Name: patch clamp recordings on intact dorsal root ganglia from adult rats
Uploaded: 2016-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.

윤리 정책 : 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 모든 절차는 동물 연구에서 UCSF위원회의 규정을 따른다 동물 사용 및 관리 (출판 (85)에 NIH 규정의 지침에 따라 수행되었다 - 23 1996 개정 ). UCSF 기관 동물 관리 및 사용위원회는이 연구에서 사용 된 프로토콜을 승인했다. 악기, 솔루션 및 요리 1. 준비 <ol><li> 인공 뇌척수액 (ACSF)를 준비합니다. <ol><li> 배 낮은 양이온 용액 500 ㎖, 10 배 수소 나트륨 용액 (용액의 조제 표 1 및 2 참조) 500㎖의 준비. 1 개월 이내에 4 O를 C 및 사용에 보관하십시오. </li><li> 중탄산 나트륨 용액 60 ㎖로 10 배 낮은 양이온 용액 60ml를 혼합하여 신선한 ACSF 600 ml를 준비하고 600 mL의 최종 부피에 도달 탈 이온수 480 ml에 추가한다. 버블 ACSF carbogen와사용하기 전에 적어도 10 분 동안 (5 % O 2, 95 % CO 2). </li></ol></li><li> 모세관 유리에서 패치 피펫을 당깁니다. <ol><li> 기록 피펫을 준비하는 피펫 풀러에 얇은 벽으로 둘러싸인 모세관 유리를 놓습니다. 연구실에서, 풀러 다음의 설정 파라미터가 이상적인 피펫 형상을 달성하는 데 사용된다 : 주 열 (510), 속도 (32). DRG 그대로 기록 용 피펫 이상적인 형상은 낮은 원뿔 각도 점진적가는 테이퍼 있어야하고, 이것은 가장 시행 착오에 의해 달성 될 수있다. </li><li> 내부 솔루션 (솔루션 준비를위한 표 3 참조)으로 가득 때 피펫의 저항이 3-5 MΩ 있는지 확인합니다. 피펫 저항 (18)을 측정하는 자세한 방법에 대해 축삭 설명서를 참조하십시오. </li></ol></li><li> 13 단위 / ㎖의 최종 농도를 수득하기 ACSF 400 μL로게나 1 ㎎을 추가. 그리고 콜라겐 용액 20 ㎕를 각각 유리 피펫을 입력합니다. 저장-20 O를 C의 냉장고에 채워진 피펫 3 주 내에서 사용합니다. </li><li> 차가운 ACSF (약 4 O를 C) 200 ㎖를 준비합니다. 이 동결 시작할 때까지 빠르게 ACSF를 냉각 비커에 배치하려면 약 20 분 동안 -20 O를 C 냉장고에 플라스틱 포장과 장소에 밀봉. 10 분 동안 carbogen와 얼음 욕조와 거품 비커를 놓습니다. 거품은 실온에서 carbogen와 ACSF의 400 ml의 나머지. </li><li> ACSF 냉각되는 동안, 5mm 직경의 개구 (이것은 DRG를 전송하는 데 사용된다) 확대 플라스틱 일회용 전달 피펫의 끝을 잘라. 다음과 같은 수술 도구를 수집 메스 (# 15), 메이요는 직선과 곡선 가위, 미세 2mm 팁 rongeur, Adson (톱니) 집게, 홍채 가위, 스프링 가위와 두 개의 미세 집게. 3 유리 페트리 접시에 산소 차가운 ACSF (: 10cm 외경)을 따르십시오. </li></ol> 2. DRG 해부 <ol><li> 나트륨 체육와 쥐 (200~220g)을 마취ntobarbital (100 ㎎ / ㎏, IP) 및 마취의 수준이 페달 반사와 눈 깜박임 반사를 테스트하여 적절한 지 확인합니다. </li><li> 쥐가 마취되어 있는지 확인한 후, 요추 영역을 면도하고, 중간 선을 따라 피부와 피하 조직을 절개. 좋은 골막 엘리베이터를 사용하여 L1-S2 수준에서 가시 돌기의 척추 주위 근육을 분리합니다. </li><li> S2에 L1에서 가시 돌기를 잘라 곡선 가위를 사용합니다. 2 ~ 3 분 (단계 1.5에서 준비) 노출 된 척추 약 L1 및 S1에서 가로 인하하고 일괄 척추의이 세그먼트를 제거하고 빨리 감기 ACSF로 잠수함 똑바로 메이요 가위를 사용합니다. 래트 깊은 펜토 바르 비탈 마취하에있는 동안 척추 DRGs의 제거 후, 안락사는 양자 개흉술 의해 수행된다. </li><li> 상기 제거 된 척추의 혈액 및 장착 된 조직을 세척 차가운 ACSF와 페트리 접시에 전송합니다. 유엽층을 제거하는 미세 rongeur을 SE는. 척수를 노출 microscissors와 정중선을 따라 뇌경막을 잘라. 조심스럽게 척수를 들어, 홍채 가위를 사용하여 척수에서 자신의 엔트리 포인트에 신경 뿌리를 절단 한 후 척수를 제거합니다. </li><li> 차가운 ACSF 가득 번째 페트리 접시에 DRGs에 남아있는 척추를 전송합니다. L4 및 횡 프로세스 및 좌골 신경에 상대적인 위치에 따라 L5 DRGs를 확인합니다. 참고 : 그대로 좌골 신경을 유지하는 L4와 L5 DRG를 (좌골 신경이 L4-6 척추 신경에서 유래)를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. </li><li> 주변의 결합 조직에서 DRGs를 무료로 뒤몽의 집게와 노이스 가위를 사용합니다. DRGs에 부착 된 신경근과 척수 신경을 유지합니다. </li><li> 더 해부에 대한 세 번째 페트리 접시에 DRGs를 이동 전송 피펫을 사용합니다. </li><li> 해부 현미경 신중 epineurium 주변 번째의 최대한 제거전자 DRG. <ol><li> 지느러미와 복부 뿌리는 DRG에 가입하고 DRG에서 복부 루트를 분리 개구부를 잘라 노이스 스프링 가위를 사용합니다. epineurium를 개최 뒤몽 #에게 무딘 팁 5 집게를 사용하고 epineurium에서 DRG 롤 다른 미세 집게를 사용합니다. </li><li> 미세 집게를 사용 DRGs에 많은 epineurium의 가능한 연결 제거를 계속합니다. 참고 잘 해부 DRG 다음 단계에서 좋은 소화를 획득하는 것이 중요하다. </li></ol></li></ol> 3. DRG 소화 <ol><li> 상기 기록 챔버로 이동 DRG. 신경 뿌리가 아래로 얼굴을 기원 DRG의 확인 측을 확인합니다. 주 : 이러한 방식으로, 대부분의 신경 세포가 접근 가능하다. </li><li> DRG을 안정 앵커를 사용합니다. 녹화 장비 옆 테이블에 배치 된 연동 식 펌프와 연결 플라스틱 관을 통해 0.5 ㎖ / 분의 속도로 관류 산화 된 ACSF DRG. </li><li> 세포가 복구 할 수 있도록 30 분 동안 기다린. CCD 카메라를 통해 40X 대물 배율 적외선 차동 인터페이스 콘트라스트 아래 DRG 품질 (IR-DIC) 광학 평가. 참고 : 좋은 DRGs는 일반적으로 많은 라운드, 잘 대조, 그 표면에 위성 아교 세포에 의해 둘러싸여 신경 세포가 포함되어 있습니다. </li><li> DRG 표면의 작은 영역 다이제스트. 주 : 유리 패치 피펫 튜브는 밀폐형으로 유리 피펫에 부착 될 수 있도록 작은 커플 링되어 피펫 홀더에 배치된다. <ol><li> 개별적으로 작은 직경의 고무 튜브의 두 조각을 통해 피펫 홀더에 두 1ml를 주사기를 연결합니다. 피펫 홀더 중 하나를 다른 하나에 빈 유리 피펫으로 콜라게나 가득 한 유리 피펫을 넣습니다. </li><li> 바로 DRG 위의 피펫을 배치하기 위해 미세 조작기를 사용합니다. 그런 다음, 현미경 배율에 따라, 5- 이상적으로 직경 피펫 팁 (의 개구부를 확대 조심스럽게 서로에 대해 두 피펫의 팁을 충돌10 μm의). </li><li> 홀더 및 플런저에게 약 0.5 ml의 변위에 의해 주사기를 연결하는 튜브를 통해 피펫 포함 된 콜라게나 제에 긍정적 인 압력을 간단히 가까운 DRG의 표면에 효소로 가득 피펫을 이동합니다. 주 : 압력하에 피펫으로부터 효소의 흐름이 약간 효소 애플리케이션 기호로서 기능 할 수 DRG 뉴런 사이의 공간이 확대된다. </li><li> 10 분 15 후, 나머지 epineurium의 파편이 관찰 될 때, 파편을 멀리 빨아 빈 피펫에 부드러운 음의 압력을 적용합니다. 주 :이 방법에서, 신경 세포와 주변 위성 신경교 세포가 분명히 노출되는 패치 녹음 준비. </li><li> 날카로운 물건 용기에 두 피펫을 폐기하십시오. </li></ol></li></ol> 4. 패치 클램프 녹음 <ol><li> 열화를 방지하는 얼음 전극 액 (표 3 참조)를 배치했다. 으로 유리 패치 피펫을 기입필터링 된 세포 용액 (주사기 필터, 기공 크기 : 0.2 μm의)와 headstage 피펫 홀더에 피펫을 배치합니다. 목욕 솔루션에 피펫을 낮추는 전에 1 ml의에 대한 플런저를 변위에 의해 5 ML의 주사기를 통해 피펫에 부드러운 긍정적 인 압력을 적용합니다. 참고 :이 차단되는 것을 피펫을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 다음 소프트웨어의 &quot;막 테스트&quot;인터페이스를 열고 앰프 모드 노브를 돌려 &quot;V-클램프&quot;모드를 선택합니다. 현미경 검사에서 대상 신경 세포에 가까운 피펫을 이동합니다. 주 : 그대로 DRG 제제에서, 위성 신경교 세포의 박층 각 뉴런을 캡슐화한다. </li><li> 관찰 뉴런과 위성 신경교 세포의 주변 층과의 거리가 갑자기 확대까지 위성 신경교 세포 층을 통과 할 피펫으로부터 정압을 사용한다. 는 &quot;보조개는&quot;신경 세포에서 관찰 될 때까지 신경 세포를 향해 피펫을 이동하십시오. 참고 :와 비교해리 된 뉴런에서 녹화는 양압 위성 신경교 세포 층을 관통하고 성공적인 패치에 대한 가능성을 향상시키는 데 도움이되는, 약간 클 필요가있다. </li><li> 긍정적 인 압력을 줄일 수 있습니다. 다음으로, 부드러운 흡입과 기가 옴 밀봉을 얻을 수 있습니다. 주 :이 방법에서는, 기록의 성공 확률은 70 % 이상이다. </li><li> 이전 19 설명 된대로 전체 셀 기록 구성을 얻습니다. <ol><li> 간략하게, 짧지 만 강하고, 흡입을 통해 신경 세포막을 관통. 흡입이인가 된 상태에서 대안 적으로, 상기 증폭기의 &quot;겠&quot;기능을 사용한다. </li><li> 전체 셀 모드로 설정되면, 증폭기의 용량과 저항을 보상 손잡이를 돌려 전체 셀 용량과 직렬 저항 (RS)을 보상한다. 참고 : 루피는 일반적으로 5 ~ 20 MΩ입니다. </li><li> 중계국 처음 30 MΩ 이상이면 세포 포기; 녹화 중 20 % 이상 또는 루피 변경됩니다. 또한휴지 막 전위를 측정; 휴지 막 전위는 -50 MV 이상이면 세포를 포기. </li></ol></li><li> 은 &quot;멤브레인 테스트&quot;창을 닫습니다. 앰프의 모드 노브를 돌려 &quot;I-클램프 정상&quot;모드를 선택합니다. </li><li> 소프트웨어의 &quot;개방형 프로토콜&quot;을 클릭하여 선택하고 rheobase 측정을위한 프로토콜을로드합니다. 녹음을 시작합니다 &quot;기록&quot;을 클릭합니다. 입력 저항을 측정하고 100 펜실바니아 단계로 전류를 탈분극의 등급 시리즈를 주입하여 신경 세포의 흥분을 검토 rheobase. <ol><li> 다시 &quot;개방형 프로토콜&quot;을 클릭하고 막 임계 값을 측정하기위한 프로토콜을 선택합니다. 램프 전류 (2000 PA / S)를 탈분극 500 밀리 뉴런에 주입한다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 기록 된 흔적을 분석하는 데이터 수집 및 분석 소프트웨어 (예 : Clampfit)를 사용합니다. 정상 상태의 IV relat에 기초하여 상기 입력 저항 (린)를 계산하는 소프트웨어를 사용하여전달 된 hyperpolarizing 전류 동안 ionship. rheobase 멤브레인 임계 값을 측정하기 위해 커서를 이동합니다. 주 : AP를 유도하는데 필요한 전류의 진폭이 rheobase로 정의되고, AP 유도 가장 낮은 전압이 임계 막으로서 정의된다. </li></ol></li><li> 리간드 유도 전류를 기록한다. <ol><li> 특정 효능과 피펫을 입력합니다. 참고 : 현재 보고서에서, 우리는 각각의 글루타메이트 수용체 및 TRPA1 수용체에 의해 매개되는 전류를 유도하기 위해 100 μM 글루타메이트 100 μM AITC을 사용했다. </li><li> 내부에 기포가 없는지 확인하기 위해 피펫을 확인합니다. 피펫 홀더에 피펫을 배치합니다. 약물 분배 시스템에 연결된 튜브 피펫 홀더를 연결한다. </li><li> 신경 세포의 50 μm의 내에서 피펫을 이동 조작을 사용합니다. 한 PSI에 약물 분배 시스템 압력 및 1 초의 지속 기간을 설정한다. 전압 클램프로 촬영 모드를 전환하고 -70 MV에 클램프. 간단히 약물 - 유도 전류를 기록하는 약물 분배 시스템을 통해 압력을 적용한다. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

우리는 패치 클램프 연구 전체 DRGs을 제조하는 방법을보고한다. 이상적인 표본을 준비하기위한 몇 가지 핵심 요소가 있습니다. 첫째, 부착 등의 뿌리와 DRGs를 해부하는 것이 중요하다. 그 후, epineurium은 신경의 손상을 방지하면서 조심스럽게 제거해야한다. 마지막으로, 신경 세포 및 그 주변 위성 신경교 세포를 노출 시키도록, 상기 나머지 결합 조직을 소화 할 필요가있다. 여기에 기술 된 방법으?...

감각은 유기체의 생존과 복지에 필수적이다. 자극의 전달은 일차 감각 신경 세포의 축삭 외주 말단부터 감각 경로에 의존한다. 차 감각 뉴런, 삼차 신경의 중뇌 핵 제외한 삼차 신경절 및 후근 신경절 (DRGs)에 위치하고있다. 그들은 감각 정보 1의 게이트 키퍼 역할을합니다. perikarial 막에서 바로 중추 및 말초 말단에 같은 DRG 뉴런 등 글루타메이트 수용체, TNF 알파 수용체 일과성 수용체 전위 양이온 채널 아과의 V 부재 (1) (TRPV1), 나트륨 채널이 같은 수용체 이온 채널을 표현할 -7. perikarial 막 패치 클램프 녹음은 신경 세포에 걸쳐 이들 수용체 및 채널의 많은 기능 변화를 이해 할 수 있습니다. 패치 클램프 녹음 기술은 스투위한 강력한 도구입니다채널 또는 수용체 연구 다수의 활동 죽는 것은 DRG 뉴런 8-10에이 기술을 적용함으로써 수행되었다. 대부분의 연구에서 DRG는 지느러미 작은 뿌리와 신경절에 척추 신경 주변을 절단하여 제거한다. 닦지 후 신경절 후 다음 기록 이전에 수일 동안 배양 즉시 또는 기록 될 수있다 DRG 뉴런의 해리 될 소화 효소에 배치된다. 불행하게도, DRG 뉴런의 분리는 perikarya에 가까운 필요한 axotomy을 포함한다. 일단 해리와 axotomized, DRG 뉴런은 막 흥분 11, 12에서 표현형의 변화뿐만 아니라 변화를 겪는다. 일반적으로 그들을 둘러싸는 개별 뉴런 perikarya 및 위성 신경교 세포 사이의 접촉의 감소는 이러한 변경 13에 기여할 것으로 예상된다. 뉴런과 위성 신경교 세포 사이의 크로스 토크는 생리 학적 조건에서 필수적이고 patholog 적응 모두 인같은 난치성 통증 14, 15로 이어지는 것과 같은 iCal의 조건. 해리 DRG 제제를 사용하여 신경 교세포와 위성 사이의 상호 작용을 연구하기가 어려울 것이다. 그대로 DRGs, 다른 한편으로는, 생체 상태에 가깝게 제공한다. 지난 몇 년 동안, 우리의 실험뿐만 아니라 다른 그룹은 만성 통증 3-5,11,15-17와 관련된 다양한 조건의 차 감각 뉴런의 변화를 조사하기 위해 성인 쥐에서 그대로 DRGs를 사용하고있다. 이러한 연구에서 사용 된 기술은 어느 정도 성립하지만, 단계별 설명은 아직 출판되지 않았다. 본 원고에서는 그대로 DRGs 및 패치 클램프 녹음에 대한 사용을 준비하는 편리하고 빠른 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital sodium</td><td>vortech Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml, 5 ml.</td></tr><tr><td>scalpel</td><td>BD</td><td></td><td>size: 15</td></tr><tr><td>Mayo straight scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Mayo curved scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>14011-15</td><td></td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Adson toothed forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Noyes spring scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>15124-12</td><td></td></tr><tr><td>Bone scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>16044-10</td><td>Special for cutting the bones.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased.</td></tr><tr><td>periosteal elevator</td><td>Sklar</td><td>97-0530</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>WILD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Fisher brand</td><td>13-711-5AM</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (10 cm)</td><td>Pyrex</td><td></td><td>Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps</td></tr><tr><td>Collagenase (Liberase TM)</td><td>Roche</td><td>05-401-119-001</td><td>dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw.</td></tr><tr><td>filter</td><td>Thermo scientific</td><td>7232520</td><td>Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog.</td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Sutter</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Anchor</td><td>Havard apparatus</td><td>64-0250</td><td>stabilize the DRG to avoid drift.</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette puller</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular devices</td><td>1440D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>NIKON</td><td>FN600</td><td></td></tr><tr><td>Micro-manipulator</td><td>Sutter</td><td>MPC200</td><td></td></tr><tr><td>microinjection dispense system</td><td>General Valve</td><td>Picrospitzer II</td><td>fast drug application system</td></tr><tr><td>Carbogen (95% O2, 5% CO2)</td><td>Local Medical Gas supplier</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

patch clamp recordings on intact dorsal root ganglia from adult rats

후근 신경절에서 패치 클램프 연구 (DRGs) 신경 세포는 말초 신경계에 대한 우리의 이해를 증가하고있다. 현재 녹음의 대부분은 대부분의 실험실에 대한 표준 준비입니다 해리 DRG 뉴런에 실시하고 있습니다. 신경 특성 그러나, 해리 뉴런 취득에 사용 된 효소 분해로 인한 축삭 손상에 의해 변경 될 수있다. 기본 감각 뉴런을 둘러싸 위성 아교 세포와 접촉의 손실이 방법의 피할 수없는 결과이기 때문에 또한, 해리 신경 준비는 완벽하게 DRG의 미세 환경을 대표 할 수 없습니다. 이 보고서에서, 패치 클램프 녹음을 위해 기존의 해리 DRG 뉴런을 사용하여 한계를 극복하기 위해 우리는 그대로 DRGs를 준비하고 각각의 기본 감각 뉴런 생체에 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식의 흉내 그대로 DRGs의 빠르고 간단한 준비를 허용그 주변 위성 신경교 세포 기저막과 연관된 DRG 뉴런 유지하여 생체 내 조건. 또한,이 방법은 조작에서 축삭 손상을 방지하며 DRGs 해리 때와 같이 소화 효소. 이 생체 제제는 별도로 차 감각 뉴런과 위성 신경교 세포 사이의 상호 작용을 연구하는데 사용될 수있다.

그림 1은 패치 기록에 그대로 DRG를 준비하는 과정을 보여줍니다. 그림 1A는 추궁 절제술. Figure1B 후 신경의 노출 위치와 척수를 제거한 후 부착 된 신경 뿌리와 L3, L4와 L5 DRGs를 보여줍니다를 보여줍니다. 그리고 L4, 5 DRGs 신중하게 해부하고 척추에서 해방됩니다. 다음에, epineurium 상기 DRG를 둘러싼 투명 막 (노란 화살표도 1D)을</stro...

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Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

성인 쥐에서 본래 등쪽 뿌리 신경절에 패치 클램프 녹음

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

patch-clamp-recordings-on-intact-dorsal-root-ganglia-from-adult-rats

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.2K 조회수.  University of California, San Francisco. This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

비디오: Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

연구

신경과학

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

배근 잠재적 기록하여 생쥐의 척수 시냅스 억제를 측정<em&gt; 생체</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for nerve fibers in the central and peripheral nervous systems. This method is particularly applicable to dorsal root ganglia (DRG), which are primary sensory neurons that exhibit a pseudo-unipolar structure of nervous processes. The patterns and features of the action potentials passed along axons are recordable in these neurons. The present study uses in vivo single-fiber recordings to observe the conduction failure of sciatic nerves in complete Freund&#8217;s adjuvant (CFA)-treated rats. As the underlying mechanism cannot be studied using in vivo single-fiber recordings, patch-clamp-recordings of DRG neurons are performed on preparations of intact DRG with the attached sciatic nerve. These recordings reveal a positive correlation between conduction failure and the rising slope of the after-hyperpolarization potential (AHP) of DRG neurons in CFA-treated animals. The protocol for in vivo single fiber-recordings allows the classification of nerve fibers via the measurement of conduction velocity and monitoring of abnormal conditions in nerve fibers in certain diseases. Intact DRG with attached peripheral nerve allows observation of the activity of DRG neurons in most physiological conditions. Conclusively, single-fiber recording combined with electrophysiological recording of intact DRGs is an effective method to examine the role of conduction failure during the analgesic process.

Single-fiber recording is an effective electrophysiological technique that is applicable to the central and peripheral nervous systems. Along with the preparation of intact DRG with the attached sciatic nerve, the mechanism of conduction failure is examined. Both protocols improve the understanding of the peripheral nervous system&#39;s relationship with pain.

전도 실패의 메커니즘을 검사하기 위해 연결된 Sciatic 신경을 가진 생체 내 단일 섬유 기록 및 손상되지 않은 등철 루트 신경절의 사용

Single-fiber recording has been a classical and effective electrophysiological technique over the last few decades because of its specific application for ...

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter receptors that contribute to cell diversity across this population. This protocol outlines the steps necessary for successful dissecting, dissociating, and short-term culturing of the somata of inner ear bipolar neurons for the purpose of patch-clamp recordings. Detailed instructions for preparing vestibular ganglion neurons are provided with the necessary modifications needed for plating spiral ganglion neurons. The protocol includes instructions for performing whole-cell patch-clamp recordings in the perforated-patch configuration. Example results characterizing the voltage-clamp recordings of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN)-mediated currents highlight the stability of perforated-patch recording configuration in comparison to the more standard ruptured-patch configuration. The combination of these methods, isolated somata plus perforated-patch-clamp recordings, can be used to study cellular processes that require long, stable recordings and the preservation of intracellular milieu, such as signaling through G-protein coupled receptors.

Presented here are methods providing detailed instructions for dissecting, dissociating, culturing, and patch-clamp recording from vestibular ganglion and spiral ganglion neurons of the inner ear.

Patch-Clamp 기록을 위해 신생아 설치류에서 전정 및 나선형 신경절 소마타를 분리 및 배양합니다.

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

척수 자극에 대한 운동 뉴런 반응의 이해

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

저자 스포트라이트: Advancing Spinal Cord Stimulation - Exploring the cellular responses of motor neurons through patch-clamp electrophysiology (척수 자극의 발전 - 패치클램프 전기생리학을 통한 운동 뉴런의 세포 반응 탐구) 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

척수 자극 중 운동 뉴런의 전체 세포 패치-클램프 기록을 위한 척수 절편의 생체 외 제조

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...

<meta charset="utf8"></head><body>심폐 감각 뉴런을 위한 흉부 분절 T1 DRG의 칼슘 이미징

In Vivo Thoracic Dorsal Root Ganglia (DRG) Calcium Imaging and ECG Recording for Studying Peripheral Nerve Stimulation

The dorsal root ganglia (DRG), housing primary sensory neurons, transmit somatosensory and visceral afferent inputs to the dorsal horn of the spinal cord. They play a pivotal role in both physiological and pathological states, including neuropathic and visceral pain. In vivo calcium imaging of DRG enables real-time observation of calcium transients in single units or neuron ensembles. Accumulating evidence indicates that DRG neuronal activities induced by somatic stimulation significantly affect autonomic and visceral functions. While lumbar DRG calcium imaging has been extensively studied, thoracic segment DRG calcium imaging has been less explored due to surgical exposure and stereotaxic fixation challenges. Here, we utilized in vivo calcium imaging at the thoracic1 dorsal root ganglion (T1-DRG) to investigate changes in neuronal activity resulting from somatic stimulations of the forelimb. This approach is crucial for understanding the somato-cardiac reflex triggered by peripheral nerve stimulations (PENS), such as acupuncture. Notably, synchronization of cardiac function was observed and measured by electrocardiogram (ECG), with T-DRG neuronal activities, potentially establishing a novel paradigm for somato-visceral reflex in the thoracic segments.

<meta charset="utf8"></head><body>말초 신경 자극 연구를 위한 생체 내 흉부 등근 신경절(DRG) 칼슘 영상 및 ECG 기록

This study presents a surgical manipulation to expose the T-DRG in anesthetized mice for in vivo calcium imaging, along with synchronous ECG recordings. This method represents a cutting-edge tool for studying peripheral electric nerve stimulation and thoracic visceral organ inputs, as well as their interactions at the primary sensory level.

말초 신경 자극 연구를 위한 생체 내 흉부 등근 신경절(DRG) 칼슘 영상 및 ECG 기록

The dorsal root ganglia (DRG), housing primary sensory neurons, transmit somatosensory and visceral afferent inputs to the dorsal horn of the spinal cord. ...

성인 쥐에서 본래 등쪽 뿌리 신경절에 패치 클램프 녹음

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마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

배근 잠재적 기록하여 생쥐의 척수 시냅스 억제를 측정

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

전도 실패의 메커니즘을 검사하기 위해 연결된 Sciatic 신경을 가진 생체 내 단일 섬유 기록 및 손상되지 않은 등철 루트 신경절의 사용

Patch-Clamp 기록을 위해 신생아 설치류에서 전정 및 나선형 신경절 소마타를 분리 및 배양합니다.

척수 자극 중 운동 뉴런의 전체 세포 패치-클램프 기록을 위한 척수 절편의 생체 외 제조

척수 자극 중 운동 뉴런의 전체 세포 패치-클램프 기록을 위한 척수 절편의 생체 외 제조

척수 자극 중 운동 뉴런의 전체 세포 패치-클램프 기록을 위한 척수 절편의 생체 외 제조

말초 신경 자극 연구를 위한 생체 내 흉부 등근 신경절(DRG) 칼슘 영상 및 ECG 기록