Name: cell-free dna integrity analysis in urine samples
Uploaded: 2017-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
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The authors thank Gr&#225;inne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.

프로토콜은 IRST 인간의 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다. 주 :이 프로토콜에서, 우리는 UCF 무결성 DNA 분석을 수행 소변 샘플에서 DNA를 격리. 된 LNCaP 및 MRC 세포 라인 표준을 구성하는 데 사용 하였다. 이러한 특정 종양 유전자에 대한 DNA 추출 (제어 유전자 분광 실시간 PCR, STOX1) DNA 정량 및 실시간 PCR 등의 기술 (도 1)를 수행 하였다. 1. 소변 수집 및 처리 <ol><li> 깨끗하고, 건조, 플라스틱 컵에 클린 캐치 첫 아침 소변 샘플을 얻습니다. 뇨 샘플의 적어도 50 ㎖ 수집. </li><li> 3 시간의 최대 4 ° C에서 소변을 유지하고 같은 온도에서 실험실로 보내. </li><li> 두 50 ML 원뿔 바닥 폴리 프로필렌 튜브에 실험실 및 전송에 도착 두 번 즉시 반전하여 각 샘플을 섞는다. </li><li> 튜브를 원심 분리기4 ℃에서 상온에서 10 분 동안 850에서 XG. </li><li> 조심스럽게 세포 펠렛 위에 뜨는 적어도 2ml를두고 두 5 ㎖의 튜브에 소변 상등액의 상부 10 mL로 옮긴다. 주 : 상등액의 상부 전송이 세포 또는 세포 파편에 의한 오염의 위험을 감소시킨다. 상부 및 하부 사이의 명확한 묘사는 없다. </li><li> 펠렛을 취소하고 즉시 사용할 때까지 -80 ° C에서 뜨는을 동결. </li></ol> 소변 뜨는 및 세포주 2. DNA 분리 주 : 세포주에서 DNA를 분리 (예를 들어, 된 LNCaP 방광 암 전립선 암 또는 MRC에 대한) 상용 키트를 사용하고 제조업체의 지침에 따라. 다음 뇨 상등액으로부터 DNA의 분리 변형 상용 프로토콜을 사용하여 수행한다 : <ol><li> 실온에서 소변 상청 한 분취 량을 해동. &lt;/ 리&gt; <li> 소용돌이 및 소변 샘플을 혼합하고 맑은 5 ㎖의 튜브에 소변 상등액 1㎖를 옮긴다. -80 ° C에서 잔류 소변을 고정. </li><li> 직접 샘플에 테 k의 100 μL를 추가합니다. </li><li> 샘플에 AL 버퍼 1 ㎖를 추가하고 피펫으로 잘 섞는다. </li><li> 튜브를 닫고 15 분 동안 56 ° C에서 샘플을 품어. </li><li> 배양하는 동안, 각 샘플에 대해 하나의 컬럼을 준비하고 제조업체의 지침에 따라 세척 버퍼 AW1과 AW2를 (100 % 에탄올 표시된 금액을 추가) 준비합니다. </li><li> 다시 실온으로 샘플을 가져와 무수 에탄올 1 mL를 넣어. 피펫에 의해 완전히 섞는다. </li><li> 열 단계 2.7에서 얻어진 혼합물 650 μL를 추가하고 1 분 동안 6,000 XG에 그것을 원심 분리기. </li><li> 플로우를 통해이 들어있는 튜브를 버리고 새로운, 깨끗한 수집 튜브에 열을 배치합니다. 샘플 혼합물의 모두 (5 회) 사용 때까지 반복 2.8 및 2.9 단계를 반복합니다. </li><li> 추가 500# 181; 컬럼의 테두리를 적시하지 않고 버퍼 AW1의 L. 1 분 동안 6,000 XG에 그것을 원심 분리기. </li><li> 플로우 스루를 포함하는 튜브를 버리고 새로운 깨끗한 포집 관으로 대체. </li><li> 컬럼의 테두리를 적시하지 않고 버퍼 AW2 500 μL를 추가합니다. 3 분 동안 최대 속도 (20,000 XG)에서 그것을 원심 분리기. </li><li> 플로우 스루를 포함하는 튜브를 버리고 새로운 깨끗한 포집 관으로 대체. </li><li> 단계를 반복 2.12 잔류 세척 버퍼를 제거합니다. </li><li> 깨끗한 1.5 ML의 튜브에 열을 놓습니다. 용출 버퍼 AE의 50 μL를 추가하고 버퍼 적시 그 열을 보장하기 위해 7 분을 기다립니다. </li><li> 1 분 동안 8,000 XG에 그것을 원심 분리기. </li><li> 미니 열에 단계 2.15에서 용리액을 피펫과 DNA의 최대 회복을 보장하기 위해 1 분 동안 최대 속도로 원심 분리. </li></ol> 3. DNA 정량 및 희석 <ol><li> 분광 광도계를 사용하여, 로봇의 DNA의 정량 분석을 수행H 세포주 소변 상등액 샘플. 제조업체의 지침에 따라, 벤치 탑 분석기에 샘플 2 μL를 사용합니다. </li><li> 1 NG / μL의 농도를 수득하고, DNA의 무결성을 분석 할 때까지 -20 ℃에서 DNA를 저장할 UCF DNA 샘플을 희석한다. 주 : DNA 양이 실시간 PCR (적어도 100 NG)로 진행하는데 충분하지 않은 경우, 새로운 DNA 분리 과정을 수행한다. </li><li> 상이한 농도 여섯 기준을 얻었다 세포주 시료로부터 DNA를 희석 : 0.001, 0.01, 0.1, 1, 0.5, 2 NG / μL, 100 μL의 부피 (ST1, ST5, ST4, ST3, ST2 각 및 ST6). DNA의 무결성을 분석 할 때까지 -20 ℃에서 세포주 DNA 기준을 저장한다. </li></ol> 4. DNA 무결성 테스트 - PCR <ol><li> 프라이머 (농도 분석의 유형에 따라 달라짐), 녹색 수퍼 믹스 셀 라인 DNA 표준 및 얼음 UCF 희석 DNA 샘플을 해동. </li><li> 판 f를 스트립 튜브를 준비합니다또는 72 웰 로터 디스크. 나누어 각 표준 시료 희석하고 네거티브 컨트롤의 RNase가없는 물 10 μL 중복 10 μL. </li><li> 각 프라이머 1 μL를 혼합하여 준비 (농도는 표 1에 나타내었다) 녹색 수퍼 믹스 12.5 μL, 각 시료의 RNA 분해 효소가없는 물을 6.5 μL. 2 복제, 2 복제에 대한 부정적인 제어,이 여분의 샘플 샘플이 복제에 대한 6 표준 번호 : 믹스를 준비 할 때, 다음과 같은 샘플의 번호를 사용합니다. </li><li> 각 웰에 혼합 나누어 15 μL. 피펫 또는 튜브를 회전하지 마십시오. </li><li> 표 1의 조건으로 PCR 프로토콜을 시작한다. 참고 : 29 × 2 샘플 + 6 × 2 표준 + 음성 대조군 × 2 = 72 (UCF DNA의 값) : UCF DNA 값 29 DNA 샘플을 72 웰 로터 디스크를 이용하여 각각의 실시간 실험을 위해 처리 하였다. 참고 : UCF DNA 무결성 분석을위한 프로토콜도 할 수있다(다른 장치를 사용할 때, ROX 염료가 추가 될 필요가 있음) 다른 PCR 실시간 장비를 사용하여 수행 하였다. </li></ol> 5. DNA 무결성 테스트 - 데이터 분석 및 해석 주 : 앞서 7-9 (도 2)에 기술 된 바와 같이 각 샘플에 대한 UCF DNA 값은 각각의 PCR 유전자 평가를위한 표준 곡선 구조를 사용하여 표준 곡선 보간을 이용한 실시간 장비 검출 시스템 소프트웨어에 의해 수득 하였다. <ol><li> 복제 평가; 샘플은 차이가 복제 ≥1 코네티컷은 폐기되어야하며, 두 번째 실험에서 다시는-평가했다. </li><li> 각 샘플에 대해 중간 코네티컷을 계산하고 36 ≤ CT 촬영 값으로 샘플을 고려합니다. </li><li> 융점 분석을 사용하여 PCR 산물의 특이성을 평가한다. </li><li> 표준 곡선으로 보간하여 각 앰플 리콘의 농도를 평가; 각 앰플 리콘에 대한 농도 값 (NG / μL)을 얻었다.</li>
</ol>

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The authors declare no competing financial interests.

UCF DNA 무결성 분석은 소변에서 DNA의 무결성을 평가하기위한 새로운 비 침습적 방법이다. 이는 최근 블래 9 전립선 암 7,8의 조기 진단을 위해 제안되었다. 장점과 UCF DNA 무결성 검사의 단점의 숫자는 함께 앞으로의 전망과 함께, 여기에 설명되어 있습니다. 접근법의 주된 장점은 저렴하고 비 침습적 방법 및 분자 생물학 기술의 기본 지식을 필요로하는 생체의 ...

무 세포 사멸은 DNA 또는 괴사 메커니즘 혈액 세포 사망으로 인해 소변으로 검출 할 수있다. 혈액의 무 세포 DNA 널리 각종 질병의 진단 및 예후 목적으로, 특히 암 1 연구되고있다. 그러나, 이하 소변 무 세포 (UCF) DNA의 역할에 대한 알려져있다. UCF DNA는 사구체 여과 시스템을 통해, 또는이 둘의 체액 (예 urothelial 세포 또는 전립선 세포)와 접촉 직접 제공 세포로부터 혈액 통과 기인 할 수있다. 바이오 마커의 근원으로 UCF의 DNA의 사용은 주로 요로 3,4- 세포로부터 나오는 DNA UCF의 높은 백분율 신장, 방광, 전립선 암의 조기 진단을 위해 연구되어왔다. 약간은 UCF DNA와 분리하고 특성화하기위한 최선의 방법에 대한 알려져있다. 상기 평가 종양 세포는 정상 세포보다 긴 DNA 단편을 방출한다는 가설을 감안무 세포 DNA의 무결성의 혈행 5 DNA의 출처를 규명하기위한 시도로 검토되고있다. 일부 연구는 혈중 무 세포 DNA 무결성 암 (6)의 여러 유형에 대한 좋은 진단 테스트를 나타내고, 동일한 가설 소변 7-9과 관련하여 제안 된 것으로 설명했다. 이 논문은 방광과 전립선 암 검출에 잠재적 인 응용 프로그램 UCF DNA 무결성 분석을위한 새로운 방법을 설명합니다. 특히, UCF DNA의 무결성 이상 250 bp의 전립선과 방광 암을 포함한 고형 종양에서 증가 DNA의 복제 수있는 것으로 알려져 4 지역에서 시험되었다 프래그먼트 : C-MYC (8q24.21을), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2)와 AR (Xq12) 10-14. 특정 암 유전자가 아닌 임의의 순서는 암 환자의 무 세포 분획을 발견 할 확률을 증가하도록 선택되었다. 의 주요 장점 중 하나이 방법은 유연하고 다른 영역은 또한 종양의 종류 및 특성에 기초하여 선택 될 수 있다는 것이다.

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&amp;nbsp;Green Supermix, 100 x 50 &amp;micro;L rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDT custom DNA oligos&amp;nbsp;</td><td>IDT&amp;nbsp;</td><td></td><td>HPLC purification, 100nMole DNA oligo</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA</td></tr><tr><td>Rotor-Gene 6000</td><td>Corbett</td><td></td><td>Another Real Time PCR instrument could also be used</td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>one centrifuge for 50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &amp;deg;C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette tips (10; 20; 200; 1,000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor-Disc 72 Rotor</td><td>Corbett</td><td>9018899</td><td></td></tr><tr><td>Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>Collection Tubes (2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer AL (264 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (10 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

cell-free dna integrity analysis in urine samples

혈장 또는 혈청 무 세포 DNA 순환 존재 널리 많은 종류의 암에 대한 생체의 적합한 소스 것으로 도시되었지만, 몇 가지 연구는 소변 무 세포 (UCF) DNA의 잠재적 인 사용에 초점을 맞추고있다. 더 이상 DNA, 전립선이나 방광 암과 건강한 사람과 환자를 구별 할 수있는 조기 진단 마커로 평가 하였다 UCF의 DNA 무결성의 잠재적 역할은 정상 세포 사멸 세포가 매우 조각난 DNA를 생성 가설하고 암 세포에서 눌렀다 시작. C-MYC, BCAS1, HER2 및 AR하십시오 UCF DNA 무결성 분석은 250 염기쌍 이상 네 서열 네 정량적 실시간 PCR들에 기초하여 제안되었다. 종종 방광 및 전립선 암에서 증가 된 DNA의 카피 수를 서열 분석을 위해 선택되었지만, 상기 방법은가요 성이며, 이들 유전자는 INTE 다른 유전자로 치환 될 수있는휴식. 바이오 마커의 소스로 UCF DNA의 잠재적 인 유틸리티는 이미 이렇게 UCF DNA 특성에 대한 자세한 연구를위한 방법을 포장, 비뇨 기계 악성 종양에 대한 입증되었다. UCF DNA 무결성 검사는 비 침습적 신속하고 수행하기 쉬운 분석을 수행하는 데 필요한 소변 몇 밀리리터 있다는 장점을 갖는다.

모든 샘플은 1.51 내지 138 NG / μL의 범위를 보여주는 분석을 위해 총 무료 DNA 농도는 분광 광도법에 의해 정량화 하였다. 다섯 제어 샘플 데이터의 재현성에 사용 하였다 : 두 개의 독립된 실시간 실험 C-MYC, HER2, BCAS1, AR 및 STOX1 수행 하였다. 변동 (CV)의 계수는 두 개의 독립적 인 실험 간 재현성의 좋은 정도 (표 2)와 각 유?...

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Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

소변 샘플에서 셀 무료 DNA 무결성 분석

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

cell-free-dna-integrity-analysis-in-urine-samples

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

13.7K 조회수.  Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS. A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

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Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

연구

유전학

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

대변 DNA 무결성 검출에 의한 대장암 위험 및 유병률 평가

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

암 연구학

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

암 환자의 혈장 샘플에서 세포없는 DNA 의 검출

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that originate from the primary and/or metastatic tumor. LB has emerged as a mainstay in translational research and has started to become part of clinical oncology practice, providing a minimally invasive alternative to solid biopsy. The LB allows real-time monitoring of a tumor via a minimally invasive sample extraction, such as blood. The applications include early cancer detection, patient follow-up for the detection of disease progression, assessment of minimal residual disease, and potential identification of molecular progression and mechanism of resistance. In order to achieve a reliable analysis of these samples that can be reported in the clinic, the preanalytical procedures should be carefully considered and strictly followed. Sample collection, quality, and storage are crucial steps that determine their usefulness in downstream applications. Here, we present standardized protocols from our liquid biopsy working module for collecting, processing, and storing plasma and serum samples for downstream liquid biopsy analysis based on circulating-free DNA. The protocols presented here require standard equipment and are sufficiently flexible to be applied in most laboratories focused on biological procedures.

The liquid biopsy has revolutionized our approach to oncology translational studies, with sample collection, quality, and storage being crucial steps for its successful clinical application. Here we describe a standardized and validated protocol for downstream circulating-free DNA applications that can be applied in most translational research laboratories.

다운스트림 순환 프리 DNA 응용을 위한 표준화된 액체 생검 사전 분석 프로토콜

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of cytosine. Thus, it is crucial for genome integrity maintenance. A highly specific, non-labeled, non-radio-isotopic method was developed to measure UDG activity. A synthetic DNA duplex containing a site-specific uracil was cleaved by UDG and then subjected to Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysis. A protocol was established to preserve the apurinic/apyrimidinic site (AP) product in DNA without strand break. The change in the m/z value from the substrate to the product was used to evaluate uracil hydrolysis by UDG. A G:U substrate was used for UDG kinetic analysis yielding the Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/s, and Kcat = 9.31 s-1. Application of this method to a uracil glycosylase inhibitor (UGI) assay yielded an IC50 value of 7.6 pM. The UDG specificity using uracil at various positions within single-stranded and double-stranded DNA substrates demonstrated different cleavage efficiencies. Thus, this simple, rapid, and versatile MALDI-TOF MS method could be an excellent reference method for various monofunctional DNA glycosylases. It also has the potential as a tool for DNA glycosylase inhibitor screening.

A non-labeled, non-radio-isotopic method to assay uracil-DNA glycosylase activity was developed using MALDI-TOF mass spectrometry for direct apurinic/apyrimidinic site-containing product analysis. The assay proved to be quite simple, specific, rapid, and easy to use for DNA glycosylase measurement.

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광법 분석에 의한 우라실-DNA 글리코실라제 분석

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

생화학

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

질량 분 광 법에 의해 3 개의 DNA 병 변의 정량화 및 주변 미세 입자 상 물질에 노출 된 마우스의 조직에서 그들의 수준에 대 한 평가

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

면역학 및 감염병학

암 진단을 위한 CRISPR-Cas 합성 소변 바이오마커 검사

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for traditional biofluid measurements. Synthetic biomarkers generally make use of reporters that provide readable signals in the biofluid to reflect the biochemical alterations in the local disease microenvironment during disease incidence and progression. The pharmacokinetic concentration of the reporters and biochemical amplification of the disease signal are paramount to achieving high sensitivity and specificity in a diagnostic test. Here, a cancer diagnostic platform is built using one format of synthetic biomarkers: activity-based nanosensors carrying chemically stabilized DNA reporters that can be liberated by aberrant proteolytic signatures in the tumor microenvironment. Synthetic DNA as a disease reporter affords multiplexing capability through its use as a barcode, allowing for the readout of multiple proteolytic signatures at once. DNA reporters released into the urine are detected using CRISPR nucleases via hybridization with CRISPR RNAs, which in turn produce a fluorescent or colorimetric signal upon enzyme activation. In this protocol, DNA-barcoded, activity-based nanosensors are constructed and their application is exemplified in a preclinical mouse model of metastatic colorectal cancer. This system is highly modifiable according to disease biology and generates multiple disease signals simultaneously, affording a comprehensive understanding of the disease characteristics through a minimally invasive process requiring only nanosensor administration, urine collection, and a paper test which enables point-of-care diagnostics.

저자 스포트라이트: Engineering Molecular Tools for Disease Detection and Imaging(질병 검출 및 이미징을 위한 분자 도구 엔지니어링)

This protocol describes a CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test that enables point-of-care cancer diagnostics through the ex vivo analysis of tumor-associated protease activities.

소변 샘플에서 셀 무료 DNA 무결성 분석

요약

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하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

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환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

암 환자의 혈장 샘플에서 세포없는 DNA 의 검출

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휴대용 진단을 위한 CRISPR-Cas 매개 다중분석물 합성 소변 바이오마커 검사

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