이 연구는 기본 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 사역의 과학, ICT와 미래 계획 (NRF 2014R1A1A2057527 및 NRF-2016R1D1A1B03934418)에 의해 지원 되었다.

1. 구멍을 통해 배열 알루미늄 판과 자석 배열 준비
<ol><li>준비 하는 2 개의 50 m m x 50 m m (또는 더 큰) 알루미늄 플레이트. 각 플레이트의 두께 구슬 직경의 절반은 300 µ m 이었다.입니다.</li>
	<li>Φ550 µ m 마이크로 드릴 조금 30 m m/s 하락 속도와 스핀 들 속도 8000RPM CNC 로타리 조각 사를 사용 하 여 알루미늄 접시 중 하나에서 30 x 30을 통해 구멍 배열을 형성 한다. 각 구멍 (센터에 센터) 사이의 거리는 1 m m (그림 1a 및 그림 2a, 나) 이었다.</li>
	<li>다른 알루미늄 접시에, 1.2 (그림 1a 및 그림 2a, ii)에 설명 된 것과 동일한 절차를 사용 하 여 구멍을 통해 Φ750 µ m의 30 x 30 배열을 형성 합니다.</li>
	<li>스티커 테이프를 사용 하 여 서로 두 접시를 연결 하 고 Φ3 mm 맞춤 구멍 두 알루미늄 판의 네 모서리의 각을 형성.</li>
	<li>12 h 그들의 표면 청소를 위해 15% 황산 알루미늄 플레이트를 담근 다. 때문에 알루미늄의 표면에 알루미늄 산화물의 얇은 층에 게 저항 하는 부식, 구멍 직경 및 판의 두께이 산 성 처리에 의해 변경 되지 않습니다.</li>
	<li>30 × 30 배열 1 x 1 x 1 m m 네오디뮴 자석 (0.363 N의 자석 힘)을 형성 한다. 각 자석 이웃에 반대 극성 인지 확인 합니다. 속보 또는 자석 배열의 산란을 방지 하기 위해, 자석 배열 더블 양면 테이프 (그림 2a, iii와에 삽입 된 그림 2)를 사용 하 여 아래쪽으로 30 x 30 m m 알루미늄 플레이트를 연결 합니다.</li>
</ol>2. 구슬 트랩 프로세스
<ol><li>정렬 하 고 스택 두 알루미늄 접시 (접시 탑: 750 µ m 구멍 판, 바닥판: 550 µ m 홀 플레이트) 준비 맞춤 구멍을 사용 하 여 각 접시 (그림 1b)의 네 모퉁이에서.</li>
	<li>정렬 구멍에 M3 볼트를 삽입 하 여 두 접시를 함께 고정 하 고 고정 볼트와 너트 (그림 1b).</li>
	<li>알루미늄 플레이트 어셈블리 (그림 1b, 2b, 2 c) 준비 자석 배열에 스택. 쌓기 과정에서 자석의 배열 및 알루미늄 플레이트에 구멍의 배열을 맞춥니다. 다음 끈 적 테이프를 사용 하 여 자석 배열 위치를 해결 하기.</li>
	<li>충분 한 수 Φ600 SUJ2 철강의 플레이트 어셈블리에 비즈 고 아크릴 (또는 비-금속)를 사용 하 여 구슬을 조작 같은 구슬 동안 각 구멍 (그림 1c, 1d, 1e)에 동시에 갇혀 된다 접시 제거 하지 구멍에 박 혀 있는 초과 구슬.</li>
	<li>조심 스럽게 제거 원치 않는 산란과 갇혀 구슬 (그림 1 층)의 탈을 피하기 위해 상단 플레이트.</li>
</ol>3. 오목 microwell 제조
<ol><li>오목 microwell 형, 페 트리 접시 위에, 단계 2.1 ~ 2.5에서에서 생산을 이동 합니다.</li>
	<li>PDMS 단위체입니다 (PDMS) 단위체와 제조 업체의 지침19 에 따라 경화제 혼합: 경화 에이전트의 비율은 10:1.</li>
	<li>PDMS 혼합물에 갇혀 모든 거품을 제거 하는 desiccator 및 진공 펌프를 사용 하 여 탈 가스 PDMS 혼합물.</li>
	<li>오목 microwell 형으로 PDMS 혼합물을 부 어와 드 가스 3.3 (그림 1 층)에 설명 된 것과 동일한 절차를 사용 하 여 다시.</li>
	<li>구슬 포함 된 PDMS 기판 (그림 1 g)를 2 시간에 80 ° C에서 열판에 PDMS 혼합물을 구워.</li>
	<li>치료 PDMS 기판 형 (그림 1 g)에서 제거 합니다. 제거 과정에서 메탄올 세척 병을 사용 하 여 금형에서 PDMS 기판 분리 하 스프레이.</li>
	<li>M m x 2mm 자석 Φ15를 사용 하 여, PDMS 기판 (그림 1 h)에서 갇혀 강철 구슬을 제거 합니다. 이 프로세스에 대 한 PDMS 기판에서 구슬 추출 하 충분히 강하다 어떤 자석 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 회전 타원 체 문화
<ol><li>이 연구에서 24-잘 접시에 장착 Φ14 m m 생 검 펀치를 사용 하 여 오목 microwell 꽃무늬 PDMS 기판 절단.</li>
	<li>결과 Φ14 m m PDMS 기판 121 ° C와 15 psi에서 고압 소독 기에 소독.</li>
	<li>멸 균된 PDMS 기판을 24 잘 접시에 놓습니다.</li>
	<li>Microwell 표면에 세포 부착을 방지 하기 위해 하룻밤 사이 4% (w/v) pluronic F-127 솔루션 전체 PDMS 기판 코트. 코팅 과정 pipetting 하거나 초음파 세탁 기술자를 사용 하 여 오목 microwells에 갇힌 모든 기포를 제거 합니다.</li>
	<li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 사용 하 여 F-127 솔루션 세 번을 플러시.</li>
	<li>PDMS 기판에 셀-매체 (Dulbecco의 수정이 글 중간) 솔루션 (2 x 106 셀 포함) 하의 1 mL 씨앗 Note 시드 밀도 대상 회전 타원 체 크기 및 대상 셀 형식에 따라 변경 될 수 있습니다. 여기, 지방 유래 줄기 세포 (ASC) 사용 되었다.</li>
	<li>Microwells (그림 3)에 갇혀 있던 어떤 과잉 세포를 제거 하는 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 매체의 1 mL 발음</li>
	<li>36.5 ° c, 습도의 세포를 품 어 > 95%와 5% CO2 상태. 우리의 연구에 사용 된 ASCs 경우 셀 48 h에서 회전 타원 체를 집계.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Djordjevic, B., Lange, C. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwell-mediated+micro+cartilage-like+tissue+formation+of+adipose-derived+stem+cell.">Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell.</a> Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. 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저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

이 제조 방법은 직면 주요 도전 알루미늄 플레이트의 구멍을 통해 배열에 구슬의 보안 수정 했다. 이 문제를 해결 하기 위해 30 x 30 자석 배열 형식에서 자력 구슬을 안전 하 게, 그림 6 과 7에서 같이 해결 하기 위해 사용 되었다. 자 속 밀도 반대 극성, 자석 배열의 각 자석 표면의 중심에 강한입니다. 자기 힘의 강도 자 속 밀도에 따라 달라 집니다, 때문에 그들은 위치에 열...

회전 타원 체 모양으로 성장 하는 세포는 2 차원 평면 문화1보다 본문에 실제 조직에 더 비슷합니다. 이 이점을 감안할 때, spheroids 사용 하 여 셀에 셀 상호 작용2,3, 면역 활성화4,5및 차별화6심사 약 연구를 개선 하기 위해 채택 되었습니다. 또한, 여러 셀 유형을 통합 하는 spheroids는 최근 organoids (근처 생리 3 차원 (3D) 조직), 인간 개발 및 질병7공부에 대 한 매우 유용한에 적용 되었습니다. 여러 가지 방법 spheroids을 생산 하기 위해 사용 되었습니다. 간단한 방법은 서로와 양식 spheroids 셀 집계 되도록 비 접착 표면에의 활용을 포함 한다. 페 트리 접시 소 혈 청 알 부 민, pluronic F-127, 또는 그것의 표면 비 접착제89을소수 성 고분자 (예: 폴 리 2 hydroxyethl 메타 크리 레이트) 치료 될 수 있습니다. 회전자-플라스 크 방법은 spheroids10,11의 다량 생산의 또 다른 잘 알려진 수단입니다. 이 방법에서는, 세포는 기판에 부착 되 고에서 그들을 방지 하기 위해 교 반에 의해 서 스 펜 션에서 개최 됩니다. 대신, 부동 집계 양식 spheroids 세포. 비 접착 표면 방법 및 회전자 플라스 크 방법 spheroids의 큰 금액을 생성할 수 있습니다. 그러나, 그들은 회전 타원 체 크기 뿐만 아니라 추적 제어와 각 회전 타원 체의 모니터링을 포함 하 여 제한 될 수 있습니다. 같은 문제, 다른 회전 타원 체 생산 방법에 대 한 구제 수단으로 서 즉, 교수형 드롭 방법 고용된12될 수 있습니다. 문화 접시의 뚜껑의 밑바닥에 세포 현 탁 액 방울을 입금 해야 합니다. 이러한 방울 일반적으로 크기에서 15 ~ 30 µ L 이며, 약 300 ~ 3000 셀13를 포함. 뚜껑을 거꾸로 때 물방울 표면 장력에 의해 장소에서 개최 됩니다. 각 드롭에 microgravity 환경 다음 무료 액체 공기 인터페이스에서 단일 spheroids 형성 세포에 집중 한다. 교수형의 혜택 드롭 메서드는 추적 하 고 모니터링 각 회전 타원 체 비 접착 표면 및 회전자 플라스 크 방법에 상대적으로 쉬운 반면 잘 제어 된 크기 분포, 제공. 그러나이 메서드 spheroids 및 생산 과정 자체의 대규모 생산은 지나치게 노동 1 개의 불리를 초래 하는, 집중.
Microwell 배열은 아파트 많은 마이크로 크기 웰 스, 직경 100에서 1000 µ m에 이르는 데 각 접시. Microwells를 사용 하는 경우 회전 타원 체 생산 원리는 비 접착 표면 메서드의 비슷합니다. 장점은 microwells 셀 또는 spheroids, 그것은 또한 쉽게 각 단일 회전 타원 체를 모니터링 하는 동안 회전 타원 체 크기를 제어 하기 쉬운 그런 분리를 위한 microwells 사이 공간을 제공 하는 사실. Microwells의 다 수, 높은 처리량 회전 타원 체 생산도 가능 하다. Microwells의 또 다른 장점은 다양 한 도형 형태 웰 스 옵션입니다 (육각, 원통형, 로그인 프리즘) 사용자의 독특한 실험 목적에 따라. 그러나 일반적으로,, 3 차원 (3D) 오목한 (또는 반구형) 모양 제복 크기의 단일 spheroids 생산을 위한 가장 적합 한 것으로 간주 됩니다. 따라서, 오목 microwells의 유용성 보고 되었습니다 검토 하는14, 배아 줄기 세포 cardiomyocyte 차별화 등 많은 세포 생물학 연구에 대 한 작은 섬 세포의 인슐린 분 비15, 클러스터는 hepatocytes16, 그리고 종양 spheroids17의 약물 내성의 효소 활동.
불행히도, 종종 microwells의 제조 필요 전문된 micropatterning 시설; 기존의 포토 리소 그래피 기반 방법 플라즈마와 이온 빔 장비를 필요 하는 반응성 이온 에칭-기반 방법 노출 및 개발 시설 필요 합니다. 이러한 장비는, 복잡 한 제조 공정에 함께 선물 항목에 높은 장벽이 microtechnology에 대 한 액세스 권한이 없는 생물학에 대 한 비용이 많이 드는. 이러한 문제를 해결 하려면 다른 비용 효율적인 방법을 같은 얼음 리소 그래피18 (냉동된 물 방울을 사용 하 여) 하 고 (막, 스루홀 기판 및 진공을 사용 하 여) 유연한 막 방법14 제안 되었습니다. 그러나, 이러한 방법 또한 패턴 크기, 높은 종횡비의 달성 및 더 큰 지역 microwells의 생산을 통제 하기 어려운 되 고 같은 심각한 단점이 발생 합니다.
위의 문제를 해결 하려면 우리 소설 오목 microwell 제조 방법은 스루홀 기판, 강철 구슬, 자석 배열 활용 제안 됩니다. 이 메서드를 사용 하 여, 오목 구면 microwells의 수백 포스를 이용한 자석 자동 폐쇄 금속 구슬 (그림 1)의 메커니즘을 활용 하 여 날조 될 수 있다. 제조 공정 거의 복잡 하 고 비싼 시설의 사용을 포함 하 고 많은 고급 능력을 요구 하지 않습니다. 따라서, 심지어 미숙한 사람이 제조 방법을 수행 쉽게 수 있습니다. 설명 하기 위해 제안된 된 방법, 인간 지방 유래 줄기 세포 생산 spheroids 오목 microwells에서 경작 되었다.

<table><tbody><tr><td>CNC rotary engraver</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>Micro drill bit</td><td>HAM Pr&amp;auml;zision</td><td>30-1301 TA</td><td>&amp;Phi; 0.55 and 0.75 mm</td></tr><tr><td>Sulfuric acid 98%</td><td>Daejung</td><td>7683-4100</td><td>For cleaning aluminum plate.&lt;br/&gt; Dilute with distilled water with 15% solution</td></tr><tr><td>Neodymium magnet</td><td>Supermagnete</td><td>W-01-N</td><td>1 x 1 x 1 mm</td></tr><tr><td>Bearing ball</td><td>Agami Modeling</td><td>SUJ2</td><td>&amp;Phi; 600 &amp;mu;m steel bead</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>p2443</td><td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle&#039;s medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Adipose-derived mesenchymal stem cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-500-011</td><td></td></tr></tbody></table>

a paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries

회전 타원 체 문화는 vivo에서제공 한다는 세포 행동을 이해 하기 위한 유용한 도구입니다-3 차원 환경 처럼. 다양 한 회전 타원 체 생산 방법 비 접착 표면, 스피너 플라스 크, 매달린 방울 및 microwells 셀 상호 작용, 면역 활성화, 심사, 마약의 연구에 사용 된 줄기 세포 분화 및 organoid 세대. 이러한 방법 중에서 3 차원 오목 형상 가진 microwells 과학자와 엔지니어, 균일 크기의 회전 타원 체 생성 및 개별 spheroids의 응답 될 수 있는 용이성의 그들의 이점을 주어진의 관심을 얻고 있다 모니터링. 유연한 막 및 얼음 리소 그래피의 사용과 같은 비용 효율적인 방법을 제안 되었습니다, 비록 이러한 기술을 높은 종횡비의 공적 및 생산의 패턴 크기 조절에 어려움 등 심각한 단점이 발생 microwells의 더 큰 지역입니다. 이러한 문제를 해결 하려면 복잡 한 높은 비용 시설에 대 한 필요 없이 오목 microwells 조작 하는 강력한 방법을 제안 한다. 이 방법을 활용 하 여 30 x 30를 통해 구멍 배열, 몇 백 마이크로미터-주문 강철 구슬, 및 3 c m x 3 c m입니다 (PDMS) 기판에 900 microwells 조작 하 자기 힘. 세포 생물학 응용 프로그램을 우리의 방법의 적용을 보여 우리는 3 일에 대 한 지방 줄기 세포를 배양 하 고 성공적으로 우리의 microwell 플랫폼을 사용 하 여 spheroids를 생산. 또한, 우리는 그것에 의하여 자기 힘을 통해-구멍에 강철 구슬 트랩 사용 메커니즘을 조사 하는 magnetostatic 시뮬레이션 수행. 우리는 제안 된 microwell 제조 방법 약물 검사, 조직 재생, 줄기 세포 분화, 암 전이 등 많은 회전 타원 체 기반 세포 연구에 적용할 수 있습니다 믿습니다.

볼록 형 및 microwell 패턴 성공적으로 다음 단계 2.1 3.7에 의해 조작 했다. (그림 4)입니다. 상업 강철 구슬 30 x 30을 통해 구멍 배열에 갇혀 있었다. 구슬 구슬 및 해당 통해-구멍 (그림 4a) 사이 간격 없이 밀접 하 게 개최 했다. 조작된 오목 microwell의 모양 강철 구슬 (그림 4b)의 동일은 600 µ m의 직경을 가진 반구...

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A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

이 원고는 복잡 한 높은 비용 시설에 대 한 필요 없이 오목 microwells 조작 하는 강력한 방법을 소개 합니다. 자기 힘, 강철 구슬, 및 구멍을 통해 배열을 사용 하 여, 몇 백 microwells 3 c m x 3 c m입니다 (PDMS) 기판에 형성 되었다.

쌍된 구슬 및 Microwells 가변 오목한 형상의 성형에 대 한 자석 배열

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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8.6K 조회수.  Chung-Ang University. 이 원고는 복잡 한 높은 비용 시설에 대 한 필요 없이 오목 microwells 조작 하는 강력한 방법을 소개 합니다. 자기 힘, 강철 구슬, 및 구멍을 통해 배열을 사용 하 여, 몇 백 microwells 3 c m x 3 c m입니다 (PDMS) 기판에 형성 되었다.

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Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is particularly useful for separations applications. Porous polydimethylsiloxane (PDMS) beads can be produced by heat-curing such an emulsion, allowing the interface between the aqueous and aliphatic phases to mold the morphology of the polymer. In the procedures described here, both polymer and crosslinker (triethoxysilane) are sonicated together in a cold-bath sonicator. Following a period of cross-linking, emulsions are added dropwise to a hot surfactant solution, allowing the aqueous phase of the emulsion to separate, and forming porous polymer beads. We demonstrate that this method can be tuned, and the SAV ratio optimized, by adjusting the electrolyte content of the aqueous phase in the emulsion. Beads produced in this way are imaged with scanning electron microscopy, and representative SAV ratios are determined using Brunauer&#8211;Emmett&#8211;Teller (BET) analysis. Considerable variability with the electrolyte identity is observed, but the general trend is consistent: there is a maximum in SAV obtained at a specific concentration, after which porosity decreases markedly.

Procedures used to generate microstructured concave-porosity polydimethylsiloxane beads are presented. Effects of electrolyte concentration and identity within the aqueous phase are particularly emphasized.

오목 다공성 PDMS 비즈의 마이크로 버블 제작

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

연구

화학

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious approach of pipetting an arbitrary number of cells into well plates. The interactions between the stem cells forced into close proximity of one another promotes the generation of the EBs. Because the media in each of the wells has to be manually exchanged every day, this approach is manually intensive.
Moreover, because environmental parameters including cell-cell, cell-soluble factor interactions, pH, and oxygen availability can be functions of EB size, cell populations obtained from traditional hanging drops can vary dramatically even when cultured under identical conditions. Recent studies have indeed shown that the initial number of cells forming the aggregate can have significant effects on stem cell differentiation. We have developed a simple, rapid, and scalable culture method to load pre-defined numbers of cells into microfabricated wells and maintain them for embryoid body development. Finally, these cells are easily accessible for further analysis and experimentation. This method is amenable to any lab and requires no dedicated equipment. We demonstrate this method by creating embryoid bodies using a red fluorescent mouse cell line (129S6B6-F1).

We show a simple and rapid method to load pre-defined numbers of cells into microfabricated wells and maintain them for embryoid body development.

방울을 공중 Shrinky - 딩크 : Embryoid 기관 폼 문화하는 간단한 방법

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious ...

생물학

Creating Sub-50 Nm Nanofluidic Junctions in PDMS Microfluidic Chip via Self-Assembly Process of Colloidal Particles

Polydimethylsiloxane (PDMS) is the prevailing building material to make microfluidic devices due to its ease of molding and bonding as well as its transparency. Due to the softness of the PDMS material, however, it is challenging to use PDMS for building nanochannels. The channels tend to collapse easily during plasma bonding. In this paper, we present an evaporation-driven self-assembly method of silica colloidal nanoparticles to create nanofluidic junctions with sub-50 nm pores between two microchannels. The pore size as well as the surface charge of the nanofluidic junction is tunable simply by changing the colloidal silica bead size and surface functionalization outside of the assembled microfluidic device in a vial before the self-assembly process. Using the self-assembly of nanoparticles with a bead size of 300 nm, 500 nm, and 900 nm, it was possible to fabricate a porous membrane with a pore size of ~45 nm, ~75 nm and ~135 nm, respectively. Under electrical potential, this nanoporous membrane initiated ion concentration polarization (ICP) acting as a cation-selective membrane to concentrate DNA by ~1,700 times within 15 min. This non-lithographic nanofabrication process opens up a new opportunity to build a tunable nanofluidic junction for the study of nanoscale transport processes of ions and molecules inside a PDMS microfluidic chip.

We propose a simple self-assembly technique of silica colloidal nanoparticles to create a nanofluidic junction between two microchannels in polydimethylsiloxane (PDMS). Using this technique, a nanoporous bead membrane with a pore size down to ~45 nm was built inside a microchannel and applied to electrokinetic preconcentration of DNA samples.

콜로이드 입자의 자기 조립 과정을 통해 PDMS 미세 유체 칩의 하위 50 Nm의 나노 유체 접합 만들기

Polydimethylsiloxane (PDMS) is the prevailing building material to make microfluidic devices due to its ease of molding and bonding as well as its ...

공학

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

스퀴지 기반의 조립 방법과 생체막 마이크로 어레이의 형성

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

생체공학

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

포토 리소그래피에 의해 고분자 미세 바늘 어레이 제작

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Micropost 배열에 쉽고 정확한 - 기계 프로파일

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or complicated equipment, making fabrication costly and incompatible with mass production, which is one of the most important preconditions for point-of-care tests (POCT) to be adopted in low-resource settings. This work describes the fabrication process of an acrylic (polymethylmethacrylate, PMMA) device for nanoparticle-conjugated enzymatic immunoassay testing using the computer numerical control (CNC) micromilling technique. The functioning of the microfluidic device is shown by performing an immunoassay to detect a commercial antibody using lysozyme as a model antigen conjugated to 100 nm magnetic nanoparticles. This device integrates a physical staggered restriction of only 5 &#181;m in height, used to capture magnetic microparticles that make up a magnetic trap by placing an external magnet. In this way, the magnetic force on the immunosupport of conjugated nanoparticles is enough to capture them and resist flow drag. This microfluidic device is particularly suitable for low-cost mass production without the loss of precision for immunoassay performance.

Microfluidics is a powerful tool for the development of diagnostic tests. However, expensive equipment and materials, as well as laborious fabrication and handling techniques, are often required. Here, we detail the fabrication protocol of an acrylic microfluidic device for magnetic micro- and nanoparticle-based immunoassays in a low-cost and simple-to-use setting.

컴퓨터 수치 제어 자기 나노 입자 기반 면역 분석에 대한 엇갈린 제한이있는 미세 유체 아크릴 장치의 마이크로 밀링

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or ...

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

힘에 민감한 요소에 대한 나노 역학 측정을 위한 고속 자기 핀셋

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

생화학

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...