وأيد هذا البحث "برنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تموله وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات وتخطيط المستقبل (2014R1A1A2057527 جبهة الخلاص الوطني وجبهة الخلاص الوطني-2016R1D1A1B03934418).

1-إعداد صفيف من خلال ثقب الألومنيوم لوحة والمغناطيس الصفيف
<ol><li>إعداد اثنين 50 x 50 مم (أو أكبر) صفائح الألومنيوم. وكان سمك كل لوحة 300 ميكرون هو نصف قطر حبة.</li>
	<li>تشكيل مجموعة من خلال ثقب 30 × 30 في واحدة من لوحات الألومنيوم باستخدام حفارة دوارة استخدام الحاسب الآلي مع قليلاً حفر الصغرى ميكرومتر Φ550 مع 30 ملم/s معدل الهبوط و 8000 دورة في الدقيقة لسرعة الدوران. وكان المسافة بين كل ثقب (مركز إلى مركز) 1 ملم (الشكل 1a و 2a الشكل، وأنا).</li>
	<li>وتشكل مجموعة 30 × 30 ميكرون Φ750 من خلال الثقوب على لوحة الألومنيوم الأخرى، باستخدام نفس الإجراء كالموضحة في 1.2 (الشكل 1a و 2a الشكل، ثانيا).</li>
	<li>إرفاق لوحات اثنين بعضها البعض باستخدام شريط لزجة وتشكل Φ3 مم محاذاة الثقوب في كل من الزوايا الأربع من صفائح الألومنيوم على حد سواء.</li>
	<li>نقع ألواح الألومنيوم في حمض الكبريتيك 15% ح 12 لتنظيف هذه الأسطح. نظراً لأن طبقة رقيقة من أكسيد الألومنيوم على سطح الألومنيوم تجعل من مقاومة للتآكل، حفرة قطرها وسمك اللوح لا تتغير بهذه المعالجة الحمضية.</li>
	<li>وتشكل مجموعة 30 × 30 من 1 × 1 × 1 مم نيوديميوم المغناطيس (مع قوة مغنطيسية 0.363 ن). ضمان أن كل المغناطيس الأقطاب المتقابلة لجارتها. لمنع كسر أو نثر الصفيف المغناطيس، إرفاق لوحة ألومنيوم 30 x 30 ملم إلى الجزء السفلي من الصفيف المغناطيس باستخدام الشريط على الوجهين (الشكل 2a، ثالثا واقحم في الشكل 2).</li>
</ol>2-حبة العملية الملائمة
<ol><li>محاذاة والمكدس لوحات الألومنيوم اثنين (أعلى اللوحة: لوحة 750 حفرة ميكرومتر، أسفل لوحة: لوحة 550 حفرة ميكرومتر) استخدام الثقوب إعداد المحاذاة في الأركان الأربعة لكل لوحة (الشكل 1b).</li>
	<li>تأمين لوحات اثنين معا عن طريق إدراج مسامير M3 في محاذاة الثقوب، ومن ثم تأمين البراغي مع المكسرات (الشكل 1b).</li>
	<li>المكدس الجمعية لوحة الألومنيوم في الصفيف المغناطيس استعداد (الشكل 1bو 2bو 2 (ج)). قم بمحاذاة صفيف المغناطيس ومجموعة من خلال الثقوب في لوحة الألومنيوم أثناء عملية التراص. ثم استخدم شريط مثبت لتحديد موقف الصفيف المغناطيس.</li>
	<li>لوحة مكان عددا كافياً من الصلب مم SUJ2 Φ600 الخرز على الجمعية لوحة والتلاعب بالخرز استخدام اﻷكريليك (أو غير المعدنية) مثل أن يصبح محاصرين في وقت واحد في كل حفرة (الشكل 1 ج ود 1و 1e) بينما حبة إزالة الخرز الزائدة التي لا تقدموا في الثقوب.</li>
	<li>بعناية إزالة اللوحة العلوية لتجنب تشتت غير المرغوب فيها والتفكك من الخرز المحاصرين (الشكل 1f).</li>
</ol>3-تصنيع ميكروويل مقعرة
<ol><li>نقل القالب ميكروويل مقعرة، أنتجت في خطوات 2.1 2.5، أعلاه، إلى طبق بيتري.</li>
	<li>مزيج مركب بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، وعامل المعالجة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة19 مع مونومر PDMS: علاج عامل نسبة 10:1.</li>
	<li>إزالة الغاز المخلوط PDMS باستخدام مجففة ومضخة فراغ لإزالة أي فقاعات محاصرين في خليط PDMS.</li>
	<li>صب خليط PDMS العفن ميكروويل مقعرة والغاز دي مرة أخرى باستخدام نفس الإجراء كالموضحة في 3.3 (الشكل 1f).</li>
	<li>خبز خليط PDMS على هوتبلت عند 80 درجة مئوية ح 2 تشكل جزءا لا يتجزأ من حبة الركازة PDMS (الشكل 1 ز).</li>
	<li>إزالة الركيزة PDMS شُفي من العفن (الشكل 1 ز). في عملية إزالة، ورذاذ الميثانول باستخدام زجاجة الغسيل لفصل الركيزة PDMS من العفن.</li>
	<li>باستخدام Φ15 مم × 2 مم المغناطيس، إزالة الخرز الصلب المحاصرين من الركازة PDMS (ح الشكل 1). لهذه العملية، ويمكن استخدام أي مغناطيس قوي بما فيه الكفاية لاستخراج الخرز من الركازة PDMS.</li>
</ol>4-ثقافة كروي
<ol><li>قص الركيزة PDMS مقعرة منقوشة ميكروويل باستخدام Φ14 مم خزعة لكمه لتركيبها في لوحة 24-جيدا في هذه الدراسة.</li>
	<li>تعقيم الركيزة PDMS مم Φ14 الناجمة عن ذلك في معقم اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية و 15 رطل/بوصة مربعة.</li>
	<li>ضع الركيزة PDMS معقمة في 24 لوحة جيدا.</li>
	<li>معطف الركيزة PDMS كامل مع حل pluronic F-127 4% (w/v) بين عشية وضحاها لمنع المرفقات الخلية إلى السطح ميكروويل. أثناء عملية الطلاء، وإزالة أي فقاعات الهواء أكمنة في ميكروويلس مقعرة بيبيتينج أو باستخدام منظف الموجات فوق الصوتية.</li>
	<li>مسح الحل F-127 ثلاث مرات باستخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).</li>
	<li>البذور 1 مل من محلول الخلية المتوسطة (تعديل النسر المتوسطة دولبيكو) (والذي يحتوي على 2 × 106 خلايا) على الركازة PDMS. لاحظ أنه لا يمكن تغيير كثافة البذر وفقا لحجم كروي الهدف و/أو نوع الخلية الهدف. وهنا استخدمت الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASC).</li>
	<li>نضح 1 مل المتوسطة باستخدام ماصة 1000 ميليلتر لإزالة أي الخلايا الزائدة التي لا حوصروا في ميكروويلس (الشكل 3).</li>
	<li>احتضان الخلايا عند 36.5 درجة مئوية، رطوبة > 95%، و 5% CO2 حالة. وفي حالة الخزفية المستخدمة في هذه الدراسة، تجميع الخلايا إلى كروي في ح 48.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+spheroids+as+a+tool+for+prediction+of+radiosensitivity+in+tumor+therapy.">Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy.</a> Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).</li><li>Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+immuno-cytochemical+characterization+of+a+hetero-spheroid+composed+of+fibroblasts+and+hepatocytes.">Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes.</a> J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).</li><li>Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brave+little+world:+spheroids+as+an+in+vitro+model+to+study+tumor-immune-cell+interactions.">Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions.</a> Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+multicellular+tumor+spheroid+model+using+microencapsulation+and+its+application+in+anticancer+drug+screening+and+testing.">Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing.</a> Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).</li><li>Kim, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwell-mediated+micro+cartilage-like+tissue+formation+of+adipose-derived+stem+cell.">Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell.</a> Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+production+and+growth+of+multicellular+tumor+spheroids.">A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).</li><li>Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medium+composition+on+the+morphology+and+function+of+rat+hepatocytes+cultured+as+spheroids+and+monolayers.">Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).</li><li>Nyberg, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+large-scale+formation+of+porcine+hepatocyte+spheroids+in+a+novel+spheroid+reservoir+bioartificial+liver.">Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver.</a> Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).</li><li>Lazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+liver-specific+functions+of+porcine+hepatocyte+spheroids+entrapped+in+collagen+gel.">Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Choi, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled-size+embryoid+body+formation+in+concave+microwell+arrays.">Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays.</a> Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).</li><li>Hwang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+clustering+of+pancreatic+islet+cells+using+concave+microwell+array.">Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array.</a> Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).</li><li>Wong, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concave+microwell+based+size-controllable+hepatosphere+as+a+three-dimensional+liver+tissue+model.">Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model.</a> Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).</li><li>Yeon, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+concave+microwells+to+pancreatic+tumor+spheroids+enabling+anticancer+drug+evaluation+in+a+clinically+relevant+drug+resistance+model.">Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model.</a> PloS one. 8 (9), (2013).</li><li>Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-lithographic+fabrication+of+concave+microwells+and+a+microfluidic+network.">Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network.</a> Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).</li><li>Corning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. , (2008).</li><li>Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+cavities+in+polydimethylsiloxane+using+DRIE+silicon+molds.">Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).</li><li>Choi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+and+culturing+of+single+microalgae+cells,+and+retrieval+of+colonies+using+a+perforated+hemispherical+microwell+structure.">Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure.</a> RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).</li><li>Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+PDMS+microlens+array+by+digital+maskless+grayscale+lithography+and+replica+molding+technique.">Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique.</a> Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+multi-level+microchannel+fabrication+by+pseudo-grayscale+backside+diffused+light+lithography.">Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography.</a> RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+3D+hair+follicle-like+hydrogel+by+soft+lithography.">Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography.</a> J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).</li><li>Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+organoid+culture+of+rat+hepatocytes+and+HepG2+cells.">Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells.</a> J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).</li></ol>

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

وكان التحدي الرئيسي الذي يواجه هذا الأسلوب تلفيق تحديد آمنة من الخرز في الصفيف من خلال ثقب في لوحة الألومنيوم. لحل هذا التحدي، استخدمت القوة المغناطيسية في شكل مصفوفة المغناطيس 30 × 30 لإصلاح الخرز بشكل أمن، كما هو مبين في أرقام 6 و 7. كثافة التدفق المغناطيسي في الصفيف المغن...

الخلايا التي نمت في شكل كروي أكثر مشابهة للنسيج الحقيقي في الجسم من ثقافة المستوية ثنائية الأبعاد1. ونظرا لهذه الميزة، قد اعتمدت استخدام الماغنيسيوم لتحسين دراسة تفاعل الخلية للخلية2،3، التنشيط المناعي4، المخدرات الفحص5و6من التمايز. وبالإضافة إلى ذلك، طبقت مؤخرا إلى أورجانويدس (قرب الفسيولوجية ثلاثي الأبعاد (3D) الأنسجة)، والتي مفيدة جداً لدراسة التنمية والأمراض البشرية7الماغنيسيوم دمج أنواع متعددة من الخلايا. وقد استخدمت عدة أساليب لإنتاج الماغنيسيوم. أبسط طريقة ينطوي على استخدام سطح غير لاصق، بتجميع الخلايا مع بعضها البعض والماغنيسيوم النموذج. ويمكن علاج طبق بيتري مع ألبومين المصل البقري أو بلورونيك F-127 أو بوليمر مسعور (مثل بولي 2-هيدروكسييثل ميثاكريلات) لجعل سطح غير لاصق8، 9. الأسلوب قارورة زر الزيادة والنقصان وسيلة أخرى معروفة لإنتاج كميات كبيرة من الماغنيسيوم10،11. في هذا الأسلوب، تشغل الخلايا في تعليق إثارة للحيلولة دون أن تصبح يعلق على الركازة. بدلاً من ذلك، العائمة الخلايا المجمعة الماغنيسيوم النموذج. كل أسلوب سطحي غير لاصقة وغزل قارورة أسلوب يمكن أن تنتج كميات كبيرة من الماغنيسيوم. ومع ذلك، فتخضع لقيود بما في ذلك صعوبات في التحكم في حجم كروي، فضلا عن التتبع ورصد كل كروي. كعلاج لهذه المشاكل، وأسلوب الإنتاج كروي آخر، إلا وهي إسقاط معلقة أسلوب يمكن العاملين12. وهذا ينطوي على إيداع قطرات تعليق خلية على الجزء السفلي غطاء صحن الثقافة. وعادة ما تكون من 15 إلى 30 ميليلتر في حجم هذه القطرات وتحتوي على ما يقرب من 300 إلى 3000 الخلايا13. عندما هو مقلوب الغطاء، القطرات تجري في مكان التوتر السطحي. ويركز بيئة الجاذبية الصغرى في كل قطره الخلايا، ثم تشكل الماغنيسيوم واحد في واجهة الهواء السائل حرة. فوائد معلقة أسلوب الإسقاط أن يوفر توزيع المساحة التي تسيطر عليها جيدا، في حين أنه من السهل تتبع ورصد كل كروي، مقارنة بالأساليب قارورة المياه السطحية وغزل غير لاصقة. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتكبد عيب واحد في هذا الإنتاج الضخمة من الماغنيسيوم وعملية الإنتاج ذاتها مفرطة من حزب العمل المكثف.
مجموعة ميكروويل من شقة لوحة مع العديد من الآبار الصغيرة الحجم، وكل منها يبلغ قطرها يتراوح من 100 إلى 1000 ميكرومتر. مبدأ الإنتاج كروي عند استخدام ميكروويلس شبيه بطريقة سطحية غير لاصقة. وتشمل فوائد حقيقة أن توفر ميكروويلس المسافات بين ميكروويلس لفصل الخلايا أو الماغنيسيوم، مثل أن يكون من السهل التحكم في حجم كروي، حين أيضا يجعل من السهل لرصد كل واحد كروي. مع عدد كبير من ميكروويلس، من الممكن أيضا إنتاج كروي الفائق. ميزة أخرى من ميكروويلس هو الخيار لآبار شكل من أشكال مختلفة (مسدس الأضلاع، أسطواني، البزموت المنشورية) تبعاً لأغراض تجريبية فريدة من نوعها المستخدمين. عموما، إلا أن شكل ثلاثي الأبعاد (3D) مقعرة (أو نصف كروية) تعتبر الأكثر مناسبة لإنتاج الماغنيسيوم واحدة موحدة الحجم. ولذلك، فائدة ميكروويلس مقعرة أبلغ العديد من دراسات البيولوجيا الخلية مثل تلك دراسة كارديوميوسيتي التفريق بين14من الخلايا الجذعية الجنينية، إفراز الأنسولين من خلية جزيرة مجموعات15، النشاط الأنزيمي من خلايا الكبد16، ومقاومة المخدرات الورم الماغنيسيوم17.
ولسوء الحظ، تلفيق ميكروويلس غالباً ما يتطلب وجود مرافق ميكروباتيرنينج المتخصصة؛ الأساليب التقليدية المستندة إلى الطباعة التصويرية تتطلب التعرض، وإنشاء مرافق بينما رد الفعل الأساليب المستندة إلى النقش بايون بحاجة إلى معدات البلازما وأيون-شعاع. هذه المعدات مكلفة، جنبا إلى جنب مع عملية تصنيع معقدة، يعرض حاجز عال لدخول لعلماء الأحياء الذين ليس لديهم إمكانية الوصول إلى ميكروتيتشنولوجي. للتغلب على هذه المشاكل، طرق أخرى فعالة من حيث التكلفة مثل الجليد الطباعة الحجرية18 (باستخدام قطرات الماء المجمدة) وقد اقترحت طريقة غشاء مرن14 (باستخدام غشاء والركيزة من خلال ثقب وفراغ). ومع ذلك، تحمل هذه الأساليب أيضا عيوب خطيرة مثل كونها صعبة التحكم في أحجام نمط وتحقيق نسب عالية وإنتاج ميكروويلس مساحة أكبر.
للتغلب على المسائل المذكورة أعلاه، نقترح أسلوب اختﻻق رواية ميكروويل مقعرة استخدام ركيزة من خلال ثقب وخرز الصلب ومجموعة مغناطيس. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن اختﻻق مئات ميكروويلس كروية مقعرة بالاستفادة من إليه الخرز المعدني التأمين الذاتي ساعدت القوة المغناطيسية (الشكل 1). عملية تصنيع ينطوي على استخدام مرافق قليلة جداً معقدة ومكلفة ولا تتطلب الكثير من المهارات المتقدمة. على هذا النحو، يمكن بسهولة إجراء الأشخاص المهرة حتى هذا الأسلوب تلفيق. وللتدليل على الطريقة المقترحة، كانت مثقف الإنسان الدهنية-المستمدة من الخلايا الجذعية في ميكروويلس مقعرة لإنتاج الماغنيسيوم.

<table><tbody><tr><td>CNC rotary engraver</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>Micro drill bit</td><td>HAM Pr&amp;auml;zision</td><td>30-1301 TA</td><td>&amp;Phi; 0.55 and 0.75 mm</td></tr><tr><td>Sulfuric acid 98%</td><td>Daejung</td><td>7683-4100</td><td>For cleaning aluminum plate.&lt;br/&gt; Dilute with distilled water with 15% solution</td></tr><tr><td>Neodymium magnet</td><td>Supermagnete</td><td>W-01-N</td><td>1 x 1 x 1 mm</td></tr><tr><td>Bearing ball</td><td>Agami Modeling</td><td>SUJ2</td><td>&amp;Phi; 600 &amp;mu;m steel bead</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>p2443</td><td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle&#039;s medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Adipose-derived mesenchymal stem cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-500-011</td><td></td></tr></tbody></table>

a paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries

ثقافة كروي أداة مفيدة لفهم سلوك الخلوية حيث أنه يوفر في فيفو--مثل البيئة ثلاثية الأبعاد. مختلف أساليب الإنتاج كروي مثل الأسطح غير لاصقة وقوارير غزل وقطرات معلقة وميكروويلس قد استخدمت في دراسات التفاعل خلية إلى خلية، وتنشيط جهاز المناعة، المخدرات الفرز، تنبع تمايز الخلية، وجيل أورجانويد. من بين هذه الأساليب، اكتسبت ميكروويلس مع هندسة مقعرة ثلاثي الأبعاد اهتمام العلماء والمهندسين، ونظرا لمزاياها من جيل كروي موحدة الحجم والسهولة التي يمكن أن تكون ردود الماغنيسيوم الفردية رصد. على الرغم من أن قد اقترحت طرق فعالة من حيث التكلفة مثل استخدام الأغشية المرنة والطباعة الحجرية الجليد، هذه التقنيات تحمل العيوب الخطيرة مثل صعوبة في السيطرة على أحجام نمط، تحقيق نسب عالية، وإنتاج مساحات أكبر من ميكروويلس. للتغلب على هذه المشاكل، فإننا نقترح وسيلة قوية لاختلاق مقعرة ميكروويلس دون الحاجة إلى المرافق ذات التكلفة العالية المعقدة. هذا الأسلوب يستخدم صفيف من خلال ثقب 30 × 30، عدة مئات ميكرومتر-أمر الصلب الخرز، والقوة المغناطيسية اختﻻق ميكروويلس 900 في ركيزة بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) 3 × 3 سم. لإثبات انطباق لدينا طريقة للتطبيقات البيولوجية الخلية، استزراع الخلايا الجذعية الدهنية لمدة 3 أيام، وأنتجت بنجاح الماغنيسيوم استخدام برنامجنا ميكروويل. وبالإضافة إلى ذلك، نحن إجراء محاكاة ماجنيتوستاتيك للتحقيق في هذه الآلية، حيث استخدمت القوة المغناطيسية لفخ الخرز الصلب من خلال الثقوب. ونحن نعتقد أنه يمكن تطبيق طريقة تصنيع ميكروويل المقترحة للعديد من الدراسات الخلوية على أساس كروي مثل فحص المخدرات وتجديد الأنسجة، وتمايز الخلايا الجذعية وسرطان خبيث.

كانت ملفقة من العفن محدب ونمط ميكروويل بنجاح قبل اتباع الخطوات 2.1 إلى 3.7. (الشكل 4). الخرز الصلب التجاري حوصروا في الصفيف من خلال ثقب 30 × 30. وعقدت الخرز محكم دون أي ثغرات بين الخرز وفي المقابلة عن طريق الثقوب (الشكل 4 أ). هو مقعر شكل ميكروويل مقع?...

Watch this Scientific Journal Video about A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries at JoVE.com

A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

ويدخل هذا المخطوط وسيلة قوية لاختلاق مقعرة ميكروويلس دون الحاجة إلى المرافق ذات التكلفة العالية المعقدة. استخدام القوة المغناطيسية وخرز الصلب ومجموعة من خلال ثقب، شكلت ميكروويلس عدة مئات في ركيزة بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) 3 × 3 سم.

حبة المزدوجة والصفيف المغناطيس لصب ميكروويلس مع الهندسات مقعرة متغير

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

a-paired-bead-magnet-array-for-molding-microwells-with-variable

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Magnetic Forces and Fields

SCIENTISTS IN ACTION

8.6K Views.  Chung-Ang University. ويدخل هذا المخطوط وسيلة قوية لاختلاق مقعرة ميكروويلس دون الحاجة إلى المرافق ذات التكلفة العالية المعقدة. استخدام القوة المغناطيسية وخرز الصلب ومجموعة من خلال ثقب، شكلت ميكروويلس عدة مئات في ركيزة بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) 3 × 3 سم.

Video: A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is particularly useful for separations applications. Porous polydimethylsiloxane (PDMS) beads can be produced by heat-curing such an emulsion, allowing the interface between the aqueous and aliphatic phases to mold the morphology of the polymer. In the procedures described here, both polymer and crosslinker (triethoxysilane) are sonicated together in a cold-bath sonicator. Following a period of cross-linking, emulsions are added dropwise to a hot surfactant solution, allowing the aqueous phase of the emulsion to separate, and forming porous polymer beads. We demonstrate that this method can be tuned, and the SAV ratio optimized, by adjusting the electrolyte content of the aqueous phase in the emulsion. Beads produced in this way are imaged with scanning electron microscopy, and representative SAV ratios are determined using Brunauer&#8211;Emmett&#8211;Teller (BET) analysis. Considerable variability with the electrolyte identity is observed, but the general trend is consistent: there is a maximum in SAV obtained at a specific concentration, after which porosity decreases markedly.

Procedures used to generate microstructured concave-porosity polydimethylsiloxane beads are presented. Effects of electrolyte concentration and identity within the aqueous phase are particularly emphasized.

تصنيع Microbubble من الخرز PDMS مقعرة المسامية

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

Chemistry

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious approach of pipetting an arbitrary number of cells into well plates. The interactions between the stem cells forced into close proximity of one another promotes the generation of the EBs. Because the media in each of the wells has to be manually exchanged every day, this approach is manually intensive.
Moreover, because environmental parameters including cell-cell, cell-soluble factor interactions, pH, and oxygen availability can be functions of EB size, cell populations obtained from traditional hanging drops can vary dramatically even when cultured under identical conditions. Recent studies have indeed shown that the initial number of cells forming the aggregate can have significant effects on stem cell differentiation. We have developed a simple, rapid, and scalable culture method to load pre-defined numbers of cells into microfabricated wells and maintain them for embryoid body development. Finally, these cells are easily accessible for further analysis and experimentation. This method is amenable to any lab and requires no dedicated equipment. We demonstrate this method by creating embryoid bodies using a red fluorescent mouse cell line (129S6B6-F1).

We show a simple and rapid method to load pre-defined numbers of cells into microfabricated wells and maintain them for embryoid body development.

Shrinky - دينك قطرة الشنق : وسيلة بسيطة إلى نموذج الثقافة والأجرام مضغي الشكل

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious ...

Biology

Creating Sub-50 Nm Nanofluidic Junctions in PDMS Microfluidic Chip via Self-Assembly Process of Colloidal Particles

Polydimethylsiloxane (PDMS) is the prevailing building material to make microfluidic devices due to its ease of molding and bonding as well as its transparency. Due to the softness of the PDMS material, however, it is challenging to use PDMS for building nanochannels. The channels tend to collapse easily during plasma bonding. In this paper, we present an evaporation-driven self-assembly method of silica colloidal nanoparticles to create nanofluidic junctions with sub-50 nm pores between two microchannels. The pore size as well as the surface charge of the nanofluidic junction is tunable simply by changing the colloidal silica bead size and surface functionalization outside of the assembled microfluidic device in a vial before the self-assembly process. Using the self-assembly of nanoparticles with a bead size of 300 nm, 500 nm, and 900 nm, it was possible to fabricate a porous membrane with a pore size of ~45 nm, ~75 nm and ~135 nm, respectively. Under electrical potential, this nanoporous membrane initiated ion concentration polarization (ICP) acting as a cation-selective membrane to concentrate DNA by ~1,700 times within 15 min. This non-lithographic nanofabrication process opens up a new opportunity to build a tunable nanofluidic junction for the study of nanoscale transport processes of ions and molecules inside a PDMS microfluidic chip.

We propose a simple self-assembly technique of silica colloidal nanoparticles to create a nanofluidic junction between two microchannels in polydimethylsiloxane (PDMS). Using this technique, a nanoporous bead membrane with a pore size down to ~45 nm was built inside a microchannel and applied to electrokinetic preconcentration of DNA samples.

إنشاء 50 نيوتن متر الفرعية علم الموائع النانوي المفارق في PDMS ميكروفلويديك رقاقة عن طريق عملية التجميع الذاتي من الغروية الجسيمات

Polydimethylsiloxane (PDMS) is the prevailing building material to make microfluidic devices due to its ease of molding and bonding as well as its ...

Engineering

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

تشكيل غشاء حيوي ميكروأرس مع الطريقة الجمعية مقرها الممسحة-

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

البوليمر تصنيع صفيف إبرة مجهرية من قبل الطباعة التصويرية

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

سهلة ودقيقة والميكانيكية التنميط على Micropost صالحة

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning وجمعية Microvessels 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or complicated equipment, making fabrication costly and incompatible with mass production, which is one of the most important preconditions for point-of-care tests (POCT) to be adopted in low-resource settings. This work describes the fabrication process of an acrylic (polymethylmethacrylate, PMMA) device for nanoparticle-conjugated enzymatic immunoassay testing using the computer numerical control (CNC) micromilling technique. The functioning of the microfluidic device is shown by performing an immunoassay to detect a commercial antibody using lysozyme as a model antigen conjugated to 100 nm magnetic nanoparticles. This device integrates a physical staggered restriction of only 5 &#181;m in height, used to capture magnetic microparticles that make up a magnetic trap by placing an external magnet. In this way, the magnetic force on the immunosupport of conjugated nanoparticles is enough to capture them and resist flow drag. This microfluidic device is particularly suitable for low-cost mass production without the loss of precision for immunoassay performance.

Microfluidics is a powerful tool for the development of diagnostic tests. However, expensive equipment and materials, as well as laborious fabrication and handling techniques, are often required. Here, we detail the fabrication protocol of an acrylic microfluidic device for magnetic micro- and nanoparticle-based immunoassays in a low-cost and simple-to-use setting.

الطحن الدقيق للتحكم العددي بالكمبيوتر لجهاز أكريليك الموائع الدقيقة مع تقييد متداخل للمقايسات المناعية المغناطيسية القائمة على الجسيمات النانوية

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or ...

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

ملاقط مغناطيسية عالية السرعة للقياسات الميكانيكية النانوية على العناصر الحساسة للقوة

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Biochemistry

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

تصنيع صفيف متعدد المكروية الخلوية اصطناعية

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...