수 있습니다. 파일럿 데이터 호스트 마우스 tibialis 앞쪽 (TA) 근육에 기증자 마우스에서 신 근 digitorum longus (EDL) 근육을 이식 하 MIME를 사용할 수 있는 것이 좋습니다. 우리의 데이터는 또한 myotoxin (바 륨 염화, BaCl2) MIME 후 호스트 근육에 주입 하는 경우는 약 5%, 26%, 26% 및 단일 호스트 TA 섬유의 43%로 호스트 근육에 기증자 세포 유래 myogenesis의 증거 건의 한다 근육 보여주는 아무 호스트 기여, 최소한의 호스트 기여, 중간 호스트 기여, 최대한 호스트 기여, 각각.

3 일 후 MIME에서 기증자는 MIME에 의해 이식 EDL 호스트 따 근육 격실 (그림 2A-C) 안에 포함 되어 있습니다. 예상 했던 대로, 형광 광학 사사 기증자 쥐에서 TA 근육의 횡단면, GFP (그림 2D)를 표현 하지 않습니다 그들은 때문에 녹색 형광 표시 되지 않습니다. 반면, 기증자 조직으로 이식 하지 호스트 마우스에서 TA 근육의 횡단면 섬유 익스프레스 GFP (그림 2E)으로 따 근육 섬유에 균일 한 녹색 형광 표시. MIME에 의해 기증자 근육 조직으로 이식 하는 근육의 횡단면에서 호스트 근육 섬유 (GFP +)와 기증자 근육 섬유 (GFP-) 사이 경계 설정의 선이 있다. 그림 2D-F 에 표시 된 시각 필드의 위상 대비 이미지 그림 2E제공 됩니다 '-F' 고 근육 섬유는 지역에는 실제로 아무 GFP는 신호입니다.
14 일 후 MIME 및 BaCl2 주입, 직렬 크로스 섹션의 TA 근육 남아 있는 레이블 없음 또는 desmin (그림 3)에 항 체와 함께 표시를 공부 함으로써 우리가 배울 GFP 신호에 모든 근육 섬유에 의해 표현 된다는 호스트 마우스에서 하지만 (빨간색 desmin 라벨 감지 가능한 근육 섬유) MIME 처리 근육 치료 근육. MIME 및 BaCl2 주입으로 치료 호스트 따 근육에 기증자 세포 유래 myogenesis 감지 GFP 신호를 보여 주는 많은 desmin(+) 근육 섬유의 존재에서 분명 하다 (그림 3C-D, 3 C' -D'). 호스트 및 기증자 조직적 셀의 가능성이 융합에서 발생 하는 공상 근육 섬유는 GFP 형광이이 섬유에 의해 전시의 적당 한 수준 낮은 의해 감지할 수 있습니다. 수많은 공상 섬유 기증자 SCs는 호스트 근육의 epimysium 내에서 미크론의 몇몇 수백을 마이그레이션할 수 있는 제안 따 근육의 전체 직경에 걸쳐 나타납니다. GFP + 섬유의 정량 그림 3E에 표시 됩니다. 그림 4 는 전체 MIME + BaCl2 치료 따 근육의 직렬 횡단면의 고배율 이미지를 보여준다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig1.jpg"> 
그림 1 . 단계에 최소한 침략 적 근육 포함 (MIME) 관련된. MIME은 전신 마 취하에 수행 됩니다. 그것은 벨 솔루션에 기증자 (기증자 마우스 EDL)의 ~ 10 mg을 배치 하 고 (A)그것의 끝에 지도 봉합 매 포함. 18-게이지 바늘 호스트 근육 (B) 의 긴 축을 통해 전달 되 고 기증자 조직 바늘 트랙 (C)를통해 그려집니다. 기증자 조직 호스트 근육 (D)에 포함 된 왼쪽, 지도 봉합은, 자르고 바늘 구멍 조직 접착제로 밀봉 된다 (E). Sealed 바늘 상처 화살표 (F)표시 됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig2.jpg"> 
그림 2 . 연구 조교 근육의 MIME 후 3 일. 호스트 근육 수집 MIME; 후 3 일 참고 호스트 TA (화살표;에 바늘 자국 A-B)입니다. 데이터는 임베디드 기증자 마우스 EDL 따 근육 격실 (B-C) 내에서 누렸다는 확인 합니다. TA 근육 횡단면 표시 야생-타입 따 근육 (D)에 있는 아무 녹색 형광, 밝은 녹색 형광 NSG GFP 따 근육 (E), 그리고 호스트와 기증자 간의 구별 3 일 NSG GFP 따 근육에 근육의 형광 이미지 -MIME ((F)입니다). D'-f에서 D f에서 시각 필드의 위상 대비 이미지 표시 됩니다 ', 각각. F와 F 패널에 레드 라인 ' 호스트 및 기증자 조직 사이 경계 설정의 라인을 보여줍니다. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55731/55731fig3.jpg"> 
그림 3 . 연구 조교 근육의 MIME 후 14 일. 데이터 수집 후 MIME 제시는 14 일. Desmin의 immunofluorescent 라벨에서 빨간색 신호는 (desmin에 대 한 긍정적인 신호를 myofibers는 가능한 나타냅니다), 파란색 신호 (얼룩 핵), DAPI에서 이며 녹색 신호는 GFP에서. 제어 따 근육 (오른쪽 hindlimb) 예상 대로 호스트 마우스에서 수확, 거의 모든 myofibers는 desmin,이 myofibers는 가능한 제안 (A; 빨간 신호)에 대 한 긍정적 이다. 또한, DAPI 얼룩을 바탕으로, 그것은 분명 그 myonuclei 거의 모든 myofibers의 건강 한 근육 (A; 푸른 신호)에서 예상 되는 것으로, 주변 위치 하 고 있습니다. 컨트롤 따 근육의 직렬 섹션 표시 거의 모든 근육 섬유는 GFP에 대 한 긍정적 다는 것을 암시 하는 밝은 녹색. MIME + BaCl2 -TA 근육 (왼쪽된 hindlimb), 치료 기증자 세포 중재 myogenesis 없음 감지 GFP 형광을 나타내는 많은 desmin(+) 근육 섬유의 존재에서 분명 하다 (C D, C'-D'). 낮은 중간 GFP 형광 (공상 근육 섬유)에 Desmin(+) 근육 섬유는 MIME 따 근육의 epimysium 내에서 마이그레이션할 수 있는 홍보 SCs 기증자를 제공, 제안 전체 따 근육의 직경에 걸쳐 존재 기증자 세포 유래 myogenesis입니다. A'-D' A. 에 파란색 상자 내의 영역의 고배율 이미지 GFP(+) 섬유 및 중앙 nucleated 섬유의 정량 E에 표시 됩니다. 바 규모 = 100 µ m (A-D)와 50 µ m (A'-D'). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" s alt="Figure 4" class="xfigimg"></img alt="Figure 4" class="xfigimg" s>rc="/files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg" / > 
그림 4 . 광범위 한 피해와 재생의 증거 MIME 및 BaCl2 주입 후 14 일. 높은 확대, 전체 MIME + BaCl2 치료 따 근육의 직렬 횡단면 표시 됩니다. 데이터 표시는 많은 근육 섬유는 온건 하 게 또는 강하게 GFP +가 위치한 핵 (A-B; 레드 a에서 신호 desmin에서, A에서 파란 신호, DAPI에서 이며 b에서 녹색 신호는 GFP에서). 이 데이터는 것이 좋습니다 그 변성 및 재생 후 BaCl2 주입이 GFP 식 영향을 주지 않습니다. 이러한 맥락에서 MIME + BaCl2 치료 따 근육, 아니 작은 GFP 식, 중앙 nucleated 근육 섬유의 존재 제안 이러한 섬유는 myogenesis (또는 재생)의 가능성이 결과에서 상당한 기여를 GFP-조직적 셀입니다. 이러한 관측 더 높은 확대 이미지의 선택 된 필드 (C F;에서 확인하실 수 있습니다. C와 D, 그리고 E와 F, 각각, 직렬 횡단면;에서 지역 겹치며 그 지역에서에서의 위치를 나타내는 이미지 테두리의 색 구분 및 B). 바 규모 = 100 µ m (A-B)와 50 µ m (C-F). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

우리는 우리가 전화 최소한 침략 적 근육 포함 (MIME), 골격 근육 조직 기증자 세포 중재 하는 myogenesis로 이식 때 용이 하 게 수 있는 가능한 조직적 셀을 포함 하는 증거에 근거 하는 소설 실험 기법을 설명 호스트 근육입니다.

최소한 침략 적 근육 (MIME) 포함-기증자 세포 중재 하는 Myogenesis를 촉진 하기 위하여 새로운 실험 기법

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new ...

minimally-invasive-muscle-embedding-mime-novel-experimental-technique

Universidad de Cartagena UDEC

Research

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Medicine

Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME) - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

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비디오: Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

연구

생체공학

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

라이브 영상에 대한 성숙한 근섬유의 체외 분화

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

발생학

Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle degeneration1, 2. In patients, the ability of resident muscle satellite cells (SCs) to regenerate damaged myofibers becomes increasingly inefficient4. Therefore, transplantation of muscle progenitor cells (MPCs)/myoblasts from healthy subjects is a promising therapeutic approach to DMD. A major limitation to the use of stem cell therapy, however, is a lack of reliable imaging technologies for long-term monitoring of implanted cells, and for evaluating its effectiveness. Here, we describe a non-invasive, real-time approach to evaluate the success of myoblast transplantation. This method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes (firefly luciferase [fluc], monomeric red fluorescent protein [mrfp] and sr39 thymidine kinase [sr39tk]) whose expression can be imaged with different imaging modalities9, 10. A variety of imaging modalities, including positron emission tomography (PET), single-photon emission computed tomography (SPECT), magnetic resonance imaging (MRI), optical imaging, and high frequency 3D-ultrasound are now available, each with unique advantages and limitations11. Bioluminescence imaging (BLI) studies, for example, have the advantage of being relatively low cost and high-throughput. It is for this reason that, in this study, we make use of the firefly luciferase (fluc) reporter gene sequence contained within the fusion gene and bioluminescence imaging (BLI) for the short-term localization of viable C2C12 myoblasts following implantation into a mouse model of DMD (muscular dystrophy on the X chromosome [mdx] mouse)12-14. Importantly, BLI provides us with a means to examine the kinetics of labeled MPCs post-implantation, and will be useful to track cells repeatedly over time and following migration. Our reporter gene approach further allows us to merge multiple imaging modalities in a single living subject; given the tomographic nature, fine spatial resolution and ability to scale up to larger animals and humans10,11, PET will form the basis of future work that we suggest may facilitate rapid translation of methods developed in cells to preclinical models and to clinical applications.

A non-invasive means to evaluate the success of myoblast transplantation is described. The method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes whose expression can be imaged with different imaging modalities. Here, we make use of a fluc reporter gene sequence to target cells via bioluminescence imaging.

이식 근육 전구 세포를 타겟팅 할 수 분자 이미징

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle ...

의학

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

면역 결핍 마우스에서 인간 골격 근 이종이식 수행

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

생물학

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

초기 산후 발달에 있는 에머리 드레이푸스 근 이영양증의 Murine 모형에서 단 근섬유 격리 및 문화

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Dosage-Adjusted Resistance Training in Mice with a Reduced Risk of Muscle Damage

Progressive resistance training (PRT), which involves performing muscle contractions against progressively greater external loads, can increase muscle mass and strength in healthy individuals and in patient populations. There is a need for precision rehabilitation tools to test the safety and effectiveness of PRT to maintain and/or restore muscle mass and strength in preclinical studies on small and large animal models. The PRT methodology and device described in this article can be used to perform dosage-adjusted resistance training (DART). The DART device can be used as a standalone dynamometer to objectively assess the concentric contractile torque generated by the ankle dorsiflexors in mice or can be added to a pre-existing isokinetic dynamometry system. The DART device can be fabricated with a standard 3D printer based on the instructions and open-source 3D print files provided in this work. The article also describes the workflow for a study to compare contraction-induced muscle damage caused by a single bout of DART to muscle damage caused by a comparable bout of isometric contractions (ISOM) in a mouse model of limb-girdle muscular dystrophy type 2B/R2 (BLAJ mice). The data from eight BLAJ mice (four animals for each condition) suggest that less than 10% of the tibialis anterior (TA) muscle was damaged from a single bout of DART or ISOM, with DART being less damaging than ISOM.

The present protocol describes a unique technique called dosage-adjusted resistance training (DART), which can be incorporated into precision rehabilitation studies performed in small animals, such as mice.

근육 손상 위험이 감소한 마우스에서 복용량 조정 저항 훈련

Progressive resistance training (PRT), which involves performing muscle contractions against progressively greater external loads, can increase muscle ...