Name: cell-free dna integrity analysis in urine samples
Uploaded: 2017-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples at JoVE.com

The authors thank Gr&#225;inne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.

הפרוטוקול פועל בהתאם להנחיות ועדת האתיקה מחקר האדם irst. הערה: בפרוטוקול זה, אנחנו מבודדים דנ&quot;א מדגימות השתן לבצע ניתוח שלמות UCF DNA. קווי LNCaP ותא MRC ששימשו לבניית סטנדרטים. טכניקות כגון מיצוי DNA, כימות DNA (ספקטרופוטומטר ו בזמן אמת PCR עבור הגן שליטה, STOX1), בזמן אמת PCR עבור אונקוגנים ספציפיים בוצעו (איור 1). איסוף ועיבוד שתן 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג דגימת שתן ראשון בבוקר נקי לתפוס בכוס נקייה ויבשה, פלסטיק. אסוף לפחות 50 מ&quot;ל של דגימת שתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על שתן על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מקסימלית של 3 שעות ולשלוח אותו למעבדה באותה הטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים כל דגימה על ידי היפוך זה פעמיים מיד עם הגעתו במעבדה ולהעביר לשתי 50 מ&quot;ל תחתית חרוטי צינורות פוליפרופילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה צינורותב 850 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C או בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להעביר 10 מ&quot;ל של החלק העליון של supernatant שתן לשני צינורות 5 מ&quot;ל, עוזב לפחות 2 מ&quot;ל של supernatant מעל גלולה התא. הערה: העברת החלק העליון של supernatant מפחיתה את הסיכון של זיהום על ידי תאים או פסולת הסלולר. אין הגדרה ברורה בין החלקים העליונים ותחתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וזורקים את הכדור ומיד להקפיא את supernatant ב -80 ° C עד השימוש. </li></ol> בידוד DNA 2. מן Supernatant שתן שורות תאים הערה: לבודד את ה- DNA משורת תאים (למשל, LNCaP לסרטן הערמונית או MRC בסרטן שלפוחית השתן) באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן. בידוד של DNA מן supernatant שתן צריכה להתבצע באמצעות הפרוטוקול המסחרי, שונה כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot אחד supernatant שתן בטמפרטורת החדר. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס ומערבבים את דגימת שתן ולהעביר 1 מ&quot;ל של supernatant שתן לתוך צינור 5 מ&quot;ל ברור. להקפיא את השתן שיורי ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של k proteinase ישירות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של חיץ AL המדגם ומערבבים היטב על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את צינורות דגירת הדגימות ב 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, להכין עמודה אחת עבור כל דגימה ולהכין את מאגרים לשטוף, AW1 ו AW2, על פי הוראות היצרן (להוסיף את הסכום המצוין של 100% אתנול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את דגימות בחזרה לטמפרטורת החדר ומוסיפים 1 מ&quot;ל של אתנול מוחלט. מערבבים היטב על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 650 μL של התערובת שהושגה בשלב 2.7 לעמודה צנטריפוגות אותו ב -6,000 XG דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הצינור המכיל את הזרימה דרך למקם את הטור על צינור אוסף חדש, נקי. חזור על שלבים 2.8 ו -2.9 עד שכל התערובת מדגם נוצל בעבר (5 פעמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 &amp;# 181; L של חיץ AW1 מבלי להרטיב את שפת הטור. צנטריפוגה זה ב 6,000 XG דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את השפופרת המכילה את הזרימה דרך ולהחליף אותו עם צינור אוסף חדש, נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של חיץ AW2 מבלי להרטיב את שפת הטור. צנטריפוגה זה במלוא המהירות (20,000 XG) במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את השפופרת המכילה את הזרימה דרך ולהחליף אותו עם צינור אוסף חדש, נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.12 כדי להסיר כל חיץ כביסה שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטור לתוך צינור 1.5-מ&quot;ל נקי. הוסף 50 μL של חיץ elution AE ולחכות 7 דקות על מנת להבטיח כי מרטיב חיץ העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה זה ב 8000 XG דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה eluent משלב 2.15 לתוך הטור-מיני צנטריפוגות אותו במהירות המרבית עבור 1 דקות כדי להבטיח את התאוששות מקסימלית של ה- DNA. </li></ol> 3. כימות דנ&quot;א דילול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ספקטרופוטומטר, לבצע כימות של דנ&quot;א בוטh הקו הסלולרי לבין דגימות supernatant שתן. השתמש 2 μL של המדגם על ספקטרומטר הספסל העליון, על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את דגימות DNA UCF כדי לקבל ריכוז של 1 ng / μL ולאחסן את ה- DNA ב -20 ° C עד לניתוח שלמות ה- DNA. הערה: אם כמות ה- DNA אינו מספיק כדי להמשיך עם בזמן אמת PCR (לפחות 100 נ&quot;ג), לבצע תהליך בידוד DNA חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את דנ&quot;א מדגימות שורת תאים להשיג שישה תקנים עם ריכוזים שונים: 0.001, 0.01, 0.1, 1, 0.5, ו -2 ng / μL, כל אחד עם נפח של 100 μL (st1, ST2, ST3, st4, ST5, ו st6). אחסן את הסטנדרטים DNA התא קו ב -20 ° C עד לניתוח שלמות ה- DNA. </li></ol> 4. DNA Integrity מבחן - PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה פריימרים (ריכוז תלוי בסוג של assay), Supermix הירוק, סטנדרטי DNA התא אונליין, דגימות בדילול UCF DNA על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות רצועה בצלחת fאו הדיסק הרוטור 72-היטב. Aliquot 10 μL בשני עותקים עבור כל תקן מדגם מדולל 10 μL של מים RNase ללא עבור הביקורת השלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת של 1 μL של כל צבע יסוד (הריכוזים מסומנים בטבלה 1), 12.5 μL של Supermix ירוק, ו -6.5 μL של RNase ללא מים עבור כל דגימה. כאשר מכין את התערובת, להשתמש את המספר הבא של דגימות: 6 תקני 2 משכפל, מספר דגימות עבור 2 משכפל, שליטה שלילית 2 משכפל, ו -2 דגימות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 15 μL של התערובת לתוך כל טוב. אל פיפטה או לסובב את הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הפרוטוקול עם תנאי PCR המצוינים בטבלת 1. הערה: לקבלת ערך DNA UCF, 29 דגימות DNA עובדו עבור כל ניסוי בזמן אמת באמצעות הדיסק הרוטור 72-היטב: 29 x 2 דגימות + 6 x 2 תקנים + שלילי מלא x 2 = 72 (UCF DNA ערך). הערה: הפרוטוקול לניתוח שלמות ה- DNA UCF יכול גם להיותמתבצע באמצעות מכשיר אחר בזמן אמת PCR (בעת השימוש במכשיר אחר, צבע רוקס ייתכן שיהיה צורך להוסיף). </li></ol> 5. DNA Integrity מבחן - ניתוח נתונים ופרשנות הערה: ערך DNA UCF עבור כל דגימה הושגה על ידי תוכנת מערכת מכשיר איתור בזמן אמת באמצעות בניית עקומת סטנדרט עבור כל הערכת גן PCR פרט באמצעות אינטרפולציה עקומה סטנדרט, כפי שתוארה לעיל 7-9 (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את המשכפל; מדגם משכפל עם הבדל ≥1 Ct חייב להיות מושלך מחדש העריך בניסוי שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את Ct החציוני עבור כל דגימה ולשקול דגימות עם ערך Ct ≤ 36. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הספציפיות של מוצרי ה- PCR באמצעות ניתוח היתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הריכוז של כל amplicon ידי אינטרפולציה עם עקומת סטנדרט; להשיג ערך ריכוז (ng / μL) עבור כל amplicon.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Francis, G., Stein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Cell-Free+Tumour+DNA+in+the+Management+of+Cancer.">Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer.</a> Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).</li><li>Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Nucleic+Acids+in+Urine:+Sources,+Structure,+Diagnostic+Potential.">Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential.</a> Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).</li><li>Szarvas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+analysis+of+tumor+and+urinary+DNA+to+detect+bladder+cancer:+urine+supernatant+versus+urine+sediment.">Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment.</a> Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).</li><li>Togneri, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+complexity+of+urothelial+bladder+cancer+revealed+in+urinary+cfDNA.">Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA.</a> Eur.J.Hum.Genet. , (2016).</li><li>Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+DNA+Integrity,+Applications+for+Cancer+Research.">Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research.</a> Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).</li><li>Hao, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+DNA+in+serum+as+a+biomarker+for+diagnosis+and+prognostic+prediction+of+colorectal+cancer.">Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer.</a> Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+Cell-Free+DNA+Integrity+Analysis+for+Early+Detection+of+Prostate+Cancer+Patients.">Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients.</a> Dis.Markers. 2015, 574120 (2015).</li><li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+prostate+cancer+diagnosis:+a+pilot+study.">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study.</a> Biomed.Res.Int. 2013, 270457 (2013).</li><li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+bladder+cancer+diagnosis:+preliminary+data.">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data.</a> Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone.">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li><li>Ishkanian, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+array+CGH+identifies+novel+regions+of+genomic+alteration+in+intermediate-risk+prostate+cancer.">High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer.</a> Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).</li><li>Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her-2/neu+oncogene+amplification+in+clinically+localised+prostate+cancer.">Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer.</a> J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).</li><li>Nord, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+amplifications+are+associated+with+high+grade+and+recurrences+in+stage+Ta+bladder+carcinoma.">Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma.</a> Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).</li><li>Tabach, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+the+20q+chromosomal+arm+occurs+early+in+tumorigenic+transformation+and+may+initiate+cancer.">Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer.</a> PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

ניתוח דנ&quot;א שלמות UCF הוא שיטה חדשה, לא פולשנית להערכת שלמות ה- DNA בשתן. הוצע לאחרונה לאבחון המוקדם של סרטן שלפוחית השתן וסרטן הערמונית 9 7,8. מספר יתרונות וחסרונות של הבדיקה התקינה DNA UCF נדונים כאן, יחד עם הזדמנות עתידית. ה...

תא ללא DNA ניתן לאתר בדם ובשתן בשל מוות של תאים על ידי מנגנונים אפופטוטיים או נמקי. דנ&quot;א נייד ללא בדם נחקר באופן נרחב למטרות אבחון ופרוגנוסטיים במחלות שונות, בעיקר סרטן 1. עם זאת, פחות ידוע על התפקיד ללא תא שתן (UCF) DNA. UCF DNA עשויה מהקורן חולף דם דרך מערכת סינון גלומרולרי או מתאי שמגיעים ישירות במגע עם נוזל 2 הגוף הזה (למשל, תאי urothelial או תאי ערמונית). שימוש DNA UCF כמקור ביומרקרים נחקר בעיקר לאבחון המוקדם של כליות, שלפוחית שתן, סרטן הערמונית בשל האחוז הגבוה של DNA UCF מגיע ישירות מתאי בדרך שתן 3,4. מעט מאוד ידוע על DNA UCF ואת השיטות הטובות ביותר לבידוד ואפיון זה. בהינתן ההשערה כי תאים סרטניים לשחרר קטעי דנ&quot;א עוד יותר מתאים רגילים, ההערכהשל שלמות ה- DNA בתא ללא נחקרה בניסיון להבהיר את מקור ה- DNA במחזור הדם 5. מספר מחקרים הוכיחו כי שלמות ה- DNA ללא תא דם מייצג בדיקת אבחון טוב עבור סוגים רבים של סרטן 6, ואותו ההשערה הוצעה ביחס שתן 7-9. מאמר זה מתאר שיטה חדשה לניתוח שלמות UCF DNA עם יישום פוטנציאל לגילוי סרטן שלפוחית ​​השתן וסרטן הערמונית. בפרט, על שלמות ה- DNA UCF שבר יותר מ -250 נ&quot;ב נבדקה 4 אזורים ידועים כבעל מספר עותק דנ&quot;א מוגבר בגידולים מוצקים, כולל ערמונית וסרטן שלפוחית השתן: c-myc (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), AR (Xq12) 10-14. אונקוגנים ספציפיים, ולא רצפים אקראיים, נבחרו כדי להגדיל את ההסתברות למציאת אותם בשבריר תא ללא של חולי סרטן. אחד היתרונות העיקריים שלשיטה זו היא כי היא גמישה וכי באזורים אחרים יכולים גם להיבחר על בסיס סוג גידול ומאפיין.

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&amp;nbsp;Green Supermix, 100 x 50 &amp;micro;L rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDT custom DNA oligos&amp;nbsp;</td><td>IDT&amp;nbsp;</td><td></td><td>HPLC purification, 100nMole DNA oligo</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA</td></tr><tr><td>Rotor-Gene 6000</td><td>Corbett</td><td></td><td>Another Real Time PCR instrument could also be used</td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>one centrifuge for 50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &amp;deg;C freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;#956;L pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette tips (10; 20; 200; 1,000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor-Disc 72 Rotor</td><td>Corbett</td><td>9018899</td><td></td></tr><tr><td>Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>Collection Tubes (2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer AL (264 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (10 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

cell-free dna integrity analysis in urine samples

למרות הנוכחות של מחזורי DNA ללא תא פלזמה או בסרום הוכחה נרחב להיות מקור מתאים של סמנים ביולוגיים עבור סוגים רבים של סרטן, כמה מחקרים התמקדו את הפוטנציאל של השימוש ללא תא שתן (UCF) DNA. החל מ ההשערות כי תאים אפופטוטיים נורמלי לייצר DNA מקוטעת וכי תאים סרטניים לשחרר עוד DNA, את התפקיד הפוטנציאלי של שלמות ה- DNA UCF הוערך כסמן אבחון מוקדם מסוגל להבחין בין חולים עם הערמונית או סרטן שלפוחית ​​השתן אנשים בריאים. ניתוח שלמות UCF DNA מוצע על הבסיס ארבעה PCRs כמוני בזמן האמת של ארבעה רצפים ארוכים מ -250 נ&quot;ב: c-myc, BCAS1, HER2, ו AR. רצפים כי לעתים קרובות יש מספר עותק דנ&quot;א גדל ב סרטן שלפוחית ​​השתן וסרטן הערמונית נבחרו לניתוח, אבל השיטה היא גמישה, וגנים אלה יוכל להחליף אותו עם גנים אחרים של inteמנוחה. את התועלת הפוטנציאלית של UCF DNA כמקור ביומרקרים כבר הודגמה עבור ממאירויות אורולוגים, ובכך לסלול את הדרך למחקרים נוספים על אפיון DNA UCF. המבחן שלמות ה- DNA UCF יש את היתרון של להיות לא פולשנית, מהירה, וקלה לביצוע, עם רק כמה מיליליטרים של שתן צורך לבצע את הניתוח.

ריכוז DNA חופשי הכולל היה לכימות על ידי spectrophotometry עבור כל הדגימות נותחו, מראה מגוון של בין 1.51 ו 138 ng / μL. חמש דגימות בקרה שימשו שחזור של נתונים: שני ניסויים בזמן אמת עצמאית בוצעו עבור c-myc, HER2, BCAS1, AR, ו STOX1. המקדמים של השתנות (CV) חושבו ?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples at JoVE.com

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

תא ללא DNA Integrity ניתוח בדגימות שתן

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

cell-free-dna-integrity-analysis-in-urine-samples

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

13.7K Views.  Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS. A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

Video: Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Genetics

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a reliable probability of the presence of pre-neoplastic or neoplastic colorectal lesions. This method, called fluorescence long DNA (FL-DNA), is a fast, non-invasive procedure that is an improvement upon the primary prevention system. This method is based on evaluation of fecal DNA integrity by quantitative amplification of specific targets of genomic DNA. In particular, the evaluation of DNA fragments longer than 200 bp allows for detection of patients with colorectal lesions with very high specificity. However, this system and all currently available stool DNA tests present some general issues that need to be addressed (e.g., the frequency at which tests should be carried out and optimal number of stool samples collected at each timepoint for each individual). However, the main advantage of FL-DNA is the possibility to use it in association with a test currently used in the CRC screening program, known as the immunochemical-based fecal occult blood test (iFOBT). Indeed, both tests can be performed on the same sample, reducing costs and achieving a better prediction of the eventual presence of colorectal lesions.

The presented diagnostic FL-DNA kit is a time-saving and user-friendly method to determine the reliable probability of the presence of colorectal cancer lesions.

הערכה של סרטן המעי הגס סיכון ושכיחות על ידי שרפרף DNA זיהוי שלמות

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

איתור דנ"א ללא תאים בדגימות פלזמה בדם של חולי סרטן

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that originate from the primary and/or metastatic tumor. LB has emerged as a mainstay in translational research and has started to become part of clinical oncology practice, providing a minimally invasive alternative to solid biopsy. The LB allows real-time monitoring of a tumor via a minimally invasive sample extraction, such as blood. The applications include early cancer detection, patient follow-up for the detection of disease progression, assessment of minimal residual disease, and potential identification of molecular progression and mechanism of resistance. In order to achieve a reliable analysis of these samples that can be reported in the clinic, the preanalytical procedures should be carefully considered and strictly followed. Sample collection, quality, and storage are crucial steps that determine their usefulness in downstream applications. Here, we present standardized protocols from our liquid biopsy working module for collecting, processing, and storing plasma and serum samples for downstream liquid biopsy analysis based on circulating-free DNA. The protocols presented here require standard equipment and are sufficiently flexible to be applied in most laboratories focused on biological procedures.

The liquid biopsy has revolutionized our approach to oncology translational studies, with sample collection, quality, and storage being crucial steps for its successful clinical application. Here we describe a standardized and validated protocol for downstream circulating-free DNA applications that can be applied in most translational research laboratories.

פרוטוקול קדם-אנליטי של ביופסיה נוזלית סטנדרטית ליישומי דנ"א ללא מחזור במורד הזרם

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of cytosine. Thus, it is crucial for genome integrity maintenance. A highly specific, non-labeled, non-radio-isotopic method was developed to measure UDG activity. A synthetic DNA duplex containing a site-specific uracil was cleaved by UDG and then subjected to Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysis. A protocol was established to preserve the apurinic/apyrimidinic site (AP) product in DNA without strand break. The change in the m/z value from the substrate to the product was used to evaluate uracil hydrolysis by UDG. A G:U substrate was used for UDG kinetic analysis yielding the Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/s, and Kcat = 9.31 s-1. Application of this method to a uracil glycosylase inhibitor (UGI) assay yielded an IC50 value of 7.6 pM. The UDG specificity using uracil at various positions within single-stranded and double-stranded DNA substrates demonstrated different cleavage efficiencies. Thus, this simple, rapid, and versatile MALDI-TOF MS method could be an excellent reference method for various monofunctional DNA glycosylases. It also has the potential as a tool for DNA glycosylase inhibitor screening.

A non-labeled, non-radio-isotopic method to assay uracil-DNA glycosylase activity was developed using MALDI-TOF mass spectrometry for direct apurinic/apyrimidinic site-containing product analysis. The assay proved to be quite simple, specific, rapid, and easy to use for DNA glycosylase measurement.

Uracil-DNA Glycosylase בדיקה על ידי טיהור לייזר בסיוע מטריקס / יינון זמן טיסה ניתוח ספקטרומטריה מסה

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

Biochemistry

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

קוונפיקציה של שלוש נגעים DNA ידי ספקטרומטר המוני והערכה של רמות שלהם ברקמות של עכברים חשופים החומר מקיף חלקיקים עדינים

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Immunology and Infection

בדיקת סמן ביולוגי סינתטי בשתן CRISPR-Cas לאבחון סרטן

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for traditional biofluid measurements. Synthetic biomarkers generally make use of reporters that provide readable signals in the biofluid to reflect the biochemical alterations in the local disease microenvironment during disease incidence and progression. The pharmacokinetic concentration of the reporters and biochemical amplification of the disease signal are paramount to achieving high sensitivity and specificity in a diagnostic test. Here, a cancer diagnostic platform is built using one format of synthetic biomarkers: activity-based nanosensors carrying chemically stabilized DNA reporters that can be liberated by aberrant proteolytic signatures in the tumor microenvironment. Synthetic DNA as a disease reporter affords multiplexing capability through its use as a barcode, allowing for the readout of multiple proteolytic signatures at once. DNA reporters released into the urine are detected using CRISPR nucleases via hybridization with CRISPR RNAs, which in turn produce a fluorescent or colorimetric signal upon enzyme activation. In this protocol, DNA-barcoded, activity-based nanosensors are constructed and their application is exemplified in a preclinical mouse model of metastatic colorectal cancer. This system is highly modifiable according to disease biology and generates multiple disease signals simultaneously, affording a comprehensive understanding of the disease characteristics through a minimally invasive process requiring only nanosensor administration, urine collection, and a paper test which enables point-of-care diagnostics.

מחבר זרקור: כלים מולקולריים הנדסיים לזיהוי מחלות והדמיה

This protocol describes a CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test that enables point-of-care cancer diagnostics through the ex vivo analysis of tumor-associated protease activities.

תא ללא DNA Integrity ניתוח בדגימות שתן

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

הערכה של סרטן המעי הגס סיכון ושכיחות על ידי שרפרף DNA זיהוי שלמות

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

איתור דנ"א ללא תאים בדגימות פלזמה בדם של חולי סרטן

פרוטוקול קדם-אנליטי של ביופסיה נוזלית סטנדרטית ליישומי דנ"א ללא מחזור במורד הזרם

Uracil-DNA Glycosylase בדיקה על ידי טיהור לייזר בסיוע מטריקס / יינון זמן טיסה ניתוח ספקטרומטריה מסה

קוונפיקציה של שלוש נגעים DNA ידי ספקטרומטר המוני והערכה של רמות שלהם ברקמות של עכברים חשופים החומר מקיף חלקיקים עדינים

בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas לאבחון נייד

בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas לאבחון נייד

בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas לאבחון נייד