Name: cell-free dna integrity analysis in urine samples
Uploaded: 2017-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
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The authors thank Gr&#225;inne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.

Il protocollo segue le linee guida del Comitato Etico umana ricerca IRST. NOTA: In questo protocollo, abbiamo isolato il DNA da campioni di urina per eseguire un&#39;analisi di integrità UCF DNA. LNCaP e cellule MRC linee sono stati utilizzati per costruire gli standard. Tecniche come l&#39;estrazione del DNA, la quantificazione del DNA (spettrofotometro e real-time PCR per il gene di controllo, STOX1), e real-time PCR per oncogeni specifici sono stati eseguiti (Figura 1). 1. urina raccolta e lavorazione <ol><li> Ottenere un clean-cattura di prima mattina campione di urina in un bicchiere pulito, asciutto, di plastica. Raccogliere almeno 50 ml del campione di urina. </li><li> Mantenere l&#39;urina a 4 ° C per un massimo di 3 h ed inviarlo al laboratorio alla stessa temperatura. </li><li> Mescolare ogni campione invertendo due volte immediatamente dopo l&#39;arrivo in laboratorio e il trasferimento in due tubi di polipropilene a fondo conico da 50 ml. </li><li> Centrifugare le provettea 850 xg per 10 min a 4 ° C oa temperatura ambiente. </li><li> Trasferire accuratamente 10 mL della parte superiore del surnatante urine in due provette da 5 mL, lasciando almeno 2 mL del supernatante sopra il pellet di cellule. NOTA: Trasferire la parte superiore del surnatante riduce il rischio di contaminazione da cellule o detriti cellulari. Non c&#39;è una chiara demarcazione tra la parte superiore e quella inferiore. </li><li> Eliminare il pellet e congelare immediatamente il surnatante a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. Isolamento del DNA dal surnatante delle urine e linee cellulari NOTA: Isolare il DNA da una linea cellulare (ad es, LNCaP per cancro alla prostata o MRC per il cancro della vescica) utilizzando un kit commerciale e seguendo le istruzioni del produttore. Isolamento del DNA dal surnatante urine deve essere eseguita utilizzando il protocollo commerciale, modificato come segue: <ol><li> Scongelare un&#39;aliquota del surnatante urine a temperatura ambiente. &lt;/ Li&gt; <li> Vortex e mescolare il campione di urina e trasferire 1 ml di surnatante urina in un chiaro tubo da 5 mL. Congelare l&#39;urina residua a -80 ° C. </li><li> Aggiungere 100 ml di proteinasi k direttamente al campione. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone AL al campione e mescolare bene pipettando. </li><li> Chiudere le provette e incubare i campioni a 56 ° C per 15 min. </li><li> Durante l&#39;incubazione, preparare una colonna per ogni campione e preparare i tamponi di lavaggio, AW1 e AW2, come da istruzioni del produttore (aggiungere l&#39;importo indicato di 100% di etanolo). </li><li> Portare i campioni a temperatura ambiente e aggiungere 1 ml di etanolo assoluto. Mescolare completamente pipettando. </li><li> Aggiungere 650 microlitri della miscela ottenuta nello stadio 2.7 alla colonna e centrifugare a 6000 xg per 1 min. </li><li> Eliminare il tubo contenente il flow-through e posizionare la colonna su un nuovo, tubo di raccolta pulito. Ripetere i punti 2.8 e 2.9 fino a quando tutta la miscela campione è stato utilizzato (5 volte). </li><li> Aggiungere 500 &amp;# 181; L di tampone AW1 senza bagnare il bordo della colonna. Centrifugare a 6000 xg per 1 min. </li><li> Eliminare il tubo contenente il flusso continuo e sostituirla con una nuova, tubo di raccolta pulita. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di tampone AW2 senza bagnare il bordo della colonna. Centrifugare alla massima velocità (20.000 xg) per 3 min. </li><li> Eliminare il tubo contenente il flusso continuo e sostituirla con una nuova, tubo di raccolta pulita. </li><li> Ripetere il passaggio 2.12 per rimuovere eventuali residui di tampone di lavaggio. </li><li> Porre la colonna in una provetta pulita da 1,5 ml. Aggiungere 50 ml di tampone di eluizione AE e attendere 7 minuti per garantire che le bagna tampone colonna. </li><li> Centrifugare a 8000 xg per 1 min. </li><li> Pipettare il eluente dal punto 2.15 nel mini-colonna e centrifugare alla massima velocità per 1 min per garantire il massimo recupero di DNA. </li></ol> 3. DNA Quantificazione e diluizione <ol><li> Utilizzando uno spettrofotometro, eseguire la quantificazione di DNA da both la linea cellulare ei campioni di urina supernatante. Utilizzare 2 ml di campione su uno spettrometro da banco, come da istruzioni del produttore. </li><li> Diluire i campioni UCF DNA per ottenere una concentrazione di 1 ng / ml e conservare il DNA a -20 ° C fino all&#39;analisi integrità del DNA. NOTA: Se la quantità di DNA non è sufficiente procedere con PCR in tempo reale (almeno 100 ng), eseguire un nuovo processo di isolamento del DNA. </li><li> Diluire il DNA da campioni di linee cellulari di ottenere sei standard con differenti concentrazioni: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 e 2 ng / ml, ciascuno con un volume di 100 microlitri (ST1, ST2, ST3, ST4, ST5, e ST6). Conservare le norme DNA linea cellulare a -20 ° C fino all&#39;analisi integrità del DNA. </li></ol> 4. DNA Integrity Test - PCR <ol><li> Scongelare i primer (la concentrazione dipende dal tipo di test), Supermix verde, standard nel DNA delle cellule-line, e campioni di DNA UCF diluito su ghiaccio. </li><li> Preparare le provette strip nella piastra Fo il disco di rotore 72 pozzetti. Aliquota 10 ml in duplicato per ciascuno standard e campione diluito e 10 ml di acqua RNase-free per il controllo negativo. </li><li> Preparare una miscela di 1 ml di ciascun primer (le concentrazioni sono riportati in Tabella 1), 12,5 ml di Supermix verde, e 6,5 ml di acqua priva di RNasi per ogni campione. Nel preparare la miscela, utilizzare il seguente numero di campioni: 6 standard per 2 repliche, numero di campioni per 2 repliche, controllo negativo per 2 repliche, e 2 campioni in più. </li><li> Aliquota 15 ml della miscela in ciascun pozzetto. Non pipetta o girare i tubi. </li><li> Avviare il protocollo con le condizioni di PCR indicati nella tabella 1. NOTA: Per il valore UCF DNA, 29 campioni di DNA sono stati trattati per ciascun esperimento in tempo reale utilizzando il disco rotore 72-bene: 29 x 2 campioni + 6 x 2 + standard negativo di controllo x 2 = 72 (valore UCF DNA). NOTA: Il protocollo per l&#39;analisi di integrità UCF DNA può anche essereeseguita utilizzando un altro strumento real-time PCR (quando si utilizza un altro dispositivo, colorante ROX potrebbe essere necessario aggiungere). </li></ol> 5. DNA Integrity Test - Analisi dei dati e interpretazione NOTA: Il valore UCF DNA per ciascun campione è stata ottenuta con un sistema software strumento di rilevamento in tempo reale utilizzando una costruzione curva standard per ogni singola valutazione gene PCR e mediante interpolazione curva standard, come descritto in precedenza 7-9 (Figura 2). <ol><li> Valutare le repliche; campione replica con una differenza ≥1 Ct deve essere scartata e ri-valutato in un secondo esperimento. </li><li> Calcolare la mediana Ct per ogni campione e prendere in considerazione campioni con un valore Ct ≤ 36. </li><li> Valutare la specificità dei prodotti di PCR utilizzando l&#39;analisi di fusione. </li><li> Valutare la concentrazione di ogni amplicone per interpolazione con la curva standard; ottenere un valore di concentrazione (ng / mL) per ogni amplicone.</li>
</ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+array+CGH+identifies+novel+regions+of+genomic+alteration+in+intermediate-risk+prostate+cancer.">High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer.</a> Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).</li><li>Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. 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The authors declare no competing financial interests.

UCF analisi dell&#39;integrità del DNA è un nuovo metodo, non invasivo per valutare l&#39;integrità del DNA nelle urine. E &#39;stato recentemente proposto per la diagnosi precoce della vescica e della prostata 9 7,8. Un certo numero di vantaggi e svantaggi del test di integrità del DNA UCF sono discussi qui, insieme con le prospettive future. Il principale vantaggio del metodo è che offre un metodo non invasivo e poco costoso un semplice protocollo per studiare l&...

-Free Cell DNA può essere rilevato nel sangue e nelle urine causa di morte cellulare da meccanismi apoptotici o necrotiche. DNA libero-Cell nel sangue è stata ampiamente studiata per scopi diagnostici e prognostici in varie malattie, in particolare il cancro 1. Tuttavia, meno si sa circa il ruolo del DNA urinario cell-free (UCF). UCF DNA può provenire da passaggio di sangue attraverso il sistema di filtrazione glomerulare o da cellule che entrano direttamente in contatto con questo corpo fluido 2 (ad esempio, cellule uroteliali o cellule prostatiche). L&#39;uso di UCF DNA come fonte di biomarker è stato principalmente studiato per la diagnosi precoce di renale, della vescica, della prostata e cancro a causa dell&#39;elevata percentuale di UCF DNA proveniente direttamente dalle cellule del tratto urinario 3,4. Poco si sa circa UCF DNA ed i migliori metodi per isolare e caratterizzare esso. Dato l&#39;ipotesi che le cellule tumorali rilasciano frammenti di DNA più lunghi rispetto alle cellule normali, la valutazionedell&#39;integrità DNA cell-free è stato studiato in un tentativo di chiarire l&#39;origine del DNA nella circolazione sanguigna 5. Alcuni studi hanno dimostrato che cell-free integrità del DNA nel sangue rappresenta un buon test diagnostico per molti tipi di cancro 6, e la stessa ipotesi è stata proposta in relazione agli urine 7-9. Questo documento descrive un nuovo metodo per UCF DNA analisi di integrità di una potenziale applicazione per il rilevamento del cancro della vescica e della prostata. In particolare, l&#39;integrità del DNA UCF frammenti più di 250 bp è stato testato in 4 regioni note per avere un maggior numero di copie di DNA nei tumori solidi, tra cui la prostata e tumore della vescica: c-Myc (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), e AR (Xq12) 10-14. oncogeni specifici, piuttosto che sequenze casuali, sono stati scelti per aumentare la probabilità di trovarle frazione priva di cellule di pazienti affetti da cancro. Uno dei principali vantaggi diquesto metodo è che è flessibile e che altre regioni può essere selezionato sulla base del tipo di tumore e caratteristiche.

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&amp;nbsp;Green Supermix, 100 x 50 &amp;micro;L rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDT custom DNA oligos&amp;nbsp;</td><td>IDT&amp;nbsp;</td><td></td><td>HPLC purification, 100nMole DNA oligo</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA</td></tr><tr><td>Rotor-Gene 6000</td><td>Corbett</td><td></td><td>Another Real Time PCR instrument could also be used</td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>one centrifuge for 50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &amp;deg;C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette tips (10; 20; 200; 1,000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor-Disc 72 Rotor</td><td>Corbett</td><td>9018899</td><td></td></tr><tr><td>Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>Collection Tubes (2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer AL (264 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (10 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

cell-free dna integrity analysis in urine samples

Anche se la presenza di circolante DNA libero-cellule nel plasma o nel siero è stato ampiamente dimostrato di essere una fonte adeguata di biomarcatori per molti tipi di cancro, alcuni studi si sono concentrati sul potenziale utilizzo del DNA dell&#39;urina cell-free (UCF). A partire dalle ipotesi che le normali cellule apoptotiche producono DNA molto frammentato e che le cellule tumorali rilasciare più il DNA, il ruolo potenziale di integrità del DNA UCF è stata valutata come un marker diagnostico precoce in grado di distinguere tra i pazienti con prostata o il cancro della vescica e individui sani. Un&#39;analisi integrità UCF DNA viene proposta sulla base di quattro PCR quantitativa in tempo reale su quattro sequenze più lunghe di 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, e AR. Sequenze che hanno spesso un aumento del numero di copie di DNA nei tumori della vescica e della prostata sono stati scelti per l&#39;analisi, ma il metodo è flessibile, e questi geni potrebbero essere sostituiti con altri geni di interiposo. Il potenziale utilità di UCF DNA come fonte di biomarcatori è già stata dimostrata per neoplasie urologiche, aprendo così la strada a ulteriori studi sulla caratterizzazione UCF DNA. Il test di integrità del DNA UCF ha il vantaggio di essere non invasiva, rapida e facile da eseguire, con pochi millilitri di urina necessari per effettuare l&#39;analisi.

La concentrazione totale di DNA libero era quantificabile mediante spettrometria per tutti i campioni analizzati, che mostra un intervallo compreso tra 1,51 e 138 ng / ml. Cinque campioni di controllo sono stati utilizzati per la riproducibilità dei dati: due esperimenti in tempo reale indipendenti sono stati eseguiti per c-myc, HER2, BCAS1, AR, e STOX1. I coefficienti di variazione (CV) sono stati poi calcolati per ciascun gene (Tabe...

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Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

Cell-libero DNA analisi di integrità nei campioni di urina

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

cell-free-dna-integrity-analysis-in-urine-samples

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

13.7K Views.  Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS. A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

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Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Ricerca

Genetica

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

Valutazione del rischio di cancro colorettale e della prevalenza da parte del rilevamento dell'integrità del DNA delle feci

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Ricerca sul cancro

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Rilevamento e monitoraggio del DNA circolante associato al tumore nei biofluidi dei pazienti

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

Rilevamento di DNA privo di cellule in campioni di plasma sanguigno di pazienti oncologici

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that originate from the primary and/or metastatic tumor. LB has emerged as a mainstay in translational research and has started to become part of clinical oncology practice, providing a minimally invasive alternative to solid biopsy. The LB allows real-time monitoring of a tumor via a minimally invasive sample extraction, such as blood. The applications include early cancer detection, patient follow-up for the detection of disease progression, assessment of minimal residual disease, and potential identification of molecular progression and mechanism of resistance. In order to achieve a reliable analysis of these samples that can be reported in the clinic, the preanalytical procedures should be carefully considered and strictly followed. Sample collection, quality, and storage are crucial steps that determine their usefulness in downstream applications. Here, we present standardized protocols from our liquid biopsy working module for collecting, processing, and storing plasma and serum samples for downstream liquid biopsy analysis based on circulating-free DNA. The protocols presented here require standard equipment and are sufficiently flexible to be applied in most laboratories focused on biological procedures.

The liquid biopsy has revolutionized our approach to oncology translational studies, with sample collection, quality, and storage being crucial steps for its successful clinical application. Here we describe a standardized and validated protocol for downstream circulating-free DNA applications that can be applied in most translational research laboratories.

Un protocollo preanalitico standardizzato per biopsia liquida per applicazioni di DNA libero da circolazione a valle

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of cytosine. Thus, it is crucial for genome integrity maintenance. A highly specific, non-labeled, non-radio-isotopic method was developed to measure UDG activity. A synthetic DNA duplex containing a site-specific uracil was cleaved by UDG and then subjected to Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysis. A protocol was established to preserve the apurinic/apyrimidinic site (AP) product in DNA without strand break. The change in the m/z value from the substrate to the product was used to evaluate uracil hydrolysis by UDG. A G:U substrate was used for UDG kinetic analysis yielding the Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/s, and Kcat = 9.31 s-1. Application of this method to a uracil glycosylase inhibitor (UGI) assay yielded an IC50 value of 7.6 pM. The UDG specificity using uracil at various positions within single-stranded and double-stranded DNA substrates demonstrated different cleavage efficiencies. Thus, this simple, rapid, and versatile MALDI-TOF MS method could be an excellent reference method for various monofunctional DNA glycosylases. It also has the potential as a tool for DNA glycosylase inhibitor screening.

A non-labeled, non-radio-isotopic method to assay uracil-DNA glycosylase activity was developed using MALDI-TOF mass spectrometry for direct apurinic/apyrimidinic site-containing product analysis. The assay proved to be quite simple, specific, rapid, and easy to use for DNA glycosylase measurement.

Saggio di glicosilasi uracil-DNA mediante desorbimento laser assistito da matrice/analisi spettrometria di massa a tempo di volo

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

Biochimica

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

Quantificazione di tre lesioni del DNA mediante spettrometria di massa e valutazione dei loro livelli nei tessuti di topi esposti a particolato fine ambientale

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Immunologia e infezioni

Test dei biomarcatori delle urine sintetiche CRISPR-Cas per la diagnostica del cancro

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for traditional biofluid measurements. Synthetic biomarkers generally make use of reporters that provide readable signals in the biofluid to reflect the biochemical alterations in the local disease microenvironment during disease incidence and progression. The pharmacokinetic concentration of the reporters and biochemical amplification of the disease signal are paramount to achieving high sensitivity and specificity in a diagnostic test. Here, a cancer diagnostic platform is built using one format of synthetic biomarkers: activity-based nanosensors carrying chemically stabilized DNA reporters that can be liberated by aberrant proteolytic signatures in the tumor microenvironment. Synthetic DNA as a disease reporter affords multiplexing capability through its use as a barcode, allowing for the readout of multiple proteolytic signatures at once. DNA reporters released into the urine are detected using CRISPR nucleases via hybridization with CRISPR RNAs, which in turn produce a fluorescent or colorimetric signal upon enzyme activation. In this protocol, DNA-barcoded, activity-based nanosensors are constructed and their application is exemplified in a preclinical mouse model of metastatic colorectal cancer. This system is highly modifiable according to disease biology and generates multiple disease signals simultaneously, affording a comprehensive understanding of the disease characteristics through a minimally invasive process requiring only nanosensor administration, urine collection, and a paper test which enables point-of-care diagnostics.

Autore in primo piano: Ingegneria di strumenti molecolari per il rilevamento e l'imaging delle malattie

This protocol describes a CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test that enables point-of-care cancer diagnostics through the ex vivo analysis of tumor-associated protease activities.

Cell-libero DNA analisi di integrità nei campioni di urina

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

Valutazione del rischio di cancro colorettale e della prevalenza da parte del rilevamento dell'integrità del DNA delle feci

Rilevamento e monitoraggio del DNA circolante associato al tumore nei biofluidi dei pazienti

Rilevamento di DNA privo di cellule in campioni di plasma sanguigno di pazienti oncologici

Un protocollo preanalitico standardizzato per biopsia liquida per applicazioni di DNA libero da circolazione a valle

Saggio di glicosilasi uracil-DNA mediante desorbimento laser assistito da matrice/analisi spettrometria di massa a tempo di volo

Quantificazione di tre lesioni del DNA mediante spettrometria di massa e valutazione dei loro livelli nei tessuti di topi esposti a particolato fine ambientale

Test dei biomarcatori sintetici delle urine multianalitiche mediato da CRISPR-Cas per la diagnostica portatile

Test dei biomarcatori sintetici delle urine multianalitiche mediato da CRISPR-Cas per la diagnostica portatile

Test dei biomarcatori sintetici delle urine multianalitiche mediato da CRISPR-Cas per la diagnostica portatile