Name: subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons at JoVE.com

Ben konfokal mikroskop, ikinci Axopatch 200B amplifikatör hediye Dr Jacques DESTINE, GIGA-Görüntüleme ile önerileri için yaptığı sürekli destek için Dr. Vincent Seutin, Christelle GILLISSEN ve mükemmel teknik yardım için Laurent Massotte, Dr Jean Defourny ve Sandra Ormenese teşekkür eleştirel yazının okunması için konfokal mikroskop ve Imaris yazılım ve Dr Stephen Freeman paylaşımı için bir platform. Bu çalışma Belçikalı FRS hibe ile desteklenmiştir - FNRS (U.N002.13 ve T.N0015.13) ve Belçikalı Üniversitesi Vakfı&#39;nın desteğiyle (halkla avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique) ile yayınladı.

Yazar o hiçbir rakip mali çıkarlarını sahip olduğunu beyan eder.

Bu rapor ikili somatodendritik tam hücreli kayıtları ve yerel dendritik kayıtları uygulamak için bir adım-adım protokolü açıklanır. Sırasıyla, postsinaptik potansiyeller zamanla iyon kanalları (yani, İH) etkisini belirlemek ve nigral DA nöronların somatodendritik bölgeleri boyunca iyon kanalı (lH) dağılımını haritalama için kullanışlıdır. Elde edilen elektrofizyolojik ölçümler hücre morfolojisi kurtarmak için hoc histokimya göndermek için birleştirilir. Prosedür substantia nigra bulunan DA nöronları araştırmak için kullanıldı, ancak komşu nigral GABA nöronlar, ventral tegmental alan DA nöronları ya da diğer orta beyin nöronları için genelleştirilebilir. Tüm adımlar da önemli değişiklikler olmadan nigral nöronların dendrit ifade diğer iyon kanallarını incelemek için takip edilebilir. Post hoc görselleştirme akson-rulman ile nöronlar için özellikle uygun olduğunuBöyle nigral nöronlar 25,26, hipokampal oriens-alveus internöronlar 21 ya da bazı CA1 piramidal nöronlar 67 olarak dendritler. İlginçtir, bu özelliği paylaşan nöronlar genellikle 67 düşündüğümden daha yaygın olduğu görülüyor. Morfolojik analizi de elektrotlar ve akson kesin konumunu ortaya koymaktadır. Ikinci tespit immünohistokimya 68,69 kullanılarak akson başlangıç çizgi parçasının (voltaj kontrollü, Na + kanal veya Ankirin G) &#39;de ifade edilen proteinlerin etiketlenmesine ile optimize edilebilir. dendritik kayıtları ve sonraki nöronal etiketleme ile toplanan verilerin güvenilirliği her zaman dilim kalitesine bağlıdır. En kusursuz nedenle ihtiyaç doku içindeki hücrelerin canlılığını korumak için uygulanır. Bu dilim hazırlıkları süresince sağlıklı hayvanlardan, yüksek kaliteli araçları ve reaktifler, doku ve buz gibi soğuk sıcaklıklar yeterli oksijenizasyonun nazik işleme ile elde edilir. Kararlı kayıt koşulları sağlıklı nöronların seçimi güveniyor. Bütün hücre modunda, seri direnci, başlangıçta mümkün olduğu kadar düşük olması ve deney boyunca sabit tutulur gerekir. Kayıtların istikrar sürüklenme ve titreşim yoksun yüksek kaliteli manipülatörler hakkında daha fazla bağlıdır. pipet tutucu bağlantısını kontrol ve headstage, mikromanipülatör kabloları gevşek olduğunu kontrol, sıcaklık ya da sahne hareketi ani değişiklikler kaçınarak ve manipülatör mekanizması kontrol: Bu tedirginlikler pipet istikrar optimize ederek azaltılabilir. Çift kayıtlar için, metilsülfat 13,15,21 hücre içi çözelti içinde dahil edilmiştir, ancak glukonat 9,14,25 alternatif olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, temel anyon 70,71 potansiyel membran ve bir voltaja bağımlı akımlar 72 değiştirebilir. Hücre içi çözüm ATP, GTP ve physiolo korumak için phosphocreatine ile takviye edilebilirnöronların jik fonksiyonları. Örneğin, bir basınç uygulama yer için ek olarak, pipet çözeltisi bir floresan boya eklenmesi (örneğin, Alexa 594 veya sülforodamin 101 41) yararlı olabilir somatik kayıt sırasında dendritler görselleştirmek için (Ref Şekil 7. 41) ya da elektrikli bir uyarıcı pipet. Hücre bağlı kayıtları için pipet çözümü büyük bir h kaydetmek için yüksek K + konsantrasyonu ve hiçbir Na + içerir. Kayda Değer Na + / K + konsantrasyon oranı geçerli genliği 10, mevcut 11 ters potansiyeli ve h 73 yolluk etkiler. Alternatif olarak, ben h de dışında-çıkışları 10 kullanılarak kaydedilebilir. Bununla birlikte, bu kayıt yapılandırmada, kanalların yakınında hücre içi ortamı tedirgin olabilir. Sonuç olarak, bir voltaja bağımlı aktivasyonuna farklılıklar &lt;karşılaştıran akımları hücre bağlı yamaları ve dış-çıkışları 10 kullanılarak elde zaman sub&gt; h görülmektedir. Nöronların Şişme bazen yama-kelepçe kayıt sırasında karşılaşılan ve sık sık bu tür çözümlerin bileşiminde çözümler 39 veya hatalar hücre içi ve dışı arasında su kalitesinin düşük, güçlü dengesizlik ozmolarite veya pH gibi farklı nedenlerden kaynaklanan bir. elektrofizyolojik kayıtlar kalitesi iyileşti nöronların morfolojisi kalitesi üzerinde doğrudan bir oranına sahiptir. Hücre içi ortamın 14 seyreltme en aza indirmek için, hücre bağlı kaydından sonra - (sayılı referanslarda 6,11 olarak 10 M?. 6) ve tek bir somatik kayıtlar için yüksek direnç somatik pipetler çift kayıtlar için kullanılır. Hücre bağlı kayıt aşağıdaki bütün hücre somatik kayıt nedenle kısa (&lt;10 dk) tutulur. Somatik ve dendritik iki pipetler-dış plasterlerini c uygun kapama için gerekli olanell membran ve hücre morfolojisi sonraki iyileşme. Hücrenin yapısına ek olarak, nörokimyasal içerik kaydedilir nöronlar 59,74 için tespit edilebilir. Örneğin, hücre içi protein tirosin hidroksilaz DA nöronlarının 13 kesin tanımlanması için immunolabeled edilebilir. DA nöronlar ağırlıklı SN yoğunlaşmıştır SN mevcut çok daha düşük yoğunluğa sahip, pars compactadaki onlar GABA nöronlar 75 daha yüksek bir sayı ile karışmış olan reticulata, pars. DA nöronların hücre gövdesi GABA nöronların genellikle daha büyük olmakla birlikte, kızılötesi-videomikroskopi bu hücrelerin görsel tanımlama belirsiz ve kısmen pars compacta&#39;da opaklık tarafından engellenmektedir. Bu sınırlamaları aşmak için, DA nöronların ön seçim nöronlar (DA nöronlar için TH 65 veya DAT GAD belirli bir popülasyonda bir flüoresan işaretleyici ifade eden transgenik farelerin kullanılması ile kolaylaştırılabilirGABA nöronlar) ve epifloresans aydınlatma. Seçenek olarak ise, bir floresan boya dendritler görselleştirme kolaylaştırmak için somatik elektrot çözelti içinde ilave edilebilir. Floresan hücrenin artan çözünürlük Nipkow dönen disk konfokal 14,22,30 veya IR-DGC 6 kombine iki foton mikroskopi 7 tarafından getirilir. Çeşitli avantajlar DIC göre DGC ile ilgilidir. DIC prizma gerekli değildir Birincisi, IR-DGC görüntü floresan görüntü 49,52,53,76 ile kaplanmış olabilir. İkinci olarak, DGC photostimulation ve 77 optogenetics birleştirilebilir. dilim hazırlık bir dezavantajı, nöronların bütünlüğünü korumaktır. DA nöronlar üç uzamsal düzlemde 78,79 kendi dendrit uzanır ve bu nedenle, dendritik bölmenin kesme tam dilimleri 80 önlenemez. dilim yönelim seçimi (koronal, yatay ya da para) Sagital bir trade-off. innervasyon ve deneysel tasarım kökeni dilimleri doğru yönünü seçmek için dikkate alınmalıdır. Doğrudan dendritik yama hücrelerin farklı bölümlerinde fonksiyonel iyon kanallarının dağılımının haritasının çıkartılması kullanılan bir tekniktir. Buna ek olarak, bu teknik, kanallar 20 işlevsel özelliklerinde değişkenliği belirlemek sunar. Bir tamamlayıcısı olarak iyon kanallarının konumu ve yoğunluğu ışık ve elektronik mikroskopi düzeylerinde 17,23 de immünhistokimya kullanılarak tespit edilebilir. Bu yaklaşım aynı zamanda yama pipetler için erişilemez küçük kalibreli yapılarda kanal yoğunluğunu belirlemek için imkanı sunuyor. Bununla birlikte, bu kanallar patch-clamp tekniği kullanılarak kaydedilen kişilerce kıyasla belirgin bir fonksiyonel durum 24 ya da inaktif olabilir. Her iki teknik konumu ve özellikleri tam bir resmini elde etmek için bu nedenle gereklispesifik hücresel bölgesinin 17 iyon kanalları. Voltaj duyarlı boyaların gelişmesiyle birlikte, gerilim görüntüleme birden çok yerde 81 de AP ve nöronlarda EPSPS yayılmasını incelemek için kullanılır olmuştur. Çift patch-kelepçe kayıtları bir alternatif olarak, bu yaklaşım bile yama pipetler için erişilebilir değildir ama sinyal ve ortalamanın doğru kalibrasyon gerektiren ince dendritler için uygulanabilir. SN ve ventral tegmental alandaki DA nöronlar yaygın fizyolojik ve patofizyolojik bağlamda somatik kayıtları aracılığıyla incelenmiş olmakla birlikte, bunların dendritler fonksiyonel özellikleri her iki durumda da büyük ölçüde bilinmemektedir. Dendritler gelen Yama başarı 13,25,26 ile çeşitli gruplar tarafından nigral dopamin nöronları için uygulanan ve bu güzel hücre içi yapıların 8 heyecanlı özelliklerini incelemek için tercih edilen bir yöntem olmaya devam edilmiştir. Dendritik kayıtları başka bir firsattir sağlamakdilmekte verimliliği ve sinaptik iletim plastisite ve dendritik eksitabiliteye 82,83 plastisite irdelemek.

Nöronlar kendi dendritler ağırlıklı sinaptik bilgi almak. Uyarıcı ve aksiyon potansiyelleri (AP) çıkış sinyali olarak uyarılmış bütünleşme sitesine nesil kendi sitesinden yayılan inhibitör sinaptik sinyalleri. Yolda, sinaptik potansiyeller dendrit yapısı ve pasif ve aktif membran özellikleri arasındaki etkileşim hem etkilenir. Bu son derece değişken parametrelerin kombinasyonu nöronlar 1,2 hesaplama gücünü genişletmektedir. Ancak, dendritler küçük çaplı ancak kendi elektriksel özelliklerinin incelenmesini engellemektedir. 6,7 dendritlerindeki - (3 mikron Ø 0.7) patch-kelepçe tekniği 3 sürekli gelişim, son yıllarda optik 4 ve dilim hazırlama 5 için yöntemler arıtma çok ince kayıtları sağlamıştır. Bu yöntemler vardı ve hala büyük ölçüde çeşitli o içinde dendritler heyecanlanma incelemek için kullanılırf nöronlar 8. Doğrudan dendritik kayıtları fonksiyonel özellikleri farklı nöronal bölümlerinde iyon kanallarının 20-22 dağılım 9-19 ve farklılıkları belirlemek için gereklidir. Bu veriler, ışık ve elektron mikroskobu 23,24 kombine immünhistokimya ile tespit edilen iyon kanal dağılımlarının gerekli bir tamamlayıcıdır. Çift somatodendritik kayıtları detaylı pasif kablo modelleri, aksiyon potansiyeli 9,13-15,21,22,25-27 ve nöronların somatodendritik etki boyunca sinaptik potansiyellerin 13,16,18 yayılması yayılmasını keşfetmek elde etmek için uygulanmaktadır 28- 30 ve nöronal entegrasyon 31 zamansal çözünürlüğe araştırmak. substantia nigra (SN) gibi hareketin kontrolü, ödül ve alışılmış davranışları kodlama gibi çeşitli fonksiyonlar yer alan orta beyinde yer alan bir bölgedir. Belirli nedeniyle dopamin azalmaSN dopaminerjik (DA) nöron kaybı, Parkinson hastalığı 32 mustarip hastalarda gözlenen motor bozuklukları ile bağlantılıdır. dopaminerjik ve GABAerjik nöronlar: nigral devresi iki hücre tipinde oluşmaktadır. İlginçtir, bu nöronlar diğer nöronlardan ayırt birçok özgü özellikleri vardır. DA nöronlar ve bazı GABA nöronların büyük bir bölümünün akson dendritik çardak heterojen (akson taşıyan ve akson-eksik dendritler) 25,26,33 olduğunu belirten bir dendritik sitesinden kaynaklanır. Soma kadar, dendritler başlayarak ve son olarak 34 akson için: bu nöronların morfolojisi bilgi aktarımı dinamik Cajal yaydığı kutuplaşma yasasını takip ettiği nöronların tipik organizasyonu ile bu nedenle tezat. DA nöronlar, aynı zamanda, kendi dendritler 35 dopamin serbest patlama aktivitesi 36 ve NMDA reseptörü plastisite 37 neden olduğu bilinmektedir. dissecBu olayların tion onlar başlatılan sitesinden doğrudan kayıtları olmadan zor olduğunu. hassas konum ve iyon kanallarının fonksiyonel özellikleri ve nigral nöronlar dendritik heyecanlanma ve bilgi transferi rollerine arasındaki ilişki içine anlayışlar kazanmak için, doğrudan dendritik kayıtlar tercih edilen yöntem vardır. Bu rapor nigral nöronların dendrit ve ilgili post hoc biocytin etiketleme tek ve çift yama-kelepçe kayıtları elde etmek için kullanılabilir detaylı yordam açıklanır. somatik ve dendritik membran yama için temel ilkeler çok benzer. Pratikte, ancak dendritik sitelerden kayıtları somatik kayıtları karşılaştırıldığında özel optimizasyon gerektirir. Başarılı dendritik kayıtları dilimleri, optik optimal ayarı, kayıtların yama pipet ve istikrar nazik yaklaşımı kalitesine güveniyor.

<table><tbody><tr><td>Double-distillated water</td><td>Millipore</td><td>Super Q</td><td>Resistivity &gt;14 M&amp;Omega; cm, ideal 18.2 M&amp;Omega; cm at 25&amp;nbsp;&amp;deg;C, filtered (0.22 &amp;micro;m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>Microfilter candles</td><td>Robu</td><td>Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter</td><td></td></tr><tr><td>Tissue slicer with vibroprobe</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40</td></tr><tr><td>Tissue slicer</td><td>Dosaka</td><td>DTK-1000</td><td>cutting parameters: speed 4, frequency 7</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Gilette</td><td>Super Silver</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reserve chamber</td><td></td><td></td><td>Custom-made</td></tr><tr><td>PP beckers</td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0.22 &amp;micro;m</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue&amp;nbsp;</td><td>UHU</td><td>&quot;Sekunden Kleber&quot;</td><td>liquid glue</td></tr><tr><td>Recording chamber&amp;nbsp;</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>Slice mini chamber</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed</td></tr><tr><td>Dental wax</td><td>Colt&amp;egrave;ne/Whaledent</td><td></td><td>orthodontic tray wax strips</td></tr><tr><td>Platinum grid</td><td></td><td></td><td>to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>to fire-polish pipette tips</td></tr><tr><td>Potassium methyl sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Molecular probes</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>Manometer</td><td>GREISINGER electronic</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt Gradient Contrast</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulators</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>Frame grabber</td><td>The Imaging Source</td><td>DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>Condenser</td><td>Zeiss</td><td></td><td>high numerical aperture condenser working with oil</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective</td></tr><tr><td>Fourfold-changer</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td></td><td>between the camera and the microscope</td></tr><tr><td>Black &amp;amp; white video monitor</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>16-inch, 850 TV lines, analog</td></tr><tr><td>Sample Bottles, Amber Glass, with Cap</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>to transfer slices from the setup to histology room</td></tr><tr><td>The Axon Guide</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Book</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>Analysis of electrophysiological data</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td></tr><tr><td>Well cell culture plate</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td><td>for the staining of fixed slices</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td></tr><tr><td>mouse anti-TH monoclonal primary</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>working concentration: 1/1,000</td></tr><tr><td>goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>working concentration: 1/500</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade</td><td>Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Avidin DCS</td><td>Vector Lab</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td><td>plugin for ImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>Reconstruction of biocytin filled neurons</td></tr><tr><td>Neuromantic</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td><td>Reconstruction of biocytin filled neurons</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>Analysis of electrophysiological data</td></tr></tbody></table>

subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons

dopaminerjik nöronların Dendritler almak ve sinaptik girdi, destek aksiyon potansiyeli geri yayılma ve nörotransmitter salınımını iletmek. Bu temel işlevleri anlaşılması bu nöronların bilgi aktarımı ışık tutacaktır. Dendritik patch-kelepçe kayıtları doğrudan dendritler ve altta yatan voltaj kapılı iyon kanallarının elektriksel özelliklerini incelemek imkanı sağlamaktadır. Ancak, bu ince yapılar nedeniyle küçük çaplı yama pipetler kolayca erişilebilir değildir. Bu rapor, akut dilim dopaminerjik nöronların dendrit gelen istikrarlı ve güvenilir kayıtları toplamak için bir adım-adım prosedürü anlatılmaktadır. Elektrofizyolojik ölçümler hücre morfolojisi post hoc geri kazanımı ile bir araya getirilmektedir. Başarılı deneyler dilimleri, çözümleri ve pipetler, kaydedilen yapısı ile temas halinde optik ve pipet istikrar yeterli uyum gelişmiş hazırlık güveniyor. som standart ilkeleriatic yama-kelepçe kayıt dendritler ama pipetle bir yumuşak bir yaklaşım ile uygulanır. Bu çok yönlü teknikler dendritler telaşlı özellikleri hakkında çeşitli soruları için uygulanabilir.

Yukarıda açıklanan protokol dendritik yama-kelepçe kayıtları kullanılarak verilerin toplanmasını kolaylaştırmak niyetinde. Post hoc Histokimyanın ile birlikte bu teknik, köken ya da dendrit içine yayılan birçok elektrik sinyallerine mekanizmaları içgörü kazanmak için yardımcı olur. yama pipetler ile dendritler doğrudan erişim zordur, ama birkaç metodolojik açıdan özel önem kayıtları başarı oranını artıracaktır. yeterince stabil somatik kayıt konusunda deneyimli bir deneyci girişimleri en yüksek direnç (GΩ) mühürler ve tam deneyler elde bekleyebilirsiniz. İki yüksek kaliteli dendritik kayıtlar için bir diseksiyon başına toplanabilir. Sağlıklı somata ve dendritler içeren yüksek kaliteli beyin dilimleri durumu bu ince yapılar (Şekil 1) erişmek için bir ön koşuldur. ölçülereBu nöronlar seçmek için bir bütün hücre ve optimum ayarlanmış optik ile gözlenen düşük kontrastlı bir soma ve dendritler üzerinde pürüzsüz ve homojen bir yüzey vardır (Şekil 1A ve 1B). Seçme nöronlar çok güçlü genel tezat stabil olmayan kayıtlar (Şekil 1C ve 1C) yol açar. Bu nedenle bu tür nöronlar kaçınılmalıdır. diğer nöronlara karşılaştırıldığında, nigral DA nöronlar belirli morfolojik ve elektrofizyolojik özellikler göstermektedir. Genellikle tek bir somatik pipet ile değerlendirilen bu özellikler aynı zamanda çift somatik (Şekil 2) ve somatodendritik kayıtları (Şekil 3) görülebilir. Uzun hiperpolarizan akım enjeksiyonları (Şekil 2B ve 5D) &#39;sarkma&#39; olarak adlandırılan bir membran potansiyeli düzeltme neden olur. tanımlandığı şekilde akson bir dendritik sitede, çoğu durumda, kaynaklanırBu nöronların dendritik bölmesi heterojen olduğunu gösteren, tamamlayıcı kriterleri 13,25,26 ile (Şekil 3A - 3B). 13,25,26 - bir sonucu olarak, AP ilk görülmektedir bölmesi akson (3D Şekil 3C) çıktığı kompartıman karşılık gelir. Akson genellikle 64 dilimleme sırasında akson bir kesme neden bir akson bleb ile sona erer, ancak bu yapı sistemli algılanmaz. Arka arkaya Ih aktivasyonuna nigral DA nöronlarının gözlenen belirgin sarkma HCN alt biriminden oluşan bir yüksek ifade etmektedir. Sinaptik sinyallerin entegrasyonu ben h etkisini belirlemek için, sinaptik benzeri akım (EPSC) dalga şekilleri oluşturulur ve somatodendritik çift kayıtları 55 (&lt;esnasında dendritik kayıt elektrot aracılığıyla enjekte edildistrong&gt; Şekil 4). Bu simüle EPSCs kinetiği gerçek spontan EPSCs yükselişi ve çürüme zaman sabitleri dayanmaktadır. Elde edilen aEPSP somatik elektrot ile kaydedildi. Ih bloke edici ZD 7288 Banyo uygulaması sinaptik sinyallerin (Şekil 4B) zaman seyrine Ih katkısını göstermektedir aEPSP süresini uzatmıştır. ZD 7288 teyit membran potansiyeli düzeltme kaldırması da Ih aktivasyonu (Şekil 4C) için sarkma oluşur. Simüle EPSPS ile elde edilen sonuçlar elektrik uyarılmış EPSPS 65 kullanıldığı deneylerde korele edilebilir. DA nöronların somatodendritik etki kanalın hassas dağılımı eşlemek için, hücreye bağlı kayıtları (Şekil 5) uygulanmıştır. Bir yüksek dirençli mühür (&gt;&gt; 1 GΩ) (Şekil 5B hücre bağlı kayıtlar için mutlak bir zorunluluktur </strong&gt;). DA nöronlarının dendritler, ben h uzun hiperpolarizan gerilim adımlarla yavaş yavaş harekete geçirir ve daha önce 66 gösterildiği gibi mevcut kararlı durum, ms (Şekil 5C) yüzlerce sonra elde edilir. Bu gözlem, DA nöronlarının dendritleri ifade HCN kanalları, piramidal nöronlar ya da diğer hücre tipleri 10,16,66 olanlara kıyasla, farklı alt birimlerine sahip olduğunu gösterir. Kanalın dağılımı dendritik bölmesinde homojen olmayan olabilir ve As dendritik bölmesi kendisi heterojen olduğu gibi, dendrit (akson taşıyan veya nonaxon taşıyan dendrit) kimlik konfokal görüntü ile IR-DGC görüntü karşılaştırarak ortaya biocytin boyama (Şekil 3A ve B) uygulanmasından sonra. hücre morfolojisi geri kazanılması da, çift somatodendritik kayıtlar için ve takip eden somatik bütün hücre kayıtları yoluyla hücre-bağlı kayıtlar için gereklidir. Kızılötesi videomikroskopi kullanarak nigral dopaminerjik nöronlar Soma ve Proksimal dendritler görselleştirme Şekil 1.. Soma ve proksimal dendrit hem somatik ve dendritik pipetler gösteren bir nigral DA nöronun (A) IR-DGC görüntü. Bir çift somatodendritik kayıt başarıyla bu sağlıklı nöron üzerinde gerçekleştirildi. Tüm hücrenin somatodendritik etki üzerinde düşük kontrast ve düzgün bir yüzey gözlemleyin. (B) sağlıklı DA nöron bir başka örneği. (C) DA nöron bir kaba ve pürüzlü yüzey ve daha güçlü bir kontrasta sahip. Çift bir kayıt elde edilmiş olsa da, her iki yüzünden pipetler de erişim direnci, tedrici artışına yol (~ 15 dakika) stabilite suboptimal ve kayıt süresi kısa olmuştur. (D) gösteren bir DA nöron İkinci örnek, yüksek kontrastlı soma ve proksimal dendrit. Bu durumda, erişim direnci güçlü bir artış bütün hücre modunda arası kısa bir süre sonra gözlenmiştir. negatif basınç erişim direncini azaltmak için bir girişimi başarısız oldu. Panel C ve D nöronlar dilimleme işlemi sırasında zarar görmüş olabilir ve deneyler için kaçınılmalıdır. (E) kaydın başında sağlıklı DA nöron Eşzamanlı çift somatik kayıt. (F) panel E aynı nöron ~ 17 dakika sonra bir şişmiş hücre gövdesi. Aksine tam olmadığına dikkat edin, soma top benzeri bir görünüm ve sağlıklı nöronlar açık değildir büyük çekirdeğinin varlığı. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> Şekil 2. </strong&gt; Eşzamanlı Çift somatik bir DA Neuron kayıt yapılması. DA nöron çift somatik kayıt sırasında (A) IR-DGC görüntü. (B) hiperpolarizan ve 1 s uzun akım enjeksiyonları depolarizan (-160 pA 80, pA 80 artırmak) ve ilgili gerilim değişimleri hem yama pipetler ile eş zamanlı olarak kaydedilir. Depolarize akım darbesi sırasında uzun hiperpolarizan akım adım ve AP sonra sonrası hiperpolarizasyon büyük gerilim izleme sarkma varlığını unutmayın. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> Şekil 3. DA Neuron Çift S omatodendritic Kaydı. (A) DA nöron IR-DGC görüntü. dendritik ve soma arasındaki mesafetlc pipet flöresin izotiyosiyanat (FITC) ile konjuge avidin ile işaretlenmiş Panel A&#39;daki nöron 29 um. (B) Konfokal z projeksiyon görüntüsü. nöron kayıt sırasında biocytin ile doluydu. Akson okla gösterildiği gibi soma yakın bir yakın dendrit kaynaklandı. Soma (siyah gerilim izleri) ve dendrit kaydedilen paneli A. AP nöron (C) Eşzamanlı çift somatodendritik tüm hücre voltaj kayıt (kırmızı gerilimi siyah akım iz) ve sağ alternatif olarak dendritik pipet (;, somatik (sol üzerinden 1 s uzun akım enjeksiyon aşamasında yanıt izleri) kırmızı akım iz) (D) Somatik ve dendritik AP genişletilmiş zaman ölçeğinde gösterilen.. somatik veya dendritik akım enjeksiyon ile ya somatik AP (siyah) dendritik AP (kırmızı) öncesinde. Bu nöron AP arasındaki gecikme 120 us ve sırasıyla somatik ve dendritik akım enjeksiyonu, 210 us oldu. gecikmelerAP yükselen aşamasında AP yarı-maksimum genlik ölçüldü. AP akson önceki gözlemleri 25,26 teyit ortaya çıktığı yakın bölmeye ilk gözlenmektedir. Bu durumda, dendritik kaydı bir akson-eksik dendrit yapılır. Bir akson taşıyan dendrit Ref olduğu bir kaydın bir örneği. 13 (onların Şekil. 1). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> DA Nöronlar somatodendritik Eksen boyunca Yapay EPSPS Şekil 4. Yayılım. (A) da nöron IR DGC görüntüsü. dendritik ve somatik pipet arasındaki mesafe 45 mm. Her iki yama pipetler tüm hücre akım kelepçe kayıt modunda bulunmaktadır. (B) Cariakım kelepçe dendritik pipet ile kaydedilir ve yapay EPSP (üst) oluşturmak için kullanılır. Geçerli bir EPSC gibi dalga enjeksiyonu ile elde edilir (; τ çürüme = 3 ms; τ yükselişi = 0.6 ms genlik = 100 Pa) dendritik kayıt pipet 55 üzerinden. (; Kırmızı iz 30 iM) alt kısmında, kontrol koşulları (siyah) olarak soma kaydedildi aEPSPs propagandası ve h bloker ZD7288 ve banyo uygulamasından sonra. Her gerilim iz 40 tek süpürür ortalamasıdır. 30 mcM ZD 7288 uygulanmasından sonra (kontrol koşullarında (siyah) soma kaydedilen izleri Gerilim. (C) EPSPS zaman tabii ben h katkısını gösteren ZD7288 varlığında EPSP süresi büyük bir artış gözlemlemek ve uzun (30 pA yanıt kırmızı); 1 ler) hiperpolarizan mevcut adım. I &lt;tıkanması sonra membran potansiyeli düzeltme (sarkma) olmadığına dikkatsub&gt; h. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> DA Neuron ve Dendritler ben h Şekil 5. varlığı. Proksimal dendrit bir DA nöron ve pipet (A) IR-DGC görüntü. (B) hücre bağlı konfigürasyonda bir 5 mV gerilim komutu esnasında Kapasitif ve kaçak akımları. Conta direnci bu örnekte 5 GΩ olarak (C), hiperpolarize bir gerilim., MV yavaş aktive Ih neden 0 membran potansiyelinden (90 mV üst). Geçerli iz ters ve τ = 632 ms&#39;lik bir zaman sabitini veren tek üstel fonksiyonu ile donatılmış. (D) Gerilim1 s hiper bütün hücre kaydedilen soma (panel A) yanıtları ve depolarize akım darbeleri (120 pA için -160, 40 pA artış). somatik tam hücreli kayıt hücre bağlı kayıttan sonra yapıldı. Nedeniyle hücre bağlı kayıt sırasında kendiliğinden ateş bastırmak için TTX ve Cd 2+ dışı uygulama AP olmadığına dikkat edin. Bu voltaj kapılı Na + ve Ca2 + mevcut blokerlerinin akımlarını bastırmak ilave edildi. Paneller A - D aynı nöron vardır başka DA nöron ve dendritik pipet (E) IR-DIC görüntü -120 mV bir 50 ms prepulse 0 mV bir test darbesi ile aktive (F) Gerilim-bağımlı akımlar.. Panel E. Holding nöron proksimal dendrit potansiyeli -80 mV eksize bir dış çıkış yama. Akımın zamana bağlı inaktivasyonunu unutmayın. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">Bir büyük görmek için tıklayınız</a>Bu rakamın sürümü. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Madde </td><td> g / mol </td><td> konsantrasyon </td><td> 1 L </td></tr><tr><td> NaCI </td><td> 58,443 </td><td> 125 mM </td><td> 7,305 g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2.100 gr </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 74,551 </td><td> 2.5 mM </td><td> 0.186 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137,99 </td><td> 1.25 mM </td><td> 0.172 g </td></tr><tr><td> glikoz </td><td> 198,17 </td><td> 25 mM </td><td> 4.95 g </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> (1 M çözelti) </td><td> 1 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> (1 M çözelti) </td><td> 2 mM </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarite: ~ 310 mOsmol / L (optimum aralık: 314-325 mOsmol / L) pH = 7.4 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: yapay serebrospinal akışkan (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Madde </td><td> g / mol </td><td> konsantrasyon </td><td> 1 L </td></tr><tr><td> NaCI </td><td> 58,443 </td><td> 87 mM </td><td> 5,084 g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2,1001 g </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 7,551 </td><td> 2.5 mM </td><td> 0,18637 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137,99 </td><td> 1.25 mM </td><td> 0,17248 g </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> (1 M çözelti) </td><td> 7 mM </td><td> 7 ml </td></tr><tr><td> glikoz </td><td> 198,17 </td><td> 10 mM </td><td> 1,9817 g &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> sakaroz </td><td> 342,29 </td><td> 75 mM </td><td> 25,672 g </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> (1 M çözelti) </td><td> 0.5 mM </td><td> 0.5 mL </td></tr><tr><td colspan="4"> Ozmolarite: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7.4 </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Sakaroz-ACSF dilimleri hazırlamak. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Madde </td><td> g / mol </td><td> konsantrasyon </td><td> 100 mL&#39;lik </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150.2 </td><td> 120 mM </td><td> 1,8024 g </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 74,56 </td><td> 20 mM </td><td> 0,14912 g </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> (1 M çözelti) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td> 551.1 </td><td> 2 mM </td><td> 0,1102 g </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td> 523,2 </td><td> 0.5 mM </td><td> 0,02661 g </td></tr><tr><td> Na 2 -Phosphocreatine </td><td> 255,1 </td><td> 5 mM </td><td> 0,1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380,4 </td><td> 0.1 mM </td><td> 3,803 mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 g </td></tr><tr><td> Biocytin </td><td> 1 mg / ml </td><td></td><td> 0.1 gr </td></tr><tr><td colspan="4"> Ozmolarite: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7.2, KOH ile ayarlanmış </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Çift kayıtlar için hücre içi bir çözüm. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Madde </td><td> g / mol </td><td> konsantrasyon </td><td> 100 içinmL </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 74,56 </td><td> 120 mM </td><td> 0,8947 g </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> (1 M çözelti) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> (1 M çözelti) </td><td> 1 mM </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 </td></tr><tr><td> TEA-CI </td><td> 165.7 </td><td> 20 mM </td><td> 0,3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94,11 </td><td> 5 mM </td><td> 0,04705 g </td></tr><tr><td> BaCl 2 </td><td> 244,26 </td><td> 1 mM </td><td> 0,02443 g </td></tr><tr><td> CDC 2 </td><td> 183,32 </td><td> 0.02 mM </td><td> 0,3666 mg </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 mM </td><td> 200 nM </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarite: ~ 290 mOsmol / L, D-glikoz (Ref 16). Ile ayarlanabilir; pH = 7.4 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Hücre bağlı kayıtları için elektrot çözüm.

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons at JoVE.com

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

subcellular-patch-clamp-recordings-from-somatodendritic-domain-nigral

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.9K Görüntüleme.  Quartier Hôpital, 














University
of Liege. Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro. 

Video: Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of recordings are conducted on dissociated DRG neurons, which is a standard preparation for most laboratories. Neuronal properties, however, can be altered by axonal injury resulting from enzyme digestion used in acquiring dissociated neurons. Further, dissociated neuron preparations cannot fully represent the microenvironment of the DRG since loss of contact with satellite glial cells that surround the primary sensory neurons is an unavoidable consequence of this method. To overcome the limitations in using conventional dissociated DRG neurons for patch clamp recordings, in this report we describe a method to prepare intact DRGs and conduct patch clamp recordings on individual primary sensory neurons ex vivo. This approach permits the fast and straightforward preparation of intact DRGs, mimicking in vivo conditions by keeping DRG neurons associated with their surrounding satellite glial cells and basement membrane. Furthermore, the method avoids axonal injury from manipulation and enzyme digestion such as when dissociating DRGs. This ex vivo preparation can additionally be used to study the interaction between primary sensory neurons and satellite glial cells.

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

Yetişkin Rats gelen bozulmamış Dorsal Kök Ganglia üzerinde Patch Kelepçe Kayıtlar

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Biyokimya

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

Dinamik Kelepçe Tekniği ile Sıçan orta beyin dopaminerjik nöronlar NMDA Reseptör İletkenlik Uygulama

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Nörobilim

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, difficult to separate and also not easily identified by their morphology. Thus, it is often difficult to analyze gene expression in a specific neuron type. Here we document a procedure that combines whole-cell patch clamp recording techniques with single-cell reverse transcription polymerase chain reaction (scRT-PCR) to profile mRNA expression in different types of neurons in the substantial nigra. Electrophysiological techniques are first used to record the neurophysiological and functional properties of individual neurons. Then, the cytoplasm of single electrophysiologically characterized nigral neurons is aspirated and subjected to scRT-PCR analysis to obtain mRNA expression profiles for neurotransmitter synthesis enzymes, receptors, and ion channels. The high selectivity and sensitivity make this method particularly useful when immunohistochemistry can not be used due to a lack of suitable antibody or low expression level of the protein. This method is also applicable to neurons in other brain areas.

Neurons are first characterized electrophysiologically. Then the cytoplasm from the recorded neuron is aspirated and subjected to reverse transcription-PCR analysis to detect the expression of mRNAs for neurotransmitter synthesis enzymes, ion channels, and receptors.

Voltaj-kapılı potasyum Kanal mRNA gösterilmeden Tek hücreli RT-PCR teknikleri kullanarak Nigral Nöronlar

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is terminated by diffusion2-3, extracellular enzymes4, and membrane transporters5. The dopamine transporter, located in the peri-synaptic cleft of dopamine neurons clears the released amines through an inward dopamine flux (uptake). The dopamine transporter can also work in reverse direction to release amines from inside to outside in a process called outward transport or efflux of dopamine5. More than 20 years ago Sulzer et al. reported the dopamine transporter can operate in two modes of activity: forward (uptake) and reverse (efflux)5. The neurotransmitter released via efflux through the transporter can move a large amount of dopamine to the extracellular space, and has been shown to play a major regulatory role in extracellular dopamine homeostasis6. Here we describe how simultaneous patch clamp and amperometry recording can be used to measure released dopamine via the efflux mechanism with millisecond time resolution when the membrane potential is controlled. For this, whole-cell current and oxidative (amperometric) signals are measured simultaneously using an Axopatch 200B amplifier (Molecular Devices, with a low-pass Bessel filter set at 1,000 Hz for whole-cell current recording). For amperometry recording a carbon fiber electrode is connected to a second amplifier (Axopatch 200B) and is placed adjacent to the plasma membrane and held at +700 mV. The whole-cell and oxidative (amperometric) currents can be recorded and the current-voltage relationship can be generated using a voltage step protocol. Unlike the usual amperometric calibration, which requires conversion to concentration, the current is reported directly without considering the effective volume7. Thus, the resulting data represent a lower limit to dopamine efflux because some transmitter is lost to the bulk solution.

The amperometric technique measures dopamine release from a single cell by detecting the oxidative current produced by spontaneous dopamine oxidization. Simultaneous voltage clamp and amperometry methodology reveal the mechanistic relationship between the overall "activity" of dopamine transporter and the regulatory role of this activity on the reverse transport of dopamine.

Eşzamanlı Gerilim-kelepçe ve Amperometri ile Dopamin Film Tek Hücre Ölçümü

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers easy identification and characterization of these cell types, prerequisites to study their specific functions. This article describes the multiplex single cell reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) protocol, which allows, after patch-clamp recording in slices, to detect simultaneously the expression of tens of genes in a single cell. This simple method can be implemented with morphological characterization and is widely applicable to determine the phenotypic traits of various cell types and their particular cellular environment, such as in the vicinity of blood vessels. The principle of this protocol is to record a cell with the patch-clamp technique, to harvest and reverse transcribe its cytoplasmic content, and to detect qualitatively the expression of a predefined set of genes by multiplex PCR. It requires a careful design of PCR primers and intracellular patch-clamp solution compatible with RT-PCR. To ensure a selective and reliable transcript detection, this technique also requires appropriate controls from cytoplasm harvesting to amplification steps. Although precautions discussed here must be strictly followed, virtually any electrophysiological laboratory can use the multiplex single cell RT-PCR technique.

This protocol describes the critical steps and precautions required to perform single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. This technique is a simple and effective method to analyze the expression profile of a predetermined set of genes from a single cell characterized by patch-clamp recordings.

Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Biyoloji

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter receptors that contribute to cell diversity across this population. This protocol outlines the steps necessary for successful dissecting, dissociating, and short-term culturing of the somata of inner ear bipolar neurons for the purpose of patch-clamp recordings. Detailed instructions for preparing vestibular ganglion neurons are provided with the necessary modifications needed for plating spiral ganglion neurons. The protocol includes instructions for performing whole-cell patch-clamp recordings in the perforated-patch configuration. Example results characterizing the voltage-clamp recordings of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN)-mediated currents highlight the stability of perforated-patch recording configuration in comparison to the more standard ruptured-patch configuration. The combination of these methods, isolated somata plus perforated-patch-clamp recordings, can be used to study cellular processes that require long, stable recordings and the preservation of intracellular milieu, such as signaling through G-protein coupled receptors.

Presented here are methods providing detailed instructions for dissecting, dissociating, culturing, and patch-clamp recording from vestibular ganglion and spiral ganglion neurons of the inner ear.

Patch-Clamp Kayıtları için Yenidoğan Kemirgenlerinden Vestibüler ve Spiral Ganglion Somata'nın İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

Source: Engel, D. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54601">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a technique for patch-clamp recording from the dendritic membrane surface. This helps to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels in dopaminergic neurons.

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Perforated Patch-Clamp Recordings of Inner Ear Sensory Neuron Cell Bodies

Source: Iyer, M. R., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/64908">Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2023).
This video demonstrates the patch-clamp technique for measuring ionic currents in inner ear sensory neuron cell bodies. It details the preparation and use of a polished patch-clamp pipette filled with an internal solution containing amphotericin B, which perforates the membrane to allow ion movement while preserving intracellular conditions. Voltage pulses are applied to trigger and record ion channel activity, providing insights into their properties and behavior.

İç Kulak Duyusal Nöron Hücre Gövdelerinin Delikli Yama-Klemp Kayıtları

1. Recording
NOTE: In this procedure, patch-clamp recordings from the isolated ganglion are typically performed 12-24 h after the plating. Other labs have ...

Imaging and Optical Techniques

Whole-Cell Patch Clamp Recording in a Substantia Gelatinosa Neuron of a Spinal Cord Slice

Source: Zhu, M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58479">Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for performing electrophysiological recordings in substantia gelatinosa (SG) neurons of spinal cord slices, using whole-cell patch-clamp techniques to analyze neuron firing patterns. This method allows the study of neural responses to stimuli in SG neurons of the spinal cord.