공간 부족에 대 한 우리 대부분 검토 기사를 인용 하 고 우리는 그의 원래 일 인용 하지 되었다 우리의 동료에 게 사과. V.C. 실험실에서 작업을 V.C., NIH, NSF, USDA/NIFA, 시인, 그리고 BSF에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. 그리고 S.G.L. 실험실 NIH와 S.G.L.에 부서의 식물 병리학과 식물-미생물 생물학에서 자금에 의해 지원 됩니다.

1. 식물 재료
<ol><li>식물의 선택</li>
	<li>사용 하 여 관심, 즉, 하나는 내 인 성 단백질을 위한이 단백질을 인코딩합니다 또는 바이러스 성 단백질에 대 한 병원 체에 대 한 자연 호스트를 나타내는 단백질에 고유 식물 종. 또한, 선택 된 식물 종의 변이 유전자 변환의 선택한 방법에 순종 해야 합니다. 참고: 정기적으로 Nicotiana benthamiana, TMV에 대 한 좋은 호스트를 나타내고 있는 Agrobacterium 중재 하는 유전자 변형 기술, 즉, agroinfiltration에 의해 효율적으로 변환 됩니다 있는 고용 연구 (3 단계 참조). 명. benthamiana 또한 쉽게 성장 하는 식물과 큰 잎, 쉽게 Agrobacterium으로 주사 되 고 쉽게 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석.</li>
	<li>
식물 성장
	<ol>
<li>명. benthamiana 씨 높은 밀도에서 젖은 토양에서 식물. 20-25 ˚C ~ 75 µmol 광자 m-2의 -1 에서 빛의 아래 16 h와 어둠의 8 h에서 제어 환경 챔버에 그들을 유지. Euphyll의 직경에 0.5 cm를 도달 하면, 신중 하 게 더 큰 냄비에 묘를 전송 하 고 동일한 조건 하에서 동일한 약 실에서 성장을 계속 합니다.</li>
		<li>그들은 4-8-잎 단계 때 큰 잎은 4-6 cm 직경; 4 주 이내에 성장 될 때까지 식물을 유지 이 시점에서 그들은 사용할 수 있습니다 agroinfiltration (3 단계 참조). 참고: 중요 한 것은, 사용 하지 마십시오 식물 꽃이 발달 단계에서 잎 아키텍처는 종종24,25, 때로는 일관성 없는 결과 이끌어 다르기 때문에 시작.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 식 벡터 건설
<ol><li>
식 시스템의 선택
	<ol>
<li>식 시스템, 즉, 벡터 및 벡터 배달 방법을, 공부 하는 식물 종에 관심사의 단백질의 표현에 대 한 가장 적합 한 선택 하십시오. 참고: 때때로, 테스트 단백질/식물 종의 같은 특정 조합 수 있습니다 필요로 특정 벡터와 벡터 최적의 표현과 관심사의 단백질의 기능에 대 한 전달 방법. 그러나 가장 dicotyledonous 식물에 대 한, 표정 벡터와 배달 시스템으로 agroinfiltration 이진 플라스 미드를 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
단백질 형광 태그
	<ol>
<li>붙일 각 표현한 단백질의 subcellular 배포22, Pd 지역화를 포함 분석에 대 한 태그. 참고: 태그 autofluorescent 단백질, c f P, DsRed2, 등을 사용 합니다. CFP와 테스트 단백질 태그와 무료 DsRed2와 coexpress. C f P 기능 태그와 바이러스 없는 화물 분자. DsRed2 기능 과도 식의 전반적인 효율을 보정 하 고, 셀-자치, 처음 변형된 세포;을 식별 하는 때문에 이 후자의 기능은 잠재적으로 비-셀-자치 테스트 단백질의 셀 움직임을 평가할 때 중요 하다. 또한 세포 자치 이다는 Pd 표시 PDCB1와 함께 coexpression에 대 한 CFP와 DsRed2와 PDCB1 테스트 단백질 태그.</li>
		<li>엄지손가락의 규칙으로 표현 된 단백질의 carboxyl 종착역을 autofluorescent 태그 퓨즈. 그러나, 태그 전체 길이 테스트 단백질 전시 Pd 대상으로 손상 된 경우에 태그 단백질의 아미노 말단에 전송.</li>
		<li>적당 한 공장 식 벡터에 시험 될 단백질의 코딩 시퀀스를 복제. 참고: 형광 태그를 허용 하는 많은 다른 식물 식 벡터 있습니다. 우리 pSAT 플라스 미드26 의 시리즈 또는 그들의 유도체27,28의 직접 제안된 autofluorescent 태그 (2.2.1 단계 참조) 모두 아미노산에서 프레임 시퀀스의 복제에 대 한 적당 한의 일부를 사용 하 여-그리고 carboxyl 터미널 방향입니다.</li>
		<li>각 식 카세트 Agrobacterium 이진 벡터에 전송 합니다. 참고: pSAT 기반 구조는 식물 조직, agroinfiltration에 직접 biolistic 납품을 위한 적합 한 변환 방법 (3 단계 참조), 여기 추천입니다에서는 T-DNA 사이 식 카세트 이진 파일의 테두리 벡터29. 참고: 모든 pSAT 벡터 있도록 설계 되었습니다 pPZP RCS2 multigene 식 이진 벡터26,30 같은 전송 드문 절단 nucleases AscI,-PpoI,-SceI, 난-CeuI를 사용 하 여 단일-단계 복제 하 여 PI PspI와 PI-TliI 26. 연구원 recombinatorial 복제, 활용 하는 것을 선호 예, 분리 lox 사이트31를 사용 하 여 pSAT 벡터 변종26,27고용 수 있습니다.</li>
		<li>Coexpression, 두 식 카세트를 전송 예를 들어, 테스트 단백질-c f P DsRed2 또는 테스트 단백질-CFP 및 PDCB1 DsRed2 (참조 하십시오 단계 2.1), 동일한 pPZP RCS2 이진 벡터. 참고: 또는, 개별 이진 구조를 품고 Agrobacterium 문화 혼합 수 있습니다 함께 명. benthamiana 으로 침투에 대 한 (단계 3.1 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. Agroinfiltration
<ol><li>
EHA105 또는 GV3101 설명된32로 준비 Agrobacterium tumefaciens 스트레인의 유능한 세포의 단계 2.2.5 100 µ L 문화에서 pPZP-RCS2-기반 플라스 미드의 1 µ g을 추가, 30 분 동안 얼음에 품 어, 1 분, 액체 질소에 플래시 동결 및 15 분 동안 28 ° C에 품 어.
	<ol>
<li>다음, 유능한 세포 혼합물에 파운드 매체 (10 g/L tryptone, 5 g/L 효 모 추출 물, 및 10 g/L NaCl)의 1 mL을 추가 1 분에 3000 × g에서 셀 아래로 2 h. 회전 28 ° C에서 품 어, 다시 파운드의 0.2 mL에서 그들을 중지합니다 파운드 한 적절 한 항생제 (예, 100 mg/L spectinomycin와 pPZP-RSC2-기반 벡터26,3050 mg/L 리 팜 피신) 보충에 접시와. 개별 식민지 표시 될 때까지 48 h에 28 ° C에 성장 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>선택 하 고 신선한 파운드 한 접시에 여러 개별 식민지 접시 (단계 3.1 참조), 48 h, 28 ° C에서 성장 하 고 식민지 PCR33 특정 바이너리 구문의 존재를 확인 하 여 분석에 대 한 박테리아의 작은 금액을 취할.</li>
	<li>
성장 (단계 3.1.1 참조) 적절 한 항생제로 보충 파운드 매체의 5 mL에 28 ° C에서 하룻밤 관심의 구조와 각 Agrobacterium 식민지. 3000 × g에서 세포를 원심 및 다시 OD600중단 = 0.5 agroinfiltration 버퍼 (10 m m MgCl2, 10 m m MES (pH 5.6), 150 µ M acetosyringone). 실 온에서 2 h에 품 어.
	<ol>
<li>단백질 coexpression에 대 한 이진 플라스 미드 보다는 단일 multigene 식 플라스 미드의 혼합물을 사용 하는 경우 해당 셀 문화 침투 하기 전에 v/v를 1:1 비율로 섞는다. 다음 2 h 28 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
로드는 inoculum 1 mL 플라스틱 주사기와 완전히 성숙한 명. benthamiana 의 더 낮은 (abaxial) 표 피에 대 한 주사기 (바늘)의 노즐 단풍 누릅니다. Gloved 손가락으로 잎을 adaxial 얼굴34,35만요.
	<ol>
<li>천천히 주입 하 여 침투 매체에서 Agrobacterium을 소개 합니다. 통계적 의미에 대 한 각 식물에 몇 잎에 침투. 참고: Note로 그들은 일관 된 표현 레벨을 양보 하지 오래 된 잎 사용 되지 않습니다.</li>
		<li>모든 잎 원래의접종 1.2 단계에에서 설명 된 대로 관찰까지 침투 공장을 유지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. confocal 현미경 검사 법
<ol><li>블레이드를 사용 하 여 각 잎 정 맥 사이 조각으로 잘라 (에 따라 특정 테스트 단백질의 과도 한 표현의 효율성); 침투 후 24-48 h 각 조직 조각의 크기 조각을 현미경에 사용 되는 커버 유리 (22 m m x 40 m m)에 의해 완전히 덮여 되도록 해야 합니다.</li>
	<li>Abaxial 잎 표면 위로 향하도록 슬라이드 개체에서 잎 조각 장소 잎 조각에 물 한 방울 놓고 커버 글라스와 커버. 각 측에 테이프의 작은 조각 가진 덮개 유리를 고정 하 고</li>
	<li>
레이저 confocal 현미경 검사에서 agroinfiltrated 조직 관찰 하 고 결과 이미지를 기록 합니다.
	<ol>
<li>첫째, 10 X 객관적 렌즈를 사용 하 여 신호, 셀을 식별 하 고 63 x 렌즈를 사용 하 여 더 상세한 관측을 위해.</li>
		<li>C f P, 그리고 543을 자극 하는 아르곤 이온 레이저에서 사용 된 458 nm 파장 nm DsRed2를 자극. 이미지 수집, 즉, 레이저 강도 및 광 전 증폭 관 관 (PMT) 설정, 실험에 대 한 모든 설정을 유지 합니다. 평균, 각 실험 조건에 대 한 100-120 셀을 검사 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 식별의 PLS
<ol><li>Confocal 현미경 (4 단원)를 사용 하 여 테스트 단백질의 지 방화를 진단 합니다. 테스트 거친된 단백질 있다는 특성 주변 punctate 패턴25,36,,3738,39,40,41 colocalizes 있는지 확인 와 Pd 표식 PDCB123입니다. 이 테스트 단백질 대부분 PLS 시퀀스 포함 되어 있음을 나타냅니다.</li>
	<li>확인 테스트 단백질의 PLS 활동의 점진적으로 작은 조각, autofluorescently, (예를 들어, c f P,)으로 그것의 열려있는 독서 구조 (ORF) (은행 승인 번호 BAF93925.1)를 분할 하는 후, 그들 각각의 태그 및 분석의 4 단계에서에서 설명한 대로 subcellular 지 방화입니다. 처음에, 각 세분화 조각에 대 한 100 아미노산 잔류물의 크기는 권장 됩니다.</li>
	<li>더 세분화 PLS 활동 고 아직도 Pd 하 localizes 작은 조각까지 4 단계에에서 설명 된 대로 그들의 subcellular 지 방화를 확인 잘린된 조각, 즉 autofluorescent 태그 화물을 수송 하기에 충분 Pd을 식별 됩니다. 이 조각 PLS 시퀀스를 나타내는 추정 됩니다.</li>
	<li>전체 길이 테스트 단백질에서 상 상속 PLS을 삭제, 즉 autofluorescent 태그를 putative PLS 없이 테스트 단백질의 나머지 부분을 융합 하 고 단계에 설명 된 대로 결과 돌연변이 단백질의 subcellular 지 방화를 결정 4. 못하면 부족 putative PLS이 돌연변이 단백질 Pd를 지역화 하이 확인 된 PLS는 하지만 충분 한 (참조 단계 5.3), 하지만 테스트 단백질의 Pd 수송을 위해 또한 필요 하는 것이 나타납니다.</li>
	<li>Agroinfiltrate 식 은닉 Agrobacterium 문화의 혼합 잎 c f P-태그 PLS 및 무료 DsRed2 (단계 3.3 참조)에 대 한 생성 합니다. 침투 조직 단계 4.3에서 동일한 설정을 사용 하 여 x 10의 렌즈와 confocal 현미경을 사용 하 여 관찰 합니다.</li>
	<li>점수와 점수는 CFP 그 신호에 포함 된 인접 한 셀을 전시 운동 처음 침투 셀, CFP와 DsRed2 신호를 포함 하는 셀. 참고:이 단계는 잠재적인 셀 운동 능력;에 대 한 확인 된 PLS를 검사 이것은 (포함 대부분 식물 바이러스 MPs) Pd를 대상으로 하는 많은 단백질 또한 이웃 세포에 Pd를 통해 이동 하기 때문 에입니다. Agrobacterium 침투에 대 한 사용의 농도 다른 구조의 식 효율성에 각각 따라 다릅니다. Agroinfiltration에 대 한 보장 내용이 인접 한 셀을 떠나 단일 셀의 변화 (i), (ii) 식의 유사한 효율성을 달성 하는 셀 문화 희석을 사용 하 여 있는지 확인 합니다. 예를 들어 우리의 실험은 각각 0.01 및 c f P-태그 PLS 및 무료 DsRed2의 표현 위한 0.005의 OD600 활용합니다.</li>
</ol>6. 키 PLS 잔류물 알라닌 스캔42 를 사용 하 여 식별
<ol><li>표준 PCR 프로토콜을 사용 하 여 설명 된 대로 원하는 돌연변이, 즉, 알라닌, 각 뇌관의 중앙 지역의 주위에 함께 대상 아미노산 잔류물의 대체를 포함 하도록 하는 뇌관의 쌍을 사용 하는 시퀀스를 코딩 PLS 증폭 21. 뇌관 디자인 및 사이트 지시 된 mutagenesis 키트를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 사이트 감독 mutagenesis에 대 한.</li>
	<li>모든 표준 DNA 정제 키트를 사용 하 여 결과 PCR 제품을 정화 하 고 37 ° C는 부모의 제거 하는 DpnI에 그들을 소화 (즉, 비 돌연변이) 갠 및 hemimethylated DNA. (얼음)에 실 온에서 5 분 동안 이것을 식혀. 그리고 혼합물을 대장균 유능한 세포43, 직접 변환 단계 3.2에 설명 된 대로 원하는 돌연변이 구문으로 식민지를 식별 합니다.</li>
	<li>2.2.4 단계에서 설명한 대로 이진 벡터에 돌연변이 구조를 소개 하 고 3 단계에에서 설명 된 대로 agroinfiltration를 수행 5.1 4 단계에 설명 된 대로 Pd 대상으로 평가.</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언.

이 프로토콜은 4 명의 코어 성분: 시퀀스를 필요 하 고 충분 한 Pd, 길이, 점차적으로 줄어드는 조각으로 관심사의 단백질의 체계적인 부문 융합는 테스트 대상에 대 한 식별의 개념 태그와 고분자 화물, 및 Pd 생활에 대상에 대 한 기능 분석 결과 제공 하는 autofluorescent 단백질 조각 공장 테스트 융해 단백질의 과도 식 다음 조직. Note Agrobacterium 중재 과도 식 시간, 즉, 몇 일, 유사한 연구<sup class...

Plasmodesmata (Pd) 식물 개발 및 녹음 방송 요인에서 mRNA와 작은 RNA 분자에 이르기까지 morphogenesis의 키 레 귤 레이 터의 세포 수송을 위한 도관으로 작동 합니다. 또한,이 고분자 전송 용량 Pd의 활용 그들의 세포 확산에 대 한 대부분의 식물 바이러스에 의해 감염; 시 Pd를 통해 이동, 식물 바이러스 이동 단백질 (MPs), 특히 Pd1,2,3,4,,56 대상 되 나 특수 단백질 진화 , 7. Pd 전송의 분자 경로 대부분 이러한 경로에 수송된 단백질을 대상으로 특정 시퀀스와 밀접 하 게 상호는. 따라서, 이러한 Pd 지역화 신호 (PLSs)의 진단 해당 Pd 전송 통로의 있을 수 있습니다. 이것은 Pd 전송8, 비유 하 여 예를 들어 다른 핵 지 방화 신호 (NLS) 시퀀스9,10에 대 한 특정 될 수 있는 다른 핵 가져오기 경로. 개념적으로, NLSs와 PLSs 비 쪼갤 subcellular 타겟팅은 시퀀스를 필요 하 고 대상에 대 한 충분 한을 나타냅니다. 그러나, NLSs11, 달리 PLSs에 대 한 시퀀스 정보 심각 하 게 제한 됩니다. 특히, 단지 4 개의 단백질 시퀀스 Pd 대상에 관련 된 보고 되었습니다, 내 생 식물 단백질에서 파생 된 그들의 모든. 첫 번째 KN112 -13 의 식물 잎 표 피 안쪽 세포 층에서 이동 하는 녹음 방송 요인-와 그것의 녹 스 homologs14의 homeobox 도메인으로 표시 됩니다. 또한 두 번째 주제15전사 요소, Dof, 세포 매매 (그것)으로 상 상속 PLS를 포함에서입니다. 세 번째 순서 PDLP1 plasmodesmata 거주 유형 1 막 단백질에서 이며 막 횡단 도메인16로 표현 됩니다. 마지막으로, 네 번째 Pd 시퀀스를 대상으로 최근에 알려졌다 glycosylphosphatidylinositol (GPI)에 대 한-고정 된 단백질과 그것 glycosylphosphatidylinositol (GPI) 수정 신호17로 표시 됩니다.
흥미롭게도, 아주 최근까지, 아무 PLSs 바이러스 MPs에 대 한 보고 되었습니다. 이전 연구에서 식물 바이러스 MPs18,19, 하지만 아무 진정한 PLS, 즉, 최소한의 아미노산 시퀀스 필요 하 고 Pd 없는 화물 분자 (대상에 대 한 충분 한 상 상속 PLS 시퀀스의 존재 표시 예., CFP) 바이러스 MP에서 발견 되었습니다. 그러나이 단백질, 담배 모자이크 바이러스 (TMV), MP 중 하나는 Pd에 대 한 지역화 및 전송 되었습니다 시연된20하는 첫번째 이었다.
이 차이 해결 하기 위해 우리는 TMV MP PLS를 식별 하는 실험적인 전략을 개발 했다. 이 전략은 세 가지 개념을 기반으로 합니다. (i) 정의 PLS 최소한의 아미노산 시퀀스를 필요 하 고 Pd21대상 단백질에 대 한 충분 한로. (ii) 때문에 TMV MP Pd를 대상으로 먼저 하 고 다음 이러한 채널22를 통해 translocates, 우리는 이러한 두 활동을 분리 시에 타고 난 PLS, Pd를 대상으로, 대만 그리고 후속 전송 함수를 식별 목적. (iii) 우리는 구조적 또는 기능적 활동을 대상으로 하는 Pd에 대 한 중요 한 아미노산 잔류물에 대 한 확인 된 PLS를 분석. 이 방법을 사용 하 여, 우리에 아미노-타고 난 PLS 역할 TMV MP의 50-아미노 산 성 잔류물 시퀀스 구분 된. 이것은 단백질의 전체 길이 포화 TMV MP 파편의 시리즈를 생산, 그들의 carboxyl-테르미니 CFP와 태그와 뚜렷이 식물 조직에서 그들을 표현 하 여 이루어졌다. Pd 지역화 테스트 조각의 각 Pd 마커 단백질, PDCB1 (Pd callose 의무적인 단백질 1)23로 그들을 coexpressing에 의해 결정 되었다. 여전히 Pd로 하지만 Pd, 통과 하지 않았다 작은 조각 PLS를 표현 하기 위해 고려 되었다. 마지막으로,는 PLS 주요 아미노산 잔류물의 구조 또는 기능에 필요한 확인 하려면 알라닌 스캔 했다.
반면 여기 우리는 TMV MP PLS의 식별을 설명 하 여이 방법을 설명 하기 위해, 그것은 식물 병원 균에 의해 또는 스스로; 식물에 의해 인코딩 여부에 어떤 다른 Pd 대상 단백질에 PLSs를 채택 수 있습니다. 이 때문에 우리의 방법 Pd를 대상으로 그들의 능력에 관해서는 바이러스 MPs의 모든 고유 기능을 고려 하지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td><td>Zeiss</td><td>LSM5</td><td>Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td></tr><tr><td>Zen software for confocal microscope imaging</td><td>Zeiss</td><td>2009 version</td><td>The software should be compatible with the CLSM used</td></tr><tr><td>Quickchange II site-directed mutagenesis kit&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>200523</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td></td></tr><tr><td>Syringes without needles</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>FisherScientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmata (Pd)는 셀 연결 게이트웨이 통해 크고 작은 분자는 식물 세포 사이 수송으로 작동. 생물 고분자, 그러한 단백질의 셀 전송에 특정 대상 신호를 포함 하는 활성 메커니즘을 통해 대부분 발생 Pd 전송 작은 분자, 이온과 물, 등의 수 동적으로 발생 추정, 반면에 분자를 수송. 식별된 plasmodesmata (Pd) 지역화 신호 (PLSs)의 부족은 심각 하 게 단백질 분류의 이해 제한 경로에 관련 된 식물 셀 고분자 전송 및 통신. 다양 한 식물에서에서 Pd 통해 트래픽을 알려진 내 인 성 및 바이러스 성 단백질 3 PLSs 보고 되었습니다 데이트, 내 생 식물 단백질에서 그들의 모든. 따라서, 그것은 필요 하 고 생활에 직접 Pd 대상에 대 한 충분 한 기능 PLS 시퀀스를 식별 하는 안정적이 고 체계적인 실험 전략을 개발 하는 중요 한 식물 세포. 여기, 우리가 같은 전략 패러다임으로 담배 모자이크 바이러스 (TMV)의 셀 운동 단백질 (MP)를 사용 설명. 이러한 실험을 확인 하 고 첫 번째 특징 식물 바이러스 PLS, PLS 시퀀스 가장 Pd 대상 단백질의 발견에 대 한 적용할 수 있습니다.

충실 하 게 설명된 프로토콜에서 예상 결과 설명 하 고 식별 TMV MP PLS, 대표적인 데이터는 원 외. 에서 적응 21. 그림 1A 먼저 전장 TMV MP (1-268), TMV의 MP PLS (함유 단백질, 1-50의 처음 50 아미노산 잔류물), 표현 하는 주요 구조를 요약 하 고 V4A 파생 상품 검색의 알라닌 CFP (생성으로 융합 단계 2.2, 5.2 및 6에에서 설명 된) 그림 1B 요...

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Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

식물 세포 연결을 plasmodesmata (Pd), 역할 중앙 식물 생리학, 식물 바이러스 상호 작용. Pd 교통 위험은 신호 단백질 경찰을 직접 분류 하 고 있다. 그러나, 이러한 시퀀스에 대 한 우리의 지식을 초기 단계에서 아직도 이다. 우리는 Pd 대상 단백질에 Pd 지역화 신호를 식별 하는 전략을 설명 합니다.

Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

identification-plasmodesmal-localization-sequences-proteins

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

8.2K 조회수.  State University of New York. 식물 세포 연결을 plasmodesmata (Pd), 역할 중앙 식물 생리학, 식물 바이러스 상호 작용. Pd 교통 위험은 신호 단백질 경찰을 직접 분류 하 고 있다. 그러나, 이러한 시퀀스에 대 한 우리의 지식을 초기 단계에서 아직도 이다. 우리는 Pd 대상 단백질에 Pd 지역화 신호를 식별 하는 전략을 설명 합니다.

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Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

연구

화학

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

생물학

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

발생학

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a fluorescently tagged-protein of interest is transiently expressed in plant tissue following biolistic delivery of its encoding DNA construct. The intra- and intercellular distribution of the tagged protein is then analyzed by confocal microscopy. We describe this technology in detail, providing step-by-step protocols to assay and evaluate the extent of symplastic protein transport in three plant species, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and N. tabacum (tobacco).

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Macromolecular trafficking between plant cells can be assessed by transiently expressing a fluorescently-tagged protein of interest and analyzing its intra- and intercellular distribution by confocal microscopy.

휴대 전화의 Macromolecular 교통 분석 Planta에 Biolistic 포격을 활용

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been successfully used for identification of protein-protein interactions (PPIs) in mammalian cells. However, requirements of toxic hydrogen peroxide (H2O2) in APEX-based PL, longer incubation time with biotin (16&#8211;24 h), and higher incubation temperature (37 &#176;C) in BioID-based PL severely limit their applications in plants. The recently described TurboID-based PL addresses many limitations of BioID and APEX. TurboID allows rapid proximity labeling of proteins in just 10&#8201;min under room temperature (RT) conditions. Although the utility of TurboID has been demonstrated in animal models, we recently showed that TurboID-based PL performs better in plants compared to BioID for labeling of proteins that are proximal to a protein of interest. Provided here is a step-by-step protocol for the identification of protein interaction partners using the N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain of the nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein family as a model. The method describes vector construction, agroinfiltration of protein expression constructs, biotin treatment, protein extraction and desalting, quantification, and enrichment of the biotinylated proteins by affinity purification. The protocol described here can be easily adapted to study other proteins of interest in Nicotiana and other plant species.

Described here is a proximity labeling method for identification of interaction partners of the TIR domain of the NLR immune receptor in Nicotiana benthamiana leaf tissue. Also provided is a detailed protocol for the identification of interactions between other proteins of interest using this technique in Nicotiana and other plant species.

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

면역학 및 감염병학

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The establishment of an auxin gradient is a key event leading to phototropism and gravitropism. Previously, polar auxin transport (PAT) was shown to establish an auxin gradient in different cellular domains of plants. However, Han et al. recently demonstrated that for proper auxin gradient formation, plasmodesmal callose-mediated symplasmic connectivity between the adjacent cells is also a critical factor. In this manuscript, the strategy to elucidate the role of particular genes, which can affect phototropism and gravitropism by altering the symplasmic connectivity through modulating plasmodesmal callose synthesis, is discussed. The first step is to screen aberrant tropic responses from 3-day-old etiolated seedlings of mutants or over-expression lines of a gene along with the wild type. This preliminary screening can lead to the identification of a range of genes functioning in PAT or controlling symplasmic connectivity. The second screening involves the sorting of candidates that show altered tropic responses by affecting symplasmic connectivity. To address such candidates, the movement of a symplasmic tracer and the deposition of plasmodesmal callose were examined. This strategy would be useful to explore new candidate genes that can regulate symplasmic connectivity directly or indirectly during tropic responses and other developmental processes.

This article describes the methods for screening the genes controlling plasmodesmal permeability and hence auxin gradient during tropic response. This includes the measurement of the degree of tropic response in hypocotyl of Arabidopsis thaliana and checking plasmodesmal permeability by 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) loading and finally callose level assessment.

전략은 트로픽 응답에 Callose 매개 Plasmodesmal 게이팅의 역할을 확인하려면

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...