Gostaríamos de agradecer a Manuel Zimmer nos fornecendo o arquivo de projeto inicial que foi adaptado para uso com machos; Frank Schroeder para a síntese e o fornecimento da ascr #3; Ross Lagoy para o insight e assistência de imagem e análise; e Laura Aurilio para a fabricação de mestre e que, ao lado de Christopher Chute, contribuiu para a revisão deste manuscrito. Financiamento para este trabalho foi fornecido sob concessão do National Institutes of Health 1R01DC016058-01 (J.S.), a concessão do National Science Foundation CBET 1605679 (D.R.A.) e o prémio de carreira Burroughs Wellcome em Interface científica (D.R.A.).

1. fabricação de dispositivo Nota: ver referência 1.
 Nota: mestre moldes de silicone foram fabricados usando técnicas padrão fotolitográfica para padronização fotorresiste SU-8 em um silício mestre 1 , 7. Máscaras de patrocínio de bolacha foram impressos em 25.000 dpi. Os recursos do dispositivo de homem-adaptado um Chip Olfactory Chronis desenha 19 com uma mudança no worm Porto de carregamento, adaptando um design obtido de M. Zimmer (correspondência pessoal, 2016). Uma vez é incluída para controlar a rotação dos animais. A largura do canal do porto de carregamento worm é reduzida para 50 μm. Todos os canais são 32 μm de altura. Uma vez que um molde mestre do silicone está disponível para o usuário, o usuário pode acompanhar o subsequente protocolo, conforme descrito anteriormente, 1.
<ol><li>Agente de cura e base Mix PDMS na proporção de 10:1 em peso.</li>
	<li>Homogeneizar com pipetas de transferência.</li>
	<li>Desgaseificar a mistura num exsicador de vácuo para 1 h, até que sejam removidas todas as bolhas visíveis.</li>
	<li>Despeje a mistura em um mestre de molde de silicone em um prato de diâmetro de 150 mm até 5 mm de espessura (100 g). Usar uma pipeta Pasteur para remover quaisquer bolhas ou poeira que foram introduzidos à mistura.</li>
	<li>Asse a 65 ° C, durante pelo menos 3 h, ou durante a noite.</li>
	<li>Corte o PDMS longe o molde usando um bisturi e corte os dispositivos separados separados usando uma lâmina de barbear.</li>
	<li>Buracos de entrada e saída com um soco dérmica de 1 mm.</li>
	<li>Limpar os orifícios com dH 2 O, etanol e novamente com dH 2 O para remover partículas dos socos. Secar o dispositivo em um pulso de fluxo de ar.</li>
	<li>Limpar ambos os lados do canal e o lado superior do dispositivo com fita adesiva, removendo toda a sujeira ou detritos remanescentes no dispositivo para permitir a ligação de sucesso.</li>
	<li>Plasma-lig o dispositivo, canal-lado para baixo, para um vidro de tampa no. 1.
	<ol><li>Expor vidro de tampa e dispositivo (canal-cima) para ar plasma usando as condições que permitem a ligação adequada, tais como 100 W por 30 s ou 24 W em 60 s. 
		Nota: As configurações podem ser ajustadas para melhorar a eficiência da colagem. As condições de ligação-plasma não são tão críticas como a limpeza apropriada ao tentar melhorar a eficiência da colagem. Um dispositivo insuficientemente limpo não ligarão, mesmo sob condições ideais plasma.</li>
		<li>Inverter o vidro de tampa para o lado de canal do dispositivo e pressione para baixo com o polegar para 5 s.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparação de buffer <ol><li>dilua 1 x S Basal (100 mM NaCl e 0,05 M KPO 4, pH 6.0) de um estoque de estéril 10 x.</li>
	<li>Diluir 1 M tetramisole estoque para uma concentração final de 1 mM em 1 x S Basal para todos do buffer soluções.</li>
	<li>Adicionar fluoresceína para ambos o &#34; controle de fluxo &#34; e &#34; buffer &#34; reservatórios.
	<ol><li>Criar um estoque de 100 mg/mL de fluoresceína em 1 x Basal de S.</li>
		<li>Diluir o estoque para concentrações finais de 1 µ g/mL no controle de fluxo e 0,1 µ g/mL no buffer.</li>
	</ol></li> <li>Criar estímulos.
	<ol><li>Glicerol diluído a uma concentração final de 1 M em 1 X Basal de S.</li>
		<li>Diluído ascaroside #3 (ascr #3) a uma concentração final de 1 µM em 1 X Basal de S.</li>
	</ol></li></ol> 3. Instalação de dispositivo Nota: ver 1.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig1.jpg" /> Figura 1. Instalação do dispositivo microfluidic. (A) reservatórios e tubos. Um 30 mL seringa sem um êmbolo serve como o &#34; reservatório. &#34; isto é anexado a uma válvula Luer com três opções de fluxo. Uma tomada é ligada a uma seringa de 3 mL com um êmbolo, enquanto o outro é conectado a uma agulha (laranja) que é inserida o tubo que conecta o dispositivo microfluidic. (B) o total configuração da microfluidic experiência de imagem. O dispositivo é colocado em um palco de um microscópio de epifluorescência invertido, acima as lentes objetivas. O &#34; controle de fluxo &#34; tampão viaja através de uma válvula de 3 vias, que é controlada por uma unidade na prateleira acima da instalação. Linhas que contêm buffers de então são inseridas os portos de dispositivo apropriado. (C) as portas do dispositivo microfluidic. O &#34; controle de fluxo &#34; portas flanqueiam as outras portas de entrada: o &#34; estímulo &#34; e &#34; buffer &#34; portas. A &#34; tomada &#34; porta é a porta da direita. Devido à localização da arena de carregamento do worm, o &#34; worm carregando &#34; porta é a porta central-maioria no dispositivo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig1large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol><li>Preparar três reservatórios de fluido, anexando uma seringa de 30 ou 60 mL com válvula de 3 vias Luer, com uma seringa de 3 mL e agulha anexada à válvula Luer também (como na figura 1A). Conecte a agulha a tubulação que se estende até o dispositivo microfluidic (como na figura 1A -B).</li>
	<li>Remover as bolhas de ar do reservatório e tubulação.</li>
	<li>Encher a seringa de 3 mL com tubo anexado com 1 x S Basal e inseri-lo na saída do Porto</li>
	<li>Suavemente aplique pressão na seringa até que o buffer aparece na parte superior dos orifícios de entrada.</li>
	<li>Conectar o controle de fluxo, tampão e tubulação de estímulo aos orifícios de entrada apropriado (como na figura 1B -C), garantindo que gotas de líquido estão presentes em ambos o porto de carregamento orifício e o tubo de buffer a ser anexado.</li>
	<li>Novo, suavemente aplique pressão na seringa que é conectado à porta de saída até que as gotas aparecem no worm da entrada do porto de carregamento.</li>
	<li>Inserir um pino de bloqueio sólido para o worm Porto de carregamento</li>
	<li>Remover a seringa da porta de saída e conecte o tubo de descarga ligado ao vácuo casa (-670 Torr).</li>
	<li>Inspecione o dispositivo para quaisquer bolhas no fluxo de canais, visualmente e através de confirmação através de um software compatível com a câmera de vídeo utilizados, tais como o software open-source Micro-Manger. Consulte a etapa 6 para obter dicas sobre como usar o Microgestor.
	<ol><li>Se as bolhas estiverem presentes, esperar por eles para desalojar ou ser absorvido o PDMS de parede antes de carregar qualquer animais; a presença de bolhas irá perturbar o fluxo adequado de fluidos através do dispositivo.</li>
	</ol></li> <li>Usando um filtro GFP, confirmar a dinâmica do fluxo adequado dentro do dispositivo antes da minhoca carregando a válvula de 3 vias de actuação e observando o switching de buffers.
	<ol><li>Determinar a dinâmica do fluxo adequado: observar a fluoresceína presente nas soluções de controle e buffer de fluxo ( Figura 2D -2E) alterar quando o valor do controle de fluxo é alterado pressionando o controle botão correspondente à válvula de 3 vias no link da válvula ( figura 1B).</li>
		<li>Depois de abrir o Microgestor, clique no &#34; Live &#34; para observar uma imagem ao vivo do dispositivo. Ligue a fonte de luz fluorescente para observar o fluxo de buffers no dispositivo ( Figura 2D -2E).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig2.jpg" /> Figura 2: Um macho-adaptado microfluidic olfativo chip. (A), o fluxo de padrões do dispositivo quando o worm é exposto para reserva. Tampão (B) é mostrado na cor marrom, e controle de fluxo (FC) é mostrado em amarelo, com estímulo (S) em branco. O worm Porto de carregamento foi adaptado para incluir uma curva, o que permite o melhor controle da orientação do worm. (B) o fluxo de padrões do dispositivo quando o worm é exposto ao estímulo. Tampão (B) é mostrado na cor marrom, e controle de fluxo (FC) é mostrado em amarelo, com estímulo (S) em branco. (C) as medições do dispositivo adaptado como fabricada. O worm Porto de carregamento termina em uma 42 µm de abertura, com um canal de µm 50 projetado para a largura masculina. A altura medida dos canais é 32 µm, apesar de um alvo de 25 µm no design. (D-E) A presa masculino expressando p sra-6:: GCaMP3. O promotor sra-6 não é específico do ASH, e alguma expressão pode ser observada no neurônio ASI, embora não transientes de cálcio foram observadas na ASI. A imagem é (D), uma combinação de iluminação de campo claro e fluorescente, enquanto (E) só é fluorescente. As barras de escala denotam 42 µm. (F) o ASH neurônio responde à estimulação de glicerol 1m com atividade neural robusta. A área azul denota o tempo de estímulo de glicerol a 1 M. A região sombreada indica o erro-padrão, com n = 20 pulsos de sete vermes. Os traços vermelhos indicam respostas despolarizante. Os y-Axes mostram ΔF/F 0. Barra de escala denota 5 s. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig2large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
 4. preparação de animal Nota: ver referência 23.
<ol><li>Respostas de ASH imaging para glicerol 1 M.
	<ol><li>Lugar aproximadamente 20 c. elegans machos que são positivos para p sra-6:: expressão de matriz GCaMP3 em uma placa de ágar nematoide crescimento média (NGM) inoculado com um gramado de OP50 Escherichia coli. Usar a expressão de Lino fluorescente e/ou um marcador de injeção de co para a identificação dos animais positivos matriz. 
		Nota: Animais positivos matriz serão fluorescem de acordo com o Lino usado (i.e., animais expressando GCaMP serão fluorescência verde sob luz azul estimulação, enquanto RCaMP animais serão fluorescem vermelho sob estimulação verde). Marcadores de co injeção podem variar de outras proteínas fluorescentes, tais como a GFP e RFP, a marcadores fenotípicos, como o rol-6, ou podem resgatar um fenótipo dominante, como a mutação de pha-1 28.
		<ol><li>Se mexendo imediatamente antes do ensaio, escolher jovens adultos do sexo masculino. Se escolher o dia antes do ensaio, escolher machos larvas L4.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Imaging as respostas CEM a 1 µM ascr #3.
	<ol><li>Pick aproximadamente 20 L4 c. elegans machos (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; Pha-1 (e2123ts); -o-5 (e1490); Lite-1 (ce314)) que são positivos para expressão de marcador dsRed injeção co. 
		Nota: dsRed expressão dentro os neurônios do raio do conto masculino é mais fácil de observar e confirmar que GCaMP expressão dentro os quatro neurônios CEM.</li>
		<li>Isolar esses machos de hermafroditas em uma placa de ágar NGM semeado com um gramado de OP50 Escherichia coli para 5-14 h antes de realizar o experimento de imagem. 
		Nota: Os machos não isolados por um período mínimo de 5 h não respondem comportamentalmente a ascr #3 e, portanto, podem apresentar ainda menos transientes de cálcio para o ascaroside do que o observado aqui.</li>
	</ol></li></ol> 5. Carga animal Nota: ver refefence 1.
<ol><li>Escolher um verme em uma placa de ágar não-semeada NGM usando técnicas de manutenção padrão worm.
	<ol><li>Picareta vermes por em chamas uma picareta (feita de fio de platina achatado), escolhendo as bactérias para a escolha, e &#34; enxugando &#34; um verme para buscá-lo. Coloque delicadamente o verme na chapa de novo, permitindo-lhe sair por conta própria.</li>
	</ol></li> <li>Adicionar aproximadamente 5 mL de 1x S Basal para a placa não-semeada, tal que a placa está inundada.</li>
	<li>Desenhar a minhoca em uma seringa de carregamento (ou seja, seringa de 3 mL com tubo anexado) que tenha sido previamente enchida com 1 x Basal de S.
	<ol><li>Não se esqueça de chupar o worm só para o tubo, não todo o caminho para a seringa. 
		Nota: Se o worm viaja para a seringa, é quase impossível de recuperá-lo para o tubo.</li>
	</ol></li> <li>Desligar o vácuo para parar o fluxo girando a válvula de saída Luer.</li>
	<li>Retire o pino sólido bloqueando o worm Porto de carregamento</li>
	<li>Girar a válvula Luer conectada à porta de saída ( figura 1B), para que ele está descarregando. 
	Nota: Use um vídeo ao vivo alimentar ao carregar o worm para confirmar a localização e orientação do animal (etapas 5.8-5.13).</li>
	<li>Inserir o sem-fim do tubo para o worm Porto de carregamento de carga</li>
	<li>Suavemente aplique pressão na seringa até que o verme aparece no canal de carregamento.</li>
	<li>Se o worm começa a entrar no canal posição invertida, puxar o êmbolo da seringa para impedir a entrada do canal de worm.</li>
	<li>Interruptor entre aplicação e invertendo a pressão até que a cabeça entre o canal primeiro.</li>
	<li>Abrir o vácuo, girando a válvula de 3 vias Luer conectado à porta de saída para abri-lo a vácuo em vez de atmosfera.</li>
	<li>Pressionar manualmente, pressionando o êmbolo da seringa para orientar e coloque a cabeça de minhoca, tal que ele é exposto para o canal do fluxo de reserva, mas não tão longe que a cabeça pode circular livremente ( Figura 2 D-2E).</li>
</ol> 6. Estímulo e aquisição <ol><li>usando um software de código-fonte aberto microscopia, como Gerenciador de Micro, gravar, capturando imagens como uma pilha TIFF em 10 quadros/s usando a excitação de luz azul (470 nm) por 30 s.</li>
	<li>Definir a exposição no menu principal para 100 ms. <ol><li>aberto &#34; Acq multi D. &#34; no menu principal do software. Definir o &#34; número &#34; para &#34; 300, &#34; e o &#34; intervalo de &#34; para &#34; 0. &#34; clique &#34; adquirir! &#34; para adquirir o vídeo.</li>
	</ol></li> <li>Aplicar um pulso de s 10 do estímulo 5 s após iniciar a aquisição. Ajustar a duração da aplicação de estímulos como desejado.
	<ol><li>Depois de adquirir 5 s de vídeo, altere a válvula de 3 vias, controlando o buffer de controle de fluxo para aplicar o estímulo para o animal que está sendo testado. Clique no botão mais à esquerda no link da válvula ( figura 1B).</li>
		<li>Após 10 s de exposição de estímulo (este tempo pode ser ajustado como desejado pelo usuário), alterar o fluxo de buffers pressionando novamente o botão mais à esquerda no link válvula.</li>
	</ol></li> <li>Registro sob reserva somente até a janela de 30-s está completa para permitir que a fluorescência de Lino retornar à linha de base.</li>
	<li>Repetir como desejado. Espere 30 s entre o fim de aquisição e o início do próximo julgamento.</li>
</ol> 7. Análise de imagem <ol><li>abrir a pilha TIFF com o software open-source, ImageJ, arrastando o arquivo para a janela do ImageJ.</li>
	<li>Clique usando o cursor e arraste para definir a região de interesse (ROI) em torno do neurônio de interesse. Definir a região para incluir o soma do neurônio de interesse (como na Figura 3A).</li>
	<li>Plot z-pilha da intensidade da fluorescência do ROI através de pilhas clicando em Open-&#62; imagem - &#62; pilhas - &#62; traçar perfil do eixo z.</li>
	<li>Clique &#34; lista &#34; na janela que se abre. Clique em Editar - &#62; copiar para copiar os valores. Cole os valores em um programa de planilha.</li>
	<li>Analisar a fluorescência de fundo para cada pulso arrastando o ROI para uma região do verme que não contenha a expressão GCaMP.</li>
	<li>Realizar a subtração de fundo para cada pulso subtraindo o valor de fluorescência do fundo do valor de intensidade de fluorescência neurônio.</li>
	<li>ΔF/F 0 para cada quadro de cada pulso de calcular.
	<ol><li>F calcular 0 como o valor de intensidade média do ROI para primeiro 1 s da aquisição (por exemplo, quadros 1-10).</li>
		<li>Calcular ΔF/F 0 dividindo o valor subtraído de fundo para o quadro de interesse pelo valor calculado F 0.</li>
	</ol></li> <li>Repita para cada neurônio fotografada e cada pulso de estímulo.</li>
	<li>Dos neurônios com perfis de resposta consistente, como ASH, média de todos os pulsos para cada neurônio e calcular o SEM (como na Figura 2F).</li>
	<li>Plotar a média ΔF/F 0 com SEM ao longo do tempo para cada neurônio. 
	Nota: Neste caso, é prática comum incluir heatmaps das respostas neuronais individuais de cada julgamento também. Em neurônios que não exibem alterações consistentes em transientes de cálcio após a exposição a estímulos através de estimulações repetidas, ou em indivíduos diferentes 23, pode ser mais aplicável para mostrar traços de pulso individuais (como em a Figura 4). Consulte a discussão para obter detalhes sobre como determinar como exibir os dados.</li>
</ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+and+microinjection.">Transformation and microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li><li>C&#225;ceres, I. d. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laterally+Orienting+C.+elegans+Using+Geometry+at+Microscale+for+High-Throughput+Visual+Screens+in+Neurodegeneration+and+Neuronal+Development+Studies.">Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies.</a> PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).</li><li>Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Garc&#237;a, L. R., Portman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+for+sexually+dimorphic+and+sexually+divergent+behaviors+in+Caenorhabditis+elegans.">Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).</li><li>Clokey, G. V., Jacobson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autofluorescent+&amp;#34;lipofuscin+granules&amp;#34;+in+the+intestinal+cells+of+Caenorhabditis+elegans+are+secondary+lysosomes.">The autofluorescent &amp;#34;lipofuscin granules&amp;#34; in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes.</a> Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).</li><li>Coburn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthranilate+Fluorescence+Marks+a+Calcium-Propagated+Necrotic+Wave+That+Promotes+Organismal+Death+in+C.+elegans.">Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hub-and-spoke+circuit+drives+pheromone+attraction+and+social+behaviour+in+C.+elegans.">A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans.</a> Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).</li><li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+structure-specific+and+promiscuous+G-protein-coupled+receptors+mediates+small-molecule+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O chip olfativo macho-adaptado incorpora uma vez em um porto de carregamento mais estreito, o que permite maior controle da orientação e para a captura eficiente de masculino c. elegans. Isto permite a visualização de ambos os membros direito e esquerdos da neuronais pares bilaterais, sem a necessidade de empilhamento z. Esta curva leva a uma orientação longe vertical 100% do tempo em worms, onde destina-se apenas um par bilateral com um marcador fluorescente, como o ASH (Figura 2D</st...

Dispositivos microfluídicos fornecem maior acesso a precisamente ambientes controlados, onde animais, tais como o nemátodo c. elegans, pode ser manipulado experimentalmente1. Estes estudos incluem ensaios comportamentais, estudos de imagiologia de cálcio ou mesmo sessões de fenótipos específicos, resultando em medidas mais exatas de resultados experimentais1,2,3,4, 5,6. Microfluídica proporcionar condições líquidas em pequena escala, através do qual as experiências detalhadas podem ser executadas utilizando quantidades mínimas de reagentes. Há uma produção constante de novos designs de dispositivo microfluidic, e o uso de cada um varia, de arenas que permitem o movimento natural sinusoidal de c. elegans em ensaios comportamentais e estudos de imagiologia neurais, capturar dispositivos utilizados em imagiologia neural e estudos olfativos, dispositivos que permitem alta produtividade análise fenotípica em genética telas4,5,6,7. Após a fabricação de um molde mestre, dispositivos microfluídicos são baratos construir — dada a capacidade de reutilização do mestre — e fácil de usar, permitindo a geração de dados rápida, através de estudos de alto rendimento. Fabricação de dispositivos usando polímeros tais como polydimethylsiloxane (PDMS) permite a criação de novos dispositivos dentro de horas.
Estudos de imagiologia de cálcio usam indicadores de cálcio geneticamente codificado (GECIs) expressados em células-alvo para medir a dinâmica neural essas células em tempo real8,9,10,11. A natureza transparente da c. elegans permite a gravação dos níveis fluorescentes destas proteínas em animais vivos. Tradicionalmente, GECIs dependem da proteína verde fluorescente (GFP)-baseado sensor peptídeo GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), embora estudos mais recentes adaptaram estes sensores para permitir melhor relação sinal-ruído e perfis de excitação avermelhado. Após o desenvolvimento de GCaMP3, proteínas com estas especificações têm variado, incluindo sensores tais como GCaMP6s e GCaMP6f (lento e rápido fluorescência fora-taxas, respectivamente), bem como de peptídeo de RFP-calmodulina-M13 (RCaMP), que tem um avermelhado Perfil de ativação. A combinação destes GECIs com sequências de promotor de genes célula específica de c. elegans pode atingir células de interesse, neurônios sensoriais particularmente12,13,14,15 , 16.
Enquanto a facilidade de uso de c. elegans em estudos microfluídicos é aparente, quase todos os estudos têm incidido sobre hermafroditas. Apesar dos machos apenas contabilização de 0,01-0,02% da população de tipo selvagem, inestimáveis conclusões podem surgir de sua caracterização. Enquanto a conectoma física do sistema nervoso hermafrodita foi totalmente mapeada por décadas17, a conectoma masculina permanece incompleta, especialmente na região da cabeça do animal18. O uso de imagens de cálcio em machos vai ajudar a gerar uma compreensão do sistema nervoso masculino e as diferenças que surgem entre os dois sexos. O menor tamanho de c. elegans machos adultos evita armadilhas eficaz e confiável nos portos de carregamento dos tradicionais dispositivos olfativos projetados para maiores hermafroditas. Para resolver isso, uma versão modificada do Chip Olfactory Chronis19 foi desenvolvida com um porto de carregamento mais estreito, uma altura inferior do canal e se transforma no worm Porto de carregamento (que giram o animal), permitindo a visualização de esquerda/direita bilateral neuronais pares. Este projeto permite: (1) a captura efetiva de jovens adultos do sexo masculino, (2) uma orientação mais confiável do animal para a visualização de ambos os membros de neurônios emparelhados bilaterais e (3) a imagem precisa de atividade neural em neurônios masculinos.
Cada vez mais, estudos mostram que os machos de c. elegans respondem de forma diferente do que hermafroditas para uma variedade de ascarosides (ascr), ou o nematódeo pheromones20,21,22,23 ,24. Portanto, desenvolver uma compreensão da dinâmica neural e representações dentro a conectoma masculina tornou-se ainda mais pertinente. Masculino c. elegans contêm 87 neurônios específicos do sexo não está presentes no hermafrodita25,26, alterando a conectoma em como-maneiras ainda indeterminados. Sendo capaz de imagem essas dinâmicas neurais exclusivas nos permitirá compreender melhor respostas específicas do sexo e representações neurais.
Este protocolo descreve o uso de um chip olfativo macho-adaptado para a imagem neural de masculino c. elegans chemosensation. O neurônio nociceptivo que Ash responde confiantemente ao glicerol 1m em machos, consistentes com as anteriores hermafrodita estuda27. Exposição de ascarosides pode eliciar respostas que são variável de animal para animal, que requerem um maior número de animais a ser testado. A resposta dos neurônios CEM macho-específico anteriormente mostrou, através de eletrofisiologia e cálcio de imagem estudos, reagir variàvel ascaroside #323.

<table><tbody><tr><td>Silicon Wafer</td><td>University Wafer</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2035</td><td>MicroChem</td><td>Y111070-0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100-4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>Wafer Mask</td><td>Cad/Art Services</td><td>-</td><td>Custom order. Printed at 25,000 dpi.</td></tr><tr><td>Sylgard-184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm Dermal Punches</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P150</td><td></td></tr><tr><td>Soft Tubing</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-06419-01</td><td></td></tr><tr><td>Hard Tubing</td><td>IDEX Health &amp;amp; Science</td><td>1622</td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td>New England Small Tube</td><td>NE-1027-12</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Pins</td><td>New England Small Tube</td><td>0.415/0.425&quot; OD x .500 Long</td><td>Batch PB07027</td></tr><tr><td>3 mL syringes</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>30 mL syringes</td><td>Vitality Medical</td><td>302832</td><td>Used as buffer reservoirs.</td></tr><tr><td>Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer</td><td>Component Supply Company</td><td>NE-231PL-50</td><td></td></tr><tr><td>Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-30600-07</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Mercator Control System LF-5 Plasma System</td><td>Mercator</td><td>LF-5</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Tape</td><td>Scotch</td><td>BSN43575</td><td></td></tr><tr><td>Series 20 Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>P-2</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Desicator</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>420250000</td><td>24 cm inner diameter.</td></tr><tr><td>Weigh Boats</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-01017-27</td><td></td></tr><tr><td>Classic Plus Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1501-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipettes</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-25554-06</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Genesee Scientific</td><td>30-202</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Sheldon Manufacturing Inc</td><td>9120993</td><td>Model Number: 1500E.</td></tr><tr><td>60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes</td><td>TriTech Research</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.A1</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS</td><td>Hammamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Blue Fluorescent Light</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM6-LCR-SA</td><td>24-30V/7.9A DC.</td></tr><tr><td>Illumination Adaptor</td><td>Zeiss</td><td>423302-0000</td><td></td></tr><tr><td>Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve</td><td>Parker</td><td>001-0017-900</td><td>3-way valve for controlling flow.</td></tr><tr><td>ValveLink8.2&amp;reg;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>01-18</td><td>Flow Switch Controller</td></tr><tr><td>Micro Manager</td><td>Micro-Manager</td><td>-</td><td>Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>ImageJ</td><td>-</td><td>Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Agar, Bacteriological Grade</td><td>Apex</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Apex</td><td>20-260</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>BDH0224-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270741-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756-10(G)</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fluorescein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S-250mg</td><td>Light Sensitive. Store in photoprotective vials.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ascaroside #3</td><td>-</td><td>-</td><td>Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University).</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-215</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>BDH</td><td>BDH9268.25</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-025</td><td></td></tr><tr><td>ASH GCaMP3 line</td><td>-</td><td>-</td><td>CX10979 (KyEx2865 [p&lt;em&gt;sra&lt;/em&gt;-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library.</td></tr><tr><td>CEM GCaMP6 line</td><td>-</td><td>-</td><td>JSR49 (FkEx98[p&lt;em&gt;pkd&lt;/em&gt;-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; &lt;em&gt;pha&lt;/em&gt;-1(e2123ts); &lt;em&gt;him&lt;/em&gt;-5(e1490); &lt;em&gt;lite&lt;/em&gt;-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; (OP50)</td><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis&lt;/em&gt; Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>&quot;Reservoir&quot;</td><td>-</td><td>-</td><td>To create a Reservoir: A &quot;30 mL syringe&quot;, is connected to a &quot;Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile&quot;, which is connected to a &quot;3 mL syringe&quot; and a &quot;Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer&quot;. The &quot;Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer&quot; is then inserted into &quot;Soft Tubing&quot; approximately 1/3 of the way down the needle.</td></tr></tbody></table>

using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male c. elegans head neurons

A utilização de indicadores de cálcio tem bastante reforçada a nossa compreensão da dinâmica neural e regulamento. O nemátodo Caenorhabditis elegans, com sua anatomia transparente e completamente mapeado sistema nervoso apresenta um modelo ideal para a compreensão dinâmica neural em tempo real, usando indicadores de cálcio. Em combinação com tecnologias microfluídicos e projetos experimentais, estudos de geração de imagens de cálcio usando estes indicadores são realizados em animais em movimento livre e presos. No entanto, a maioria dos estudos anteriores utilizando dispositivos de captura, como o chip olfativo descrito no Chronis et al., têm dispositivos projetados para uso no hermafrodita mais comuns, como o macho menos comum é que ambos morfologicamente e estruturalmente dissimilares. Um chip adaptado olfativo foi projetado e fabricado para aumentar a eficiência no masculina imagem neuronal com o uso de animais jovens e adultos. Uma vez foi incorporada a minhoca porto para girar os animais e para permitir a separação dos neurônios individuais dentro de um par bilateral em 2D imagem de carregamento. Vermes são expostos a um fluxo controlado de odorante dentro do dispositivo microfluidic, conforme descrito em estudos anteriores de hermafrodita. Transientes de cálcio são então analisados utilizando o software open-source ImageJ. O procedimento descrito neste documento deverá permitir uma maior quantidade de macho com base em c. elegans cálcio estudos, aprofundar a nossa compreensão dos mecanismos de sinalização neuronal do sexo-específico de imagem.

Um exemplo de configuração do dispositivo global pode ser visto na figura 1A-B. Figura 1A mostra a construção do reservatório apropriado e instalação. A figura 1B mostra as conexões dos reservatórios para o dispositivo microfluidic. Figura 1 mostra um dispositivo microfluidic com portas individuais para maior clareza.
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Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Usando um Chip olfativo Microfluidic adaptado para a imagem da atividade Neuronal em resposta aos Pheromones em neurônios de cabeça masculino C. Elegans

O uso de um chip adaptado"olfativo" para a imagem de cálcio eficiente de machos de c. elegans é descrito aqui. Estudos de exposição masculino glicerol e um pheromone também são mostrados.

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

using-an-adapted-microfluidic-olfactory-chip-for-imaging-neuronal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

8.0K visualizações.  Worcester Polytechnic Institute. O uso de um chip adaptado"olfativo" para a imagem de cálcio eficiente de machos de c. elegans é descrito aqui. Estudos de exposição masculino glicerol e um pheromone também são mostrados.

Vídeo: Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Simples dispositivos microfluídicos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Bioengenharia

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neurociência

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Comportamento

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

<meta charset="utf8"></head><body>Extração e quantificação de respostas voláteis de feromônios sexuais em C. elegans

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and computations governing these signals remains an active area of research. The nematode Caenorhabditis elegans provides a powerful model for studying these processes as it produces a volatile sex pheromone. This pheromone is synthesized by virgin females or sperm-depleted hermaphrodites and serves as an attractant for males.
This protocol describes a detailed method for isolating the volatile sex pheromone from several C. elegans strains (WT strain N2, daf-22, and fog-2) and C. remanei. We also provide a protocol for quantifying the male chemotaxis response to the volatile sex pheromone. Our analysis utilizes measurements such as chemotaxis index (C.I.), arrival time (A.T.), and a trajectory plot to compare male responses under various conditions accurately. This method allows for robust comparisons between males of different genetic backgrounds or developmental stages. Furthermore, the experimental setup outlined here is adaptable to investigating other chemoattraction chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: examinando a influência volátil do feromônio sexual no comportamento masculino de C. elegans

This protocol establishes methods for extracting and quantifying responses to the volatile sex pheromone in C. elegans, providing tools to study chemical communication and navigation trajectory.

Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Usando um Chip olfativo Microfluidic adaptado para a imagem da atividade Neuronal em resposta aos Pheromones em neurônios de cabeça masculino C. Elegans

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Simples dispositivos microfluídicos para

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (

Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

Utilizando um dispositivo microfluídica para estimulação mecânica e alta resolução de imagem de c. elegans