Für den Mangel an Raum meist Review-Artikel haben wir angeführt, und wir entschuldigen uns bei unseren Kollegen, deren ursprüngliche Arbeit nicht zitiert wurde. Die Arbeit im Labor V.C. wird unterstützt durch Zuschüsse aus NIH, NSF, USDA/NIFA, BARDEN und BSF, V.C. und das S.G.L. Labor wird unterstützt von NIH und Fonds aus den Abteilungen der Pflanzenpathologie und Pflanze-Mikroben Biologie, S.G.L.

(1) Pflanzenmaterial
<ol><li>Wahl der Pflanzenarten</li>
	<li>Verwenden Sie die Pflanzenarten heimisch in das Protein von Interesse, d. h., die dieses Protein für körpereigene Proteine kodiert oder der natürliche Wirt für den Erreger für virale Proteine darstellt. Darüber hinaus müssen die ausgewählten Pflanzenarten der gewählten Methode der Transienten genetische Transformation zugänglich sein. Hinweis: Die Studien beschäftigen routinemäßig Nicotiana Benthamiana, die einen guten Gastgeber für TMV darstellt und effizient durch die gentechnische Transformation mit Agrobakterien-vermittelten Technik, d. h., Agroinfiltration umgewandelt (siehe Schritt 3). N. Benthamiana Pflanzen auch leicht angebaut und haben große Blätter, die leicht durch Agrobacterium geimpft sind und leicht durch konfokale Mikroskopie analysiert.</li>
	<li>
Pflanzenwachstum
	<ol>
<li>Pflanzensamen Sie N. Benthamiana in feuchter Erde in hoher Dichte. Halten sie in einer kontrollierten Umgebung Kammer bei 20-25 ° c unter 16 h Licht bei ~ 75 µmol Photonen m-2 s-1 und 8 Stunden der Dunkelheit. Nachdem der Durchmesser des Euphyll 0,5 cm erreicht hat, sorgfältig übertragen Sie die Keimlinge in größere Töpfe und fortzusetzen Sie Wachstum in der gleichen Kammer unter den gleichen Bedingungen.</li>
		<li>Pflegen Sie die Pflanzen, bis sie auf 4-8-Blatt-Stadium innerhalb von 4 Wochen wachsen als die größten Blätter 4-6 cm Durchmesser sind; zu diesem Zeitpunkt können sie für Agroinfiltration verwendet werden (siehe Schritt 3). Hinweis: Verwenden Sie wichtig ist, niemals die Pflanzen wenn sie begann zu blühen, da in diesem Entwicklungsstadium die Blatt-Architektur oft24,25, manchmal führt zu inkonsistenten Ergebnissen variiert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Ausdruck Vektor Bau
<ol><li>
Wahl des Expressionssystems
	<ol>
<li>Wählen Sie den Ausdruck System, d. h., Vektoren und Vektor Versandweg, bestens geeignet für Expression des Proteins des Interesses an der Pflanzenarten untersucht. Hinweis: Gelegentlich solche spezifischen Kombinationen der getestete Protein/Pflanzenarten können erfordern spezifische Vektoren und Vektor-Übermittlungsmethode für optimale Expression und Funktion des Proteins des Interesses. Wählen Sie für die meisten zweikeimblättrige Pflanzen jedoch binäre Plasmide als Expressionsvektoren und Agroinfiltration als Delivery-System.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tagging-fluoreszierende Protein
	<ol>
<li>Eindringmittel tag jedes exprimierten Protein für die Analyse von seine subzelluläre Verteilung22, einschließlich Pd Lokalisierung. Hinweis: Verwenden Sie Autofluorescent Proteine, wie GFP und DsRed2, als Tags. Tag der getesteten Proteins mit GFP und coexpress es mit einer kostenlosen DsRed2. GFP-Funktionen als Tag sowie ein Virus-unabhängige Ladung-Molekül. DsRed2 Funktionen Gesamteffizienz des Transienten Expression zu kalibrieren und, weil es Handy-autonomen, zu identifizieren, die zunächst transformierte Zelle; Diese letztere Funktion ist wichtig, bei der Beurteilung von Zelle zu Zelle Bewegung möglicherweise nicht-Zelle-autonomen getesteten Proteine. Für Coexpression mit dem Pd-Marker PDCB1, die auch Zelle autonom ist, tag der getesteten Proteins mit GFP und PDCB1 mit DsRed2.</li>
		<li>Als Faustregel gilt Sicherung der Autofluorescent Tag an den Carboxylgruppen-Terminus des Proteins ausgedrückt. Aber wenn die tagged in voller Länge getestete Protein Exponate Pd targeting gefährdet, übertragen Sie das Tag an den amino-Terminus des Proteins.</li>
		<li>Klonen Sie die kodierenden Sequenzen der Proteine in einer geeigneten Anlage Expressionsvektor getestet werden. Hinweis: Es gibt viele verschiedene Pflanzenarten Expressionsvektoren, die fluoreszierende tagging ermöglichen. Wir verwenden eine Reihe von pSAT Plasmide26 oder einige ihrer Derivate27,,28, die eignen sich für das Klonen von der Reihenfolge des Interesses direkt im Rahmen mit den vorgeschlagenen Autofluorescent Tags (siehe Schritt 2.2.1) in beiden amino- und Carboxylgruppen-Terminal Orientierungen.</li>
		<li>Übertragen Sie jedes Expressionskassette in einer binären Vektor Agrobacterium. Hinweis: Obwohl pSAT basierende Konstrukte sind geeignet für direkte biolistischen Lieferung ins Pflanzengewebe, Agroinfiltration, nämlich die Transformationsmethode empfohlen hier (siehe Schritt 3), verlangt, dass die Expressionskassette liegen zwischen der T-DNA soll Grenzen einer Binärdatei Vektor-29. Hinweis: Alle pSAT Vektoren sind entworfen, um solche Versetzung auf die pPZP-RCS2 multigene Ausdruck binären Vektor26,30 durch einen einstufigen Klonen mit seltenen schneiden Nukleasen AscI-PpoI, -SceI, ich-CeuI, PI-PspI und PI-TliI 26. Forscher, die lieber recombinatorial Klonen, nutzen z.B.mit heterologen Lox Seiten31, pSAT Vektor Varianten26,27beschäftigen können.</li>
		<li>Für Coexpression, beiden Expressionskassetten zu übertragen, z.B., getestete Protein GFP und DsRed2 oder getestete Protein GFP und PDCB1-DsRed2 (siehe Schritt 2.1), auf den gleichen pPZP-RCS2 binären Vektor. Hinweis: Alternativ Agrobacterium Kulturen beherbergen einzelne binären Konstrukte können gemischt werden für Infiltration in N. Benthamiana (siehe Schritt 3.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Agroinfiltration
<ol><li>
Fügen Sie 1 µg der ein pPZP-RCS2-basierte Plasmid aus Schritt 2.2.5 bis 100 µL Kultur zuständigen Zellen des Agrobacterium Tumefaciens Stamm EHA105 oder GV3101 als beschrieben32vorbereitet, Inkubation für 30 min auf Eis, Schockfrosten in flüssigem Stickstoff für 1 min, und bei 28 ° C für 15 min inkubieren.
	<ol>
<li>Dann fügen Sie 1 mL LB-Medium (10 g/L Tryptone, Hefeextrakt 5 g/L und 10 g/L NaCl) auf die zuständigen Zelle Mischung und bei 28 ° C für 2 h Spin die Zellen bei 3.000 × g für 1 min inkubieren, wieder auszusetzen in 0,2 mL LB , und sie auf LB-Agar mit geeigneten Antibiotika (z.B.100 mg/L Spectinomycin und 50 mg/L Rifampicin für pPZP-RSC2-basierte Vektoren26,30) ergänzt. Wachsen Sie bei 28 ° C für 48 h, bis die einzelnen Kolonien sichtbar werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie und mehrere einzelne Kolonien auf eine frische LB-Agar-Platte-Platte (siehe Schritt 3.1), wachsen bei 28 ° C für 48 h, und nehmen Sie eine kleine Menge von Bakterien für die Analyse von Kolonie-PCR-33 um das Vorhandensein der spezifischen binären Konstrukte bestätigen.</li>
	<li>
Wachsen Sie jede Agrobacterium Kolonie mit dem Konstrukt von Interesse über Nacht bei 28 ° C in 5 mL LB-Medium mit geeigneten Antibiotika (siehe Punkt 3.1.1) ergänzt. Die Zellen bei 3.000 × g zentrifugiert, und wieder auszusetzen, OD600= 0,5 im Agroinfiltration-Puffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5,6), 150 µM Acetosyringone). 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
	<ol>
<li>Wenn Sie eine Mischung aus binären Plasmide, anstatt einer einzigen multigene Ausdruck Plasmid für Protein Coexpression verwenden, mischen Sie die entsprechenden Zellkulturen im Verhältnis 1:1 V/V vor Eindringen. Inkubieren Sie dann die Zellen bei 28 ° C für 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Laden Sie das Inokulum in eine 1 mL Kunststoffspritze und drücken Sie die Düse der Spritze (ohne Nadel) gegen die untere (abaxial) Epidermis der vollreifen N. Benthamiana verlässt. Halten Sie das Blatt mit einem behandschuhten Finger auf die adaxial Gesicht34,35.
	<ol>
<li>Die Agrobacterium Infiltration Medium durch langsame Injektion einzuführen. Statistische Signifikanz sind mehrere Blätter auf jede Pflanze zu infiltrieren. Hinweis: Beachten Sie, dass die ältesten Blätter nicht verwendet werden, da sie konsequent Ausdruck Niveaus nicht nachgeben.</li>
		<li>Alle Blätter in Situzu impfen. Pflegen Sie die infiltrierte Pflanze bis Beobachtung, wie in Schritt 1.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. der konfokalen Mikroskopie
<ol><li>Verwenden Sie eine Klinge, um jedes Blatt in Fragmente zwischen den Adern geschnitten 24-48 h nach der Infiltration (abhängig von der Effizienz der Transienten Expression des getesteten spezifischen Proteins); die Größe der einzelnen Segmente Gewebe sollte so sein, dass die Scheibe durch das Deckglas (22 x 40 mm) für die Mikroskopie verwendet vollständig bedeckt ist.</li>
	<li>Ort, an dem die Blatt-Scheiben auf das Objekt mit der abaxial Blattoberfläche nach oben schieben geben Sie einen Tropfen Wasser auf das Blatt-Scheibe und mit dem Deckglas abdecken. Das Deckglas mit kleinen Klebestreifen auf jeder Seite zu immobilisieren.</li>
	<li>
Beobachten Sie das Agroinfiltrated Gewebe unter einem Laser-scanning-confocal Mikroskop und zeichnen Sie die daraus resultierenden Bilder.
	<ol>
<li>Zuerst verwenden Sie ein 10 X-Objektiv, um Zellen mit dem Signal zu identifizieren, und verwenden Sie dann 63 X Objektiv für genauere Beobachtungen.</li>
		<li>Verwendung der 458 nm Wellenlänge aus eine Argon-Ionen-Laser GFP und 543 begeistern nm DsRed2 begeistern. Behalten Sie alle Einstellungen für die Bildaufnahme, d. h., Laserintensität und Photomultiplier Röhre (PMT) Einstellungen zwischen Experimente. Im Durchschnitt 100-120 Zellen für jede experimentelle Bedingung zu prüfen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Identifizierung der PLS
<ol><li>Die Lokalisierung des getesteten Proteins mit confocal Mikroskop (Abschnitt 4) zu diagnostizieren. Überprüfen Sie, ob das getestete Protein die charakteristische peripheren punktförmige Muster25,36,37,38,39,40,41 hat und colocalizes mit dem Pd-Marker PDCB123. Dies bedeutet, dass das getestete Protein am ehesten PLS Sequenzen enthält.</li>
	<li>Nach Bestätigung der PLS Tätigkeit der getesteten Protein, schrittweise seine offenen Leserahmen (ORF) (Genbank Zbl-Nummer BAF93925.1) in kleinere Fragmente, Autofluorescently, (z. B.GFP) unterteilen beschriften Sie jeden von ihnen und analysieren ihre subzelluläre Lokalisation wie in Schritt 4 beschrieben. Zunächst empfiehlt sich die Größe von 100 Aminosäurereste für jedes Fragment unterteilt.</li>
	<li>Weiter unterteilen die abgeschnittenen Fragmente, die haben die PLS-Aktivität und überprüfen Sie ihre subzelluläre Lokalisation, wie unter Schritt 4 bis zu den kleinsten Fragment, die noch auf Pd lokalisiert, d.h. ist ausreichend, um den Autofluorescent Tag Fracht transportieren für Pd identifiziert. Dieses Fragment ist vermutlich die PLS-Sequenz darstellen.</li>
	<li>Löschen Sie der vermeintlichen PLS vom Full-length getestete Protein, d.h. Sicherung den restlichen Teil des Proteins Test ohne vermeintliche PLS Autofluorescent Tag, und bestimmen Sie die subzelluläre Lokalisation des daraus resultierenden mutierten Proteins zu, wie in Schritt beschrieben (4) Unterlässt diese mutierten Proteins, die vermeintliche PLS fehlt, Pd zu lokalisieren, wird dies bedeuten, dass die identifizierten PLS nicht nur ausreichend (siehe Schritt 5.3), aber auch für den Pd-Transport des getesteten Proteins notwendig ist.</li>
	<li>Agroinfiltrate bauen die Blätter mit einer Mischung aus Agrobacterium Kulturen beherbergen den Ausdruck für die GFP-Tags PLS und kostenlose DsRed2 (siehe Schritt 3.3). Infiltrierten Gewebe mit Objektiv 10 x mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 4.3 confocal Mikroskop zu beobachten.</li>
	<li>Zellen, die GFP und DsRed2 Signale als anfangs infiltrierten Zellen enthalten, und Gäste der benachbarten Zellen, die nur das GFP-Signal als diejenigen enthalten diese Ausstellung Bewegung der Gäste. Hinweis: Dieser Schritt prüft der identifizierten PLS für seine potentielle Bewegungsfähigkeit der Zelle zu Zelle; und zwar deshalb, weil viele Proteine, die auf Pd (darunter die meisten Pflanzen virale MPs) auch durch Pd zu den benachbarten Zellen zu bewegen. Die Konzentration von Agrobacterium verwendet für Infiltration hängt der Ausdruck Effizienz unterschiedlicher Strukturen bzw.. Agroinfiltration stellen Sie sicher, die Zelle-Kultur-Verdünnung, die (i) die Umwandlung der Einzelzellen, verlassen die benachbarten Zellen untransformierten gewährleistet, (Ii) erreicht eine ähnliche Effizienz des Ausdrucks zu verwenden. Zum Beispiel nutzen unsere Experimente bzw. OD600 0,01 und 0,005 für Ausdruck der GFP-Tags PLS und kostenlose DsRed2.</li>
</ol>6. Identifikation der Schlüssel PLS Rückstände mit Alanin Scannen42
<ol><li>Verwenden Sie PCR-Standardprotokolle, um Codierung Sequenz mit ein paar Zündkapseln enthalten wie beschrieben die gewünschte Mutation, d. h., Substitution von Ziel Aminosäurerest mit Alanin in der zentralen Region jeweils Fibel soll PLS verstärken 21. besser gekleideteres Design und Verwendung der Site-verwiesene Mutagenese-Kit für Site-verwiesene Mutagenese nach den Anweisungen des Herstellers durchzuführen.</li>
	<li>Die daraus resultierende PCR-Produkte mit jeder Standardbausatz DNA Reinigung reinigen und verdauen sie bei 37 ° C mit DpnI der Elternzeit zu beseitigen (d. h.nicht mutiert) methyliert und Hemimethylated DNA. Kühlen Sie das für 5 min bei Raumtemperatur (nicht auf dem Eis ab). Dann umwandeln Sie die Mischung direkt in E. Coli kompetente Zellen43, und identifizieren Sie Kolonien mit der gewünschten mutierte Konstrukte zu, wie in Schritt 3.2 beschrieben.</li>
	<li>Führen Sie die mutierten Konstrukte in der binären Vektor ein, wie unter Punkt 2.2.4 beschrieben, führen Sie Agroinfiltration, wie in Schritt 3 beschrieben, und bewerten Sie Pd Ausrichtung wie in den Schritten 4 und 5.1 beschrieben.</li>
</ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Dieses Protokoll hat vier Kern-Bestandteile: das Konzept der Identifizierung einer Sequenz, die notwendig und ausreichend für die Zielgruppenadressierung auf Pd, systematische Einteilung des Proteins des Interesses der Fragmente, die in der Länge, degressiv sind Absicherung der getesteten Fragmente, ein Autofluorescent Protein, die dient sowohl als Tag als makromolekulare Fracht- und funktionelle Assay für Pd-targeting in lebenden Pflanzen Gewebe nach transiente Expression von den getesteten Fusionsproteinen. Beachten...

Plasmodesmata (Pd) Funktion als Kanäle für den interzellulären Transport der wichtigsten Regulatoren der Pflanzenentwicklung und Morphogenese von Transkriptionsfaktoren bis hin zu mRNA und kleine RNA-Moleküle. Darüber hinaus ist dieser makromolekularen Transport Pd durch die meisten Pflanzenviren für ihre interzellulären Ausbreitung während der Infektion ausgelastet; um Pd zu durchlaufen, entstanden Pflanzenviren spezialisierte Proteinen bezeichnet Bewegung Proteine (MPs), die gezielt auf Pd1,2,3,4,5,6 , 7. molekulare Signalwege Pd Transportmittel sind höchstwahrscheinlich mit spezifischen Sequenzen, die auf die transportierten Proteine in diese Bahnen eng verbunden. So kann Identifikation dieser Pd Lokalisierung Signale (PLSs) Diagnose der entsprechenden Pd Transport Weg sein. Dies ist analog der Pd Transport8, z. B. zu verschiedenen nuklearen Import Pathways, die spezifisch für verschiedene nukleare Lokalisierung Signal (NLS) Sequenzen9,10sein kann. Im Prinzip stehen für NLSs und PLSs nicht spaltbaren subzelluläre targeting-Sequenzen, die notwendig und ausreichend für die Ausrichtung sind. Im Gegensatz zu NLSs11ist jedoch die Reihenfolge Informationen über PLSs stark eingeschränkt. Insbesondere wurden nur vier Proteinsequenzen beteiligt bei der Ausrichtung der Pd mit allen von ihnen abgeleitet von endogenen pflanzlichen Proteinen beschrieben. Ersteres wird durch ein Homeobox-Domäne der KN112 – einen Transkriptionsfaktor, der Epidermis der Pflanze Blatt13 aus inneren Zellschichten bewegt – und seine KNOX homologe14dargestellt. Das zweite ist auch aus einen Transkriptionsfaktor, Dof, enthält eine vermeintliche PLS beschrieben als der interzellulären Handel (IT) Motiv15. Die dritte Sequenz ist aus das Membranprotein PDLP1 Plasmodesmata ansässige Typ 1, und es wird durch eine transmembrane Domäne16dargestellt. Schließlich die vierte Pd targeting Sequenz wurde kürzlich berichtet, für Glycosylphosphatidylinositole (GPI)-verankerte Proteine und es wird durch die Glycosylphosphatidylinositole (GPI) Änderung Signal17dargestellt.
Interessant ist, bis vor kurzem keine PLSs gemeldet wurden für virale MPs. Frühere Studien gezeigt das Vorhandensein von vermeintlichen PLS Sequenzen im Werk virale MPs18,19, aber keine wahre PLS, d. h., eine minimale Aminosäure-Sequenz notwendig und ausreichend für Pd Angriffe auf eine unabhängige Ladung Molekül ( zB., GFP) in eine virale MP identifiziert worden. Noch war eines dieser Proteine, MP das Tabakmosaikvirus (TMV), das erste für die Pd Lokalisierung und Transport demonstrierten20gewesen sein.
Um diese Lücke zu begegnen, entwickelten wir eine experimentelle Strategie um TMV MP PLS zu identifizieren. Diese Strategie basierte auf drei Konzepte. (i) Wir haben PLS als eine minimale Aminosäure-Sequenz, die notwendig und ausreichend für das Protein targeting auf Pd21ist definiert. (Ii) weil TMV MP richtet sich zunächst an Pd und dann durch diese Kanäle22translocates, wollten wir Entkopplung diese beiden Tätigkeiten und der Ausarbeitung der bona-fide PLS, welche Funktionen nur für Pd targeting und nicht für den nachfolgenden Verkehr. (Iii) wir analysiert die identifizierten PLS für Aminosäurereste wichtig für seine Pd targeting Aktivität, ob strukturell oder funktional. Mithilfe dieses Ansatzes abgegrenzt wir eine 50-amino Acid Rückstände Sequenz am amino-Terminus des TMV MP, die als bona fide PLS dient. Dies geschah durch produziert eine Reihe von TMV MP-Fragmente, die die gesamte Länge des Proteins gesättigt, tagging ihre Carboxylgruppen-Termini mit GFP und vorübergehend in Pflanzengewebe auszudrücken. PD-Lokalisierung aller getesteten Fragmente wurde durch coexpressing sie mit einem Pd Marker Protein, PDCB1 (Pd Zellstress bindendes Protein 1)23bestimmt. Die kleinsten Fragment, das nach wie vor auf Pd lokalisiert, aber nicht durchqueren, Pd, galt als PLS darstellen. Schließlich war die PLS Alanin gescannt, die wichtige Aminosäurereste benötigt für seine Struktur und/oder Funktion zu bestimmen.
Während hier wir diesen Ansatz mit der Kennung des TMV MP PLS Beschreibung veranschaulichen, können verwendet werden PLSs in jeder anderen Pd-bezogenen Proteinen zu entdecken ob Pflanzenpathogene oder die Pflanzen selbst kodiert; und zwar deshalb, weil unsere Methode keine Besonderheiten des viralen MPs in Bezug auf ihre Fähigkeit zum Ziel Pd nutzen.

<table><tbody><tr><td>Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td><td>Zeiss</td><td>LSM5</td><td>Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td></tr><tr><td>Zen software for confocal microscope imaging</td><td>Zeiss</td><td>2009 version</td><td>The software should be compatible with the CLSM used</td></tr><tr><td>Quickchange II site-directed mutagenesis kit&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>200523</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td></td></tr><tr><td>Syringes without needles</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>FisherScientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmata (Pd) sind Zell-Zell-Verbindungen, die als Gateways fungieren durch die kleine und große Molekülen zwischen den Pflanzenzellen transportiert werden. Während Pd Transport von kleinen Molekülen, wie Ionen und Wasser, angenommen wird, dass passiv auftreten, Zell-Zell-Transport von biologischen Makromolekülen, solche Proteine am ehesten erfolgt über einen aktiven Mechanismus, spezifische targeting Signale auf der Molekül transportiert. Die Knappheit der identifizierten Plasmodesmata (Pd) Lokalisierung Signale (PLSs) hat stark eingeschränkt, das Verständnis der Protein-Sortierung Bahnen beteiligt zu Pflanzen, makromolekulare Transport von Zelle zu Zelle und Kommunikation. Aus einer Fülle von Pflanzen endogene und virale Proteine bekannt für den Verkehr durch Pd, nur drei PLSs gemeldet wurden bis heute wurden alle von endogenen pflanzlichen Proteinen. So ist es wichtig, eine zuverlässige und systematische experimentelle Strategie um einen Funktionsablauf PLS zu identifizieren, die sowohl notwendig und ausreichend für Pd-targeting, direkt im Wohnzimmer zu entwickeln Pflanzenzellen. Hier beschreiben wir eine solche Strategie verwenden als Paradigma der Zelle zu Zelle Bewegung Protein (MP) das Tabakmosaikvirus (TMV). Diese Experimente, die identifiziert und charakterisiert die erste virale PLS plant, kann für Entdeckung der PLS-Sequenzen in den Pd-bezogenen Proteinen angepasst werden.

Die repräsentativen Daten, die treu illustrieren die beschriebenen Protokolle erwarteten Ergebnisse und der TMV MP PLS zu identifizieren, werden angepasst von Yuan Et al. 21. Abbildung 1A zuerst fasst wichtige Konstrukte, die mit dem Ausdruck der Full-length TMV MP (1-268), TMV MP PLS (bestehend aus den ersten 50 Aminosäurereste des Proteins, 1-50), und seine Alanin Scannen V4A Derivate mit GFP (generiert als verschmolzen beschriebenen S...

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Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Pflanze interzelluläre Verbindungen, die Plasmodesmata (Pd), spielen zentrale Rollen im Werk Physiologie und Pflanzenvirus Interaktionen. Entscheidend für den Pd-Transport sind Signale, die Proteine zu Pd direkte sortieren. Unser Wissen über diese Sequenzen ist jedoch noch in den Kinderschuhen. Wir beschreiben eine Strategie zur te-Lokalisierung-Signalen in Pd gezielt Proteine zu identifizieren.

Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

identification-plasmodesmal-localization-sequences-proteins

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

8.2K Aufrufe.  State University of New York. Pflanze interzelluläre Verbindungen, die Plasmodesmata (Pd), spielen zentrale Rollen im Werk Physiologie und Pflanzenvirus Interaktionen. Entscheidend für den Pd-Transport sind Signale, die Proteine zu Pd direkte sortieren. Unser Wissen über diese Sequenzen ist jedoch noch in den Kinderschuhen. Wir beschreiben eine Strategie zur te-Lokalisierung-Signalen in Pd gezielt Proteine zu identifizieren.

Serie: Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in effizienter Weise in Pflanzen

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Forschung

Chemie

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Biologie

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Entwicklungsbiologie

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a fluorescently tagged-protein of interest is transiently expressed in plant tissue following biolistic delivery of its encoding DNA construct. The intra- and intercellular distribution of the tagged protein is then analyzed by confocal microscopy. We describe this technology in detail, providing step-by-step protocols to assay and evaluate the extent of symplastic protein transport in three plant species, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and N. tabacum (tobacco).

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Macromolecular trafficking between plant cells can be assessed by transiently expressing a fluorescently-tagged protein of interest and analyzing its intra- and intercellular distribution by confocal microscopy.

Ein Cell-to-cell Makromolekulare Transport Assay In Planta Verwendung Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been successfully used for identification of protein-protein interactions (PPIs) in mammalian cells. However, requirements of toxic hydrogen peroxide (H2O2) in APEX-based PL, longer incubation time with biotin (16&#8211;24 h), and higher incubation temperature (37 &#176;C) in BioID-based PL severely limit their applications in plants. The recently described TurboID-based PL addresses many limitations of BioID and APEX. TurboID allows rapid proximity labeling of proteins in just 10&#8201;min under room temperature (RT) conditions. Although the utility of TurboID has been demonstrated in animal models, we recently showed that TurboID-based PL performs better in plants compared to BioID for labeling of proteins that are proximal to a protein of interest. Provided here is a step-by-step protocol for the identification of protein interaction partners using the N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain of the nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein family as a model. The method describes vector construction, agroinfiltration of protein expression constructs, biotin treatment, protein extraction and desalting, quantification, and enrichment of the biotinylated proteins by affinity purification. The protocol described here can be easily adapted to study other proteins of interest in Nicotiana and other plant species.

Described here is a proximity labeling method for identification of interaction partners of the TIR domain of the NLR immune receptor in Nicotiana benthamiana leaf tissue. Also provided is a detailed protocol for the identification of interactions between other proteins of interest using this technique in Nicotiana and other plant species.

TurboID-basierte Näherungskennzeichnung für in Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

Immunologie und Infektion

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The establishment of an auxin gradient is a key event leading to phototropism and gravitropism. Previously, polar auxin transport (PAT) was shown to establish an auxin gradient in different cellular domains of plants. However, Han et al. recently demonstrated that for proper auxin gradient formation, plasmodesmal callose-mediated symplasmic connectivity between the adjacent cells is also a critical factor. In this manuscript, the strategy to elucidate the role of particular genes, which can affect phototropism and gravitropism by altering the symplasmic connectivity through modulating plasmodesmal callose synthesis, is discussed. The first step is to screen aberrant tropic responses from 3-day-old etiolated seedlings of mutants or over-expression lines of a gene along with the wild type. This preliminary screening can lead to the identification of a range of genes functioning in PAT or controlling symplasmic connectivity. The second screening involves the sorting of candidates that show altered tropic responses by affecting symplasmic connectivity. To address such candidates, the movement of a symplasmic tracer and the deposition of plasmodesmal callose were examined. This strategy would be useful to explore new candidate genes that can regulate symplasmic connectivity directly or indirectly during tropic responses and other developmental processes.

This article describes the methods for screening the genes controlling plasmodesmal permeability and hence auxin gradient during tropic response. This includes the measurement of the degree of tropic response in hypocotyl of Arabidopsis thaliana and checking plasmodesmal permeability by 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) loading and finally callose level assessment.

Eine Strategie zur Validierung der Rolle der Kallose-vermittelten Plasmodesmal Gating im Tropic Antwort

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...