Diese Forschung wurde durch das grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunft planen (NRF-2014R1A1A2057527 und NRF-2016R1D1A1B03934418) unterstützt.

1. Vorbereitung der Durchgangsbohrung Array Aluminium-Platte und Magnet-array
<ol><li>Bereiten Sie zwei 50 mm x 50 mm (oder größer) Aluminium-Platten. Die Dicke jeder Platte war 300 µm, die Hälfte des Durchmessers Perle ist.</li>
	<li>Bilden Sie ein 30 x 30 Durchgangsbohrung Array auf einem Aluminium-Platten mit einer CNC-Dreh Stecher mit einem Φ550-µm Mikro Bohrer mit 30 mm/s Sprung und 8000 u/min der Spindeldrehzahl. Der Abstand zwischen jedem Loch (Mitte zu Mitte) war 1 mm (Abb. 1a und Figur 2a, ich).</li>
	<li>Bilden Sie ein 30 x 30-Array von Φ750-µm Durchgangsbohrungen auf andere Aluminium-Platte, mit dem gleichen Verfahren wie in 1.2 (Abbildung 1a und Figur 2a, Ii) beschrieben.</li>
	<li>Befestigen Sie den beiden Platten aufeinander mit einem Klebeband und bilden Sie Φ3 mm Achse Löcher an jeder der vier Ecken der beiden Aluminiumplatten.</li>
	<li>Genießen Sie die Aluminiumplatten in 15 % Schwefelsäure für 12 h zu ihren Oberflächen zu reinigen. Da die dünne Schicht aus Aluminiumoxid auf die Oberfläche des Aluminiums machen es korrosionsbeständig, werden der Lochdurchmesser und der Dicke der Platte durch diese Säurebehandlung nicht geändert.</li>
	<li>Bilden Sie eine 30 × 30 Array von 1 x 1 x 1 mm-Neodym-Magneten (mit einer Magnetfeldstärke von 0.363 N). Sicherstellen Sie, dass jeder Magnet entgegengesetzter Polarität zu seinen Nachbarn. Zur Vermeidung von Bruch oder Streuung des Arrays Magnet befestigen Sie eine 30 x 30 mm Alu-Platte an der Unterseite des Magnet-Arrays mit doppelseitigem Klebeband (Abb. 2a, Iii und Einschub in Abbildung 2).</li>
</ol>(2) Perle Trapping Prozess
<ol><li>Ausrichten und Stapeln zwei Aluminiumplatten (top-Platte: 750-µm-Lochscheibe, Bodenplatte: 550-µm-Lochplatte) mit den vorbereiteten Ausrichtung Löcher an den vier Ecken der jede Platte (Abbildung 1 b).</li>
	<li>Sperren Sie die beiden Platten zusammen durch Einfügen von M3 Schrauben in die Löcher der Ausrichtung, und befestigen Sie die Schrauben mit Muttern (Abbildung 1 b).</li>
	<li>Stapeln Sie die Aluminium Platte Versammlung auf dem vorbereiteten Magnet-Array (Abbildung 1 b, 2 bund 2 c). Das Array von Magneten und das Array von Durchgangsbohrungen in die Aluminiumplatte während des stacking-Prozesses ausrichten. Verwenden Sie ein Klebeband, um die Position des Magneten Arrays zu fixieren.</li>
	<li>Ort, eine ausreichende Anzahl von Φ600 mm SUJ2 Stahl Perlen auf der Platte-Versammlung und manipulieren die Perlen mit einem Acryl (oder nicht-metallischen) Platte so, dass eine Perle in jedes Loch (Abbildung 1 c, 1Dund 1e) während gleichzeitig gefangen wird Entfernen der überschüssigen Perlen, die nicht in die Löcher gestellt haben.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die obere Platte zur Vermeidung unerwünschter Streuung und Dislokation der eingeschlossenen Perlen (Abb. 1f).</li>
</ol>(3) konkav Microwell-Fertigung
<ol><li>Verschieben Sie die konkave Microwell Form, produziert in Schritte 2.1 bis 2.5, oben auf einer Petrischale.</li>
	<li>Polydimethylsiloxan (PDMS) Monomer und Härtemittel gemäß des Herstellers Anweisungen19 mit einem PDMS-Monomer mischen: Heilung von Agent-Verhältnis von 10:1.</li>
	<li>De-Gas die PDMS-Mischung mit einem Exsikkator und Vakuumpumpe, um gefangen in der PDMS-Mischung Bläschen zu entfernen.</li>
	<li>Die PDMS Mischung in die konkave Microwell-Form und de-Gas wieder mit dem gleichen Verfahren wie in 3.3 (Abb. 1f) beschrieben.</li>
	<li>Backen Sie die PDMS-Mischung auf einer Herdplatte bei 80 ° C für 2 h um eine Perle eingebettet PDMS Substrat (Abbildung 1 g) zu bilden.</li>
	<li>Entfernen Sie das ausgehärtete PDMS-Substrat aus der Form (Abbildung 1 g). Sprühen Sie entfernen dabei Methanol mit waschen Flasche PDMS Substrat aus der Form lösen.</li>
	<li>Mit einem Φ15 mm x 2 mm Magnet eingeschlossenen Stahlkügelchen von PDMS-Substrat (Abbildung 1 h) entfernen. Dabei kann jeder Magnet, die ausreichend stark, extrahieren Sie die Perlen aus dem PDMS-Substrat verwendet werden.</li>
</ol>4. Sphäroid Kultur
<ol><li>Schneiden Sie das konkave Microwell-gemusterten PDMS Substrat mithilfe einen Φ14-mm-Biopsie-Punch in 24-Well-Platte in dieser Studie eingesetzt werden.</li>
	<li>Das daraus resultierende Φ14 mm PDMS Substrat in einem Autoklav Sterilisator bei 121 ° C und 15 Psi zu sterilisieren.</li>
	<li>Legen Sie die sterilisierte PDMS-Substrat in einer 24-well-Platte.</li>
	<li>Bestreichen Sie das gesamte PDMS-Substrat mit 4 % (w/V) Pluronic F-127 Lösung über Nacht Zellhaftung an die Microwell-Oberfläche zu verhindern. Während des Beschichtungsprozesses entfernen Sie Luftblasen eingeschlossen in der konkaven Mikrovertiefungen durch Pipettieren oder mithilfe eines Ultraschall-Reinigers.</li>
	<li>Spülen Sie die F-127-Lösung dreimal mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Samen Sie 1 mL der Lösung (enthält 2 x 106 Zellen) Zelle-Medium (Dulbeccos geändert Eagle Medium) auf dem PDMS-Substrat. Beachten Sie, dass die Aussaatdichte je nach Zielgröße Sphäroid und/oder Ziel-Handy-Typ geändert werden kann. Hier wurden Fettgewebe Stammzellen (ASC) verwendet.</li>
	<li>Aspirieren Sie 1 mL des Mediums mit einer 1000 µL Pipette, entfernen alle überschüssigen Zellen, die nicht gefangen wurden in Mikrovertiefungen (Abbildung 3).</li>
	<li>Inkubation der Zellen bei 36,5 ° C, Luftfeuchtigkeit von > 95 % und 5 % CO2 Zustand. Im Falle der ASC in unserer Studie verwendeten aggregieren die Zellen auf ein Sphäroid in 48 h.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Djordjevic, B., Lange, C. 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A., Andreesen, R., Kreutz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brave+little+world:+spheroids+as+an+in+vitro+model+to+study+tumor-immune-cell+interactions.">Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions.</a> Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+multicellular+tumor+spheroid+model+using+microencapsulation+and+its+application+in+anticancer+drug+screening+and+testing.">Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing.</a> Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).</li><li>Kim, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwell-mediated+micro+cartilage-like+tissue+formation+of+adipose-derived+stem+cell.">Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell.</a> Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+large-scale+formation+of+porcine+hepatocyte+spheroids+in+a+novel+spheroid+reservoir+bioartificial+liver.">Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver.</a> Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).</li><li>Lazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+liver-specific+functions+of+porcine+hepatocyte+spheroids+entrapped+in+collagen+gel.">Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concave+microwell+based+size-controllable+hepatosphere+as+a+three-dimensional+liver+tissue+model.">Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model.</a> Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).</li><li>Yeon, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+concave+microwells+to+pancreatic+tumor+spheroids+enabling+anticancer+drug+evaluation+in+a+clinically+relevant+drug+resistance+model.">Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model.</a> PloS one. 8 (9), (2013).</li><li>Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-lithographic+fabrication+of+concave+microwells+and+a+microfluidic+network.">Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network.</a> Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).</li><li>Corning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. , (2008).</li><li>Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+and+culturing+of+single+microalgae+cells,+and+retrieval+of+colonies+using+a+perforated+hemispherical+microwell+structure.">Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure.</a> RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).</li><li>Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+PDMS+microlens+array+by+digital+maskless+grayscale+lithography+and+replica+molding+technique.">Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique.</a> Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+multi-level+microchannel+fabrication+by+pseudo-grayscale+backside+diffused+light+lithography.">Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography.</a> RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+3D+hair+follicle-like+hydrogel+by+soft+lithography.">Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography.</a> J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).</li><li>Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+organoid+culture+of+rat+hepatocytes+and+HepG2+cells.">Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells.</a> J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Die größte Herausforderung für dieses Herstellungsverfahren wurde die sichere Befestigung der Perlen in der Durchgangsbohrung-Array in der Aluminiumplatte. Um diese Herausforderung zu bewältigen, wurde Magnetkraft in Form eines Arrays von 30 x 30 Magnet verwendet, um die Perlen fest, wie in Abbildung 6 und 7zu beheben. Die magnetische Flussdichte des Magnet-Arrays, die entgegengesetzten Polarität hat, ist am stärksten in der Mitte der einzelnen Magnetoberfläche. Da die Stärke der...

Zellen in einem Sphäroid Form gewachsen sind vergleichbar mit echten Gewebe im Körper als eine zweidimensionale planare Kultur1. Angesichts dieser Vorteil, ist die Verwendung von Sphäroide angenommen worden, um die Untersuchung von Zelle zu Zelle Interaktion2,3, immun-Aktivierung4, Drogen-screening-5und Differenzierung6zu verbessern. Darüber hinaus wurden Sphäroide Einbeziehung mehrerer Zelltypen vor kurzem auf Organellen (in der Nähe von physiologischen dreidimensionale (3D) Gewebe) angewendet, die sehr nützlich für das Studium der menschlichen Entwicklung und Krankheit7sind. Verschiedene Methoden wurden zur Sphäroide zu produzieren. Die einfachste Methode beinhaltet die Verwendung einer nicht klebenden Oberfläche, so dass die Zellen untereinander und Form Sphäroide aggregieren. Eine Petrischale können mit Rinderserumalbumin, Pluronic F-127 oder eine hydrophobe Polymer (z.B. Poly-2-Hydroxyethl-Methacrylat) zu seiner Oberfläche nicht klebend89behandelt werden. Die Spinner-Kolben-Methode ist eine weitere bekannte Mittel zur Herstellung großer Mengen an Sphäroide10,11. Bei dieser Methode werden Zellen von rühren zu verhindern, dass sie immer auf dem Untergrund befestigt in der Schwebe gehalten. Stattdessen, den schwimmenden Zellen Aggregat Form Sphäroide. Sowohl der nicht klebenden Oberfläche Methode und Spinner Kolben produzieren große Mengen an Sphäroide. Sie unterliegen jedoch Einschränkungen einschließlich Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Sphäroid-Größe sowie die Verfolgung und Überwachung der einzelnen Sphäroid. Als Heilmittel für solche Probleme, eine andere Sphäroid Produktionsmethode, nämlich die hängenden drop-Methode beschäftigt12sein können. Dies beinhaltet Hinterlegung Zelle Suspension Tropfen auf der Unterseite des Deckels einer Kulturschale. Diese Tropfen sind in der Regel 15 bis 30 µL in Größe und enthalten ca. 300 bis 3000 Zellen13. Wenn der Deckel umgekehrt wird, werden die Tropfen durch Oberflächenspannung gehalten. Der Schwerelosigkeit in jedem Tropfen konzentriert sich die Zellen, die bilden dann einzelne Sphäroide an der freien Flüssigkeit-Luft-Schnittstelle. Die Vorteile des Behangs Drop-Methode sind, dass es eine gut kontrollierte Größenverteilung bietet, während es ist leicht zu verfolgen und überwachen jede Sphäroid, bezogen auf die nicht klebende Oberfläche und Spinner Kolben Methoden. Jedoch verursacht diese Methode einen Nachteil, dass die massive Produktion von Sphäroide und des Produktionsprozesses selbst übermäßig Labor ist intensiver.
Ein Microwell-Array ist eine flache Platte mit vielen Mikro-Größe Brunnen, jeweils mit einem Durchmesser von 100 bis 1000 µm. Das Sphäroid Herstellungsprinzip Mikrovertiefungen Verwendung ist ähnlich dem der nicht klebenden Oberfläche Methode. Vorteile sind die Tatsache, dass die Mikrovertiefungen bieten Räume zwischen Mikrovertiefungen zur Abtrennung der Zellen oder Sphäroide, so dass es leicht zu Steuern der Sphäroid-Größe und gleichzeitig soll es einfach, jede einzelne Sphäroid zu überwachen. Mit einer großen Anzahl von Mikrovertiefungen ist Hochdurchsatz-Sphäroid Produktion auch möglich. Ein weiterer Vorteil des Mikroschälchen besteht die Möglichkeit, Form-Brunnen in verschiedenen Formen (hexaedrischen, zylindrisch, trigonal prismatisch) abhängig von den Benutzern einzigartige experimentelle Zwecke. In der Regel jedoch eine dreidimensionale (3D) konkave (oder halbkugelförmige) Form gilt als am besten geeignet für die Herstellung von einzelnen Sphäroide Uniform-Größe. Deshalb die Nützlichkeit der konkaven Mikrovertiefungen berichtet für viele Zelle Biologie Studien wie die Prüfung der Cardiomyocyte Differenzierung von embryonalen Stammzellen14, die Insulinsekretion von Inselzelle Cluster15, die enzymatische Aktivität von Hepatozyten16und die Resistenz des Tumors Sphäroide17.
Leider erfordert die Herstellung von Mikrovertiefungen oft spezialisierten Micropatterning Einrichtungen; konventionellen Fotolithografie basierenden Methoden erfordern Belichtung und Entwicklung Einrichtungen während reaktive Ionen-Ätzen-basierte Methoden Plasma und Ionenstrahl-Ausrüstung benötigen. Solcher Geräte ist kostspielig, die zusammen mit der komplizierten Fertigung eine hohe Eintrittsbarriere für Biologen präsentiert, die keinen Zugang zu Mikrotechnik. Um diese Probleme zu überwinden, andere kostengünstige Methoden wie z. B. Eis Lithografie18 (mit gefrorenen Wassertropfen) und der flexiblen Membran Methode14 (mit einer Membran, Durchgangsbohrung Substrat und ein Vakuum) vorgeschlagen worden. Diese Methoden entstehen jedoch auch gravierende Nachteile wie es schwierig, die Muster-Größen, die Erreichung der hohen Seitenverhältnisse und die Produktion von größeren Bereich Mikrovertiefungen zu kontrollieren.
Um die oben genannten Probleme zu überwinden, schlagen wir eine neuartige konkave Microwell Herstellungsverfahren unter Verwendung einer Durchgangsbohrung Substrat, Stahlkügelchen und ein Magnet-Array. Mit dieser Methode können Hunderte von konkaven sphärischen Mikrovertiefungen hergestellt werden, unter Ausnutzung des Mechanismus der magnetischen Kraft unterstützt Selbsthemmung metallischen Perlen (Abbildung 1). Der Produktionsprozess beinhaltet die Verwendung von sehr wenige teure und komplizierte Einrichtungen und verlangt nicht viele fortgeschrittene Fähigkeiten. Als solche können auch ungelernte Personen dieses Herstellungsverfahren leicht durchführen. Um die vorgeschlagene Methode zu demonstrieren, wurden menschliche Fettgewebe-Stammzellen in konkaven Mikrovertiefungen Sphäroide produzieren kultiviert.

<table><tbody><tr><td>CNC rotary engraver</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>Micro drill bit</td><td>HAM Pr&amp;auml;zision</td><td>30-1301 TA</td><td>&amp;Phi; 0.55 and 0.75 mm</td></tr><tr><td>Sulfuric acid 98%</td><td>Daejung</td><td>7683-4100</td><td>For cleaning aluminum plate.&lt;br/&gt; Dilute with distilled water with 15% solution</td></tr><tr><td>Neodymium magnet</td><td>Supermagnete</td><td>W-01-N</td><td>1 x 1 x 1 mm</td></tr><tr><td>Bearing ball</td><td>Agami Modeling</td><td>SUJ2</td><td>&amp;Phi; 600 &amp;mu;m steel bead</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>p2443</td><td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle&#039;s medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Adipose-derived mesenchymal stem cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-500-011</td><td></td></tr></tbody></table>

a paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries

Eine Sphäroid-Kultur ist ein nützliches Werkzeug für das Verständnis der zellulären Verhalten, dass es eine in Vivobietet-wie dreidimensionalen Umgebung. Verschiedenen Sphäroid Produktionsmethoden stammen wie z. B. in Studien der Zell-Zell-Interaktion, immun-Aktivierung, Drogen-screening, nicht klebende Oberflächen, Spinner Fläschchen und hängenden Tropfen Mikrovertiefungen verwendet wurden Zelldifferenzierung und organoide Generation. Unter diesen Verfahren haben Mikrovertiefungen mit einer dreidimensionalen konkave Geometrie gewann die Aufmerksamkeit der Wissenschaftler und Ingenieure, die aufgrund ihrer Vorteile Sphäroid Uniform mittlere Generation und die Leichtigkeit, mit der die Reaktionen der einzelnen Sphäroide werden kann überwacht. Obwohl kostengünstige Methoden wie der Einsatz von flexiblen Membranen und Eis Lithographie vorgeschlagen wurden, entstehen diese Verfahren gravierende Nachteile wie Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Muster-Größen und Erreichung der hohen Seitenverhältnisse und Produktion von größere Bereiche der Mikrovertiefungen. Um diese Probleme zu überwinden, schlagen wir eine robuste Methode zur Herstellung von konkaver Mikrovertiefungen ohne die Notwendigkeit einer komplexen teuren Anlagen. Diese Methode nutzt eine 30 x 30 Durchgangsbohrung Array, mehrere hundert Mikrometer-Bestellung Stahl Perlen und Magnetkraft, 900 Mikrovertiefungen in einem 3 x 3 cm Polydimethylsiloxan (PDMS) Substrat zu fabrizieren. Um die Anwendbarkeit der unsere Methode, um Anwendungen in der Zelle Biologie demonstrieren, wir Fettgewebe Stammzellen für 3 Tage kultiviert und Sphäroide Nutzung unserer Microwell-Plattform erfolgreich produziert. Darüber hinaus führten wir eine magnetostatischen Simulation, um den Mechanismus zu untersuchen, wobei Magnetkraft Stahlkügelchen in die Durchgangsbohrungen auffangen verwendet wurde. Wir glauben, dass die vorgeschlagenen Microwell Herstellungsverfahren auf viele Sphäroid-basierten zellulären Studien wie Drogen-Screening, Geweberegeneration, Stammzelldifferenzierung und Krebsmetastasen angewandt werden könnte.

Eine konvexe Form und Microwell Muster wurden erfolgreich von folgenden Schritte 2.1 bis 3.7 hergestellt. (Abbildung 4). Die kommerzielle Stahlkügelchen wurden in 30 x 30 Durchgangsbohrung Array gefangen. Die Perlen waren dicht ohne Lücken zwischen den Perlen und den entsprechenden Durchgangsbohrungen (Abb. 4a) statt. Die Form des vorgefertigten konkave Microwell ist konkav halbkugelförmigen, mit einem Durchmesser von 600 µm,...

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A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

Dieses Manuskript stellt eine robuste Methode zur Herstellung von konkaven Mikrovertiefungen ohne die Notwendigkeit einer komplexen teuren Anlagen. Mit Magnetkraft, Stahlkügelchen und einer Durchgangsbohrung Array, bildeten sich mehrere hundert Mikrovertiefungen in ein 3 x 3 cm Polydimethylsiloxan (PDMS) Substrat.

Eine gekoppelte Wulst und Magnet-Array zum Formen von Mikroschälchen mit variabler konkave Geometrie

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

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8.6K Aufrufe.  Chung-Ang University. Dieses Manuskript stellt eine robuste Methode zur Herstellung von konkaven Mikrovertiefungen ohne die Notwendigkeit einer komplexen teuren Anlagen. Mit Magnetkraft, Stahlkügelchen und einer Durchgangsbohrung Array, bildeten sich mehrere hundert Mikrovertiefungen in ein 3 x 3 cm Polydimethylsiloxan (PDMS) Substrat.

Serie: A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is particularly useful for separations applications. Porous polydimethylsiloxane (PDMS) beads can be produced by heat-curing such an emulsion, allowing the interface between the aqueous and aliphatic phases to mold the morphology of the polymer. In the procedures described here, both polymer and crosslinker (triethoxysilane) are sonicated together in a cold-bath sonicator. Following a period of cross-linking, emulsions are added dropwise to a hot surfactant solution, allowing the aqueous phase of the emulsion to separate, and forming porous polymer beads. We demonstrate that this method can be tuned, and the SAV ratio optimized, by adjusting the electrolyte content of the aqueous phase in the emulsion. Beads produced in this way are imaged with scanning electron microscopy, and representative SAV ratios are determined using Brunauer&#8211;Emmett&#8211;Teller (BET) analysis. Considerable variability with the electrolyte identity is observed, but the general trend is consistent: there is a maximum in SAV obtained at a specific concentration, after which porosity decreases markedly.

Procedures used to generate microstructured concave-porosity polydimethylsiloxane beads are presented. Effects of electrolyte concentration and identity within the aqueous phase are particularly emphasized.

Mikroblasen Herstellung von Konkav-Porosität PDMS Beads

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Forschung

Chemie

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious approach of pipetting an arbitrary number of cells into well plates. The interactions between the stem cells forced into close proximity of one another promotes the generation of the EBs. Because the media in each of the wells has to be manually exchanged every day, this approach is manually intensive.
Moreover, because environmental parameters including cell-cell, cell-soluble factor interactions, pH, and oxygen availability can be functions of EB size, cell populations obtained from traditional hanging drops can vary dramatically even when cultured under identical conditions. Recent studies have indeed shown that the initial number of cells forming the aggregate can have significant effects on stem cell differentiation. We have developed a simple, rapid, and scalable culture method to load pre-defined numbers of cells into microfabricated wells and maintain them for embryoid body development. Finally, these cells are easily accessible for further analysis and experimentation. This method is amenable to any lab and requires no dedicated equipment. We demonstrate this method by creating embryoid bodies using a red fluorescent mouse cell line (129S6B6-F1).

We show a simple and rapid method to load pre-defined numbers of cells into microfabricated wells and maintain them for embryoid body development.

Shrinky-Dink hängende Tropfen: Ein einfacher Weg zu Form und Kultur Embryoid Bodies

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious ...

Biologie

Creating Sub-50 Nm Nanofluidic Junctions in PDMS Microfluidic Chip via Self-Assembly Process of Colloidal Particles

Polydimethylsiloxane (PDMS) is the prevailing building material to make microfluidic devices due to its ease of molding and bonding as well as its transparency. Due to the softness of the PDMS material, however, it is challenging to use PDMS for building nanochannels. The channels tend to collapse easily during plasma bonding. In this paper, we present an evaporation-driven self-assembly method of silica colloidal nanoparticles to create nanofluidic junctions with sub-50 nm pores between two microchannels. The pore size as well as the surface charge of the nanofluidic junction is tunable simply by changing the colloidal silica bead size and surface functionalization outside of the assembled microfluidic device in a vial before the self-assembly process. Using the self-assembly of nanoparticles with a bead size of 300 nm, 500 nm, and 900 nm, it was possible to fabricate a porous membrane with a pore size of ~45 nm, ~75 nm and ~135 nm, respectively. Under electrical potential, this nanoporous membrane initiated ion concentration polarization (ICP) acting as a cation-selective membrane to concentrate DNA by ~1,700 times within 15 min. This non-lithographic nanofabrication process opens up a new opportunity to build a tunable nanofluidic junction for the study of nanoscale transport processes of ions and molecules inside a PDMS microfluidic chip.

We propose a simple self-assembly technique of silica colloidal nanoparticles to create a nanofluidic junction between two microchannels in polydimethylsiloxane (PDMS). Using this technique, a nanoporous bead membrane with a pore size down to ~45 nm was built inside a microchannel and applied to electrokinetic preconcentration of DNA samples.

Erstellen von Unter 50 Nm nanofluidische Junctions in PDMS mikrofluidischen Chip über Selbstorganisation von kolloidalen Teilchen

Polydimethylsiloxane (PDMS) is the prevailing building material to make microfluidic devices due to its ease of molding and bonding as well as its ...

Ingenieurwesen

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Biotechnik

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polymeren Mikronadelanordnung Fabrication durch Photolithographie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Einfache und genaue Mechanotherapie Profilierung Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or complicated equipment, making fabrication costly and incompatible with mass production, which is one of the most important preconditions for point-of-care tests (POCT) to be adopted in low-resource settings. This work describes the fabrication process of an acrylic (polymethylmethacrylate, PMMA) device for nanoparticle-conjugated enzymatic immunoassay testing using the computer numerical control (CNC) micromilling technique. The functioning of the microfluidic device is shown by performing an immunoassay to detect a commercial antibody using lysozyme as a model antigen conjugated to 100 nm magnetic nanoparticles. This device integrates a physical staggered restriction of only 5 &#181;m in height, used to capture magnetic microparticles that make up a magnetic trap by placing an external magnet. In this way, the magnetic force on the immunosupport of conjugated nanoparticles is enough to capture them and resist flow drag. This microfluidic device is particularly suitable for low-cost mass production without the loss of precision for immunoassay performance.

Microfluidics is a powerful tool for the development of diagnostic tests. However, expensive equipment and materials, as well as laborious fabrication and handling techniques, are often required. Here, we detail the fabrication protocol of an acrylic microfluidic device for magnetic micro- and nanoparticle-based immunoassays in a low-cost and simple-to-use setting.

Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-based Immunoassays

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or ...

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Biochemie

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Herstellung eines Multiplex künstliche zellulären Mikroumgebung Arrays

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...