이 작품은 NIH 보조금 R01DA021194 및 R01NS058850 지원했다.

1. 뇌 슬라이스 준비 <ol><li> 영은 (15-40일 세) 남성과 스프 - Dawley 쥐의 여성이 사용됩니다. (우리는 또한 생쥐에서이 같은 프로토콜을 사용합니다.) 깊이 우레탄 마취, 동물은 참수되고 머리가 빨리 밖으로 해부하는 것입니다. substantia nigra의 midrostral 일부를 포함하는 다음 300 μm의 두께 코로나 뇌 조각은 Leica vibratome (VT - 1200S)에 절단됩니다. 220 자당, 2.5 KCl, 1.25 아니 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 D - 절차를 절단 슬라이스는 (MM)를 포함하는 솔루션을 절단 얼음처럼 차가운, 산소 높은 자당에서 수행됩니다 포도당. 그것은 95% 산소 유지하고 7.4의 산도를 유지하기 위해 O 5분의 2 %의 CO 2의 혼합물과 함께 부풀어 오른 모양이다. 절단 솔루션 얼음처럼 차가운 절차를 통해 유지. </li><li> 125 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 아니 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 2.5 CaCl 2, 1.3 MgCl 2, 10 : 뇌 조각이 들어있는 산소 인공 뇌척수 (aCSF) (MM)를 가득 배양 챔버에 incubated 아르 D - 글루코오스. 그것은 95% 산소 유지하고 7.4의 산도를 유지하기 위해 O 5분의 2 %의 CO 2의 혼합물과 함께 부풀어 오른 모양이다. 부화 온도는 뇌 슬라이스가 녹화 실로 전송됩니다 ° C 45 분 후 실온에서 34까지입니다. </li></ol> 2. nigral 뉴런의 Electrophysiological 지문 <ol><li> 한 뇌 슬라이스는 지속적으로 32에서 산소 aCSF와 perfused 패치 클램프 녹음 챔버 ° C.로 전송됩니다 </li><li> 패치 pipettes은 autoclaved borosilicate (KG - 33) PC - 10 풀러을 (Narishige, 도쿄, 일본)를 사용하여 유리 모세관 튜브 (1.10 mm의 ID, 1.65 mm OD, 킹 정밀 유리, Claremont, CA)에서 가져온 및 세포내 솔루션으로 가득 차 있습니다 DNase - RNase가없는 물 (피셔 과학) (135 MM KCl, 0.5 MM EGTA, 10 HEPES MM, 1.5 MM MgCl 2, 7.3로 조정 산도를 포함)를 준비했습니다. 패치 pipettes이 욕탕에 MΩ 2-3의 resistances 있습니다. </li><li> substantia nigra은 그 뚜렷한 해부 학적 위치 (그림 1A1 - 2)에 따라 식별됩니다. Nomarski 광학과 substantia nigra 갈 거예요 compacta (SNc)와 substantia nigra에서 60X 물 침지 렌즈, 대형 전지가 장착된 비디오 현미경 (올림푸스 BX51W1)의 영상지도하에 (SNR) (가능한 DA의 뉴런과 GABA 뉴런) reticulata 선택 갈 거예요 녹음. 기존 기가 - 옴 시일 전체 셀 구성은 (그림 1B1) 얻습니다. 현재 클램프 및 전압 클램프 분석을 수행할 수 있습니다. mRNA 저하를 최소화하기 위해, electrophysiological 녹화 (≤ 5 분) 간단한해야합니다. 한 옵션은 관심의 뉴런 (그림 B2 - 3)에 대한 electrophysiological 지문을 제공하기 위해서만 멤브레인 및 요동 치고 속성을 기록하는 것입니다. 이 간단한 녹음은 약 1 분 정도 소요됩니다. </li></ol> 3. 세포질의 흡인 <ol><li> SNR GABA와 DA의 뉴런의 electrophysiological 지문 및 특성 후, 부드러운 입 흡입은 세포질을 대기음에 적용됩니다. 세포 핵은 또한 게놈 DNA 오염의 결과, aspirated 수 있습니다. 시일이 고장해서는 안됩니다; mRNA를 포함하여 별도로 세포 잔해가 패치 피펫으로 빨려 및 셀 내용을 오염시킬 수 있습니다. 시일의 무결성은 -70 뮤직 비디오에서 개최 전류의 증가만큼 좋은 것은 100 PA를 초과하지 않습니다. </li><li> 다음 aspirated 셀 내용은 피펫 팁 및 작은 긍정적인 압력을 깨는하여 0.2 ML PCR 튜브에 퇴학입니다. 하나의 셀 내용 한 PCR 튜브에 수집됩니다. 셀 내용을 접수 후, 수집 PCR 튜브는 얼음에 사전 냉각 즉시 -20 ° C의 냉동고에 배치됩니다. </li><li> mRNAs를 포함할 수 있습니다 세포 파편의 오염을 배제하기 위해 패치 피펫 실제로 세포질을 aspirating 않고 조직에 져서 다음 피펫의 내용은 RT - PCR를 받게됩니다. </li></ol> 4. 역방향 전사 (RT) <ol><li> 일반적으로 뉴런 10-20의 합리적인 숫자의 셀 내용을 수집 후, RT는 mRNAs의 저하를 최소화하기 위해 즉시 시작합니다. </li><li> 하나의 신경 세포에서 세포 콘텐츠의 수량이 너무 작은이기 때문에 RNA 분리 절차가 수행되지 않습니다. 잠재적인 오염 게놈 DNA를 제거하려면 aspirated 셀 내용을 먼저 DNase I (5 μL DNase I 1.6 μL DNase I 버퍼, 25시 5 분 ° C)에 의해 소화 수 있습니다. 다음 DNase가 나는 1.2 μL 25 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하고 5 분 75 ° C를 잠복기에 의해 inactivated입니다. </li><li> cDNA는 윗첨자 III 리버스 transcriptase 기반 전지 - 직접 cDNA 합성 키트 (Invitrogen, 표 1)를 사용하여 합성 수 있습니다. cDNA 첫 번째 가닥은 50에서 합성됩니다 ° 50 분 C는 다음 반응 ° 5 분 1 μL RNase H에 대한 C 추가됩니다 85에서 부화하여 inactivated입니다에드는 mRNA (37 ° C 20 분)를 소화합니다. 단일 좌초 cDNA는 나중에 PCR 증폭을위한 -20 ° C에 저장됩니다. </li><li> 게놈 DNA의 완전한 제거는 모든 다른 반응 구성 요소가 똑같은 동안 역방향 transcriptase가 생략되는 RT - 마이너스 컨트롤에 의해 확인됩니다. </li></ol> 5. 두 단계 PCR 증폭 <ol><li> Primers는 GenBank의 순서에 따라 설계되었습니다. 가능하다면, 인트론 - 스패닝 프라이머 쌍은 도움이 게놈 DNA의 오염을 감지 것을 사용 하였다. 프라이머 쌍 시퀀스는 표 2에 나열되어 있습니다. 프라이머 쌍의 효과는 처음에는 긍정적인 제품을 항복 전체 뇌 mRNAs에 의해 검증되어야합니다. 모든 primers는 통합 DNA 기술 (Coralville, 아이오와, 미국)에 의해 합성됩니다. </li><li> 첫 번째 단계에서 30 μL cDNAs 5 μL는 프라이머 쌍 (표 2)의 존재에 35 사이클에 대한 증폭됩니다. 열 자전거 타는 사람의 열 사이클링 프로토콜 (MasterCycler, Eppendorf, 표 1), 94 ° 초기 변성에 대한 C, 94 15 s의 35주기 ° C 변성으로, 55에서 30의는 ° C는 어닐링에 2 분입니다 72 45의 ° C는 최종 확장 7 분 뒤에, 연장. DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) 및 PCR 증폭에 필요한 다른 모든 구성 요소 PCR 슈퍼 믹스 (Invitrogen, 표 1)에 의해 제공됩니다 </li><li> 두 번째 단계 PCR에서 1 일 무대 PCR 증폭에서 1 μL의 제품은 템플릿으로 사용되며, 첫 번째 단계에서 사용되는 동일한 프라이머 쌍은 (표 2)이 사용됩니다. 40주기가 30 단축 연장 시간에 실행됩니다 S. 동일한 PCR 슈퍼 믹스가 사용됩니다. </li><li> 2 차 단계의 증폭에서 PCR 제품은 2.5 % 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분리되며, 자외선 아래에서 ethidium 브로마이드 (0.05 mg/100 ML 젤) 또는 gelgreen에 의해 시각, 그리고 (B4 그림) 사진. 긍정적인 밴드 그러면 그만 있으며, Qiagen 추출 키트 (표 1) 및 합성을 사용하여 추출하고, 대상 유전자의 게시된 시퀀스와 비교. </li></ol> 6. 대표 결과 : substantia nigra compacta 갈 거예요 및 reticulata 갈 거예요 그리고 substantia nigra의 인근 GABA 프로젝션 뉴런에서 도파민 (DA) 뉴런은 reticulata을 별도로 electrophysiological 특성 (.; 땡 외 2011. 만주국 외 2006)가 갈 거예요. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 1B2는 SNR GABA의 신경은 10 Hz에서 주위에 고주파 자발적인 급상승을 나타냅니다. 스파이크 1 MS 주위 기본 기간이 있습니다. 현재 주사를 hyperpolarizing되면, SNR GABA의 뉴런이 신경에 전류 I H (그림 1B2)의 약한 표현을 나타내는, 현재 주사를 hyperpolarizing에 대한 응답으로 약한 depolarizing 천칭자리를 표시합니다. 반면, nigral 검찰의 뉴런 (2 Hz에서 약 3) MS 주위 기본 기간을 가지고 자발적인 스파이크를 낮은 주파수를 나타냅니다. DA의 뉴런은 또한 I H 전류 (그림 1B3) (..; 땡 외 2,011 만주국 외 2006)의 강한 표현을 나타내는, 현재 주사를 hyperpolarizing에 대한 응답으로 발음 천칭자리을 보여줍니다. scRT - PCR은 electrophysiologically 식별 SNR GABA 뉴런에서 glutamic 산성 탈카복실화효소 1 (GAD1, GABA의 신경에 대한 GABA 합성 및 마커에 대한 핵심 효소)에 대한 mRNA를 감지하지만 DA 뉴런 (그림 1B4, 5) 인치 반면, scRT - PCR은 electrophysiologically 식별 SNc 및 SNR DA의 뉴런에서 (검찰의 뉴런에 대한 도파민 합성 및 마커에 대한 TH, 주요 효소) 티로신 hydroxylase에 대한 mRNA를 감지하지만, GABA 뉴런 (그림 1B4, 5) 인치 따라서 scRT - PCR 결과는 electrophysiological 신경 세포 식별을 확인합니다. 다음 scRT - PCR은 전압 - 활성 Kv3 채널 subunits, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 및 Kv3.4의 표현을 프로필에 사용되었습니다. 이러한 subunits 전압 - 문이 K를 형성에 기여할 + subunit 구성 (땡 외. 2011)에 따라 다양한 속성의 채널. 예제에서는 SNR GABA 신경 세포는 그림에 표시됩니다. Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 및 Kv3.4에 대한 1B4, mRNAs가 발견되었습니다. 예제에서는 SNR DA 뉴런은 Fig.1B5에 표시된 Kv3.2, Kv3.3 및 Kv3.4가 발견되었습니다. 우리 풀링 데이터, Kv3.1 더 자주 빨리 급상승 SNR GABA 뉴런 (땡 외. 2011)에서 Kv3.1의 높은 표현 수준을 나타내는 nigral DA의 뉴런에 비해 SNR GABA의 신경에서 발견되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3136/3136fig1.jpg" /> 그림 1. SNR GABA 신경 및 nigral 검찰 뉴런의 Electrophysiological 식별 :.. nigral 영역이 자신의 독특한 해부 학적 위치에 의해 확인할 수 있습니다 A1은 1X 목적으로 촬영한 코로나 Nissl 묻은 부분에 SNc와 SNR의 위치를 보여줍니다. 박스 영역 captur되었습니다10X 객관적이고 중간에 표시와 에드는 화살표로 표시. 셀 - 풍부한 SNc 및 셀 - 가난한 SNR은 분명히 볼 수 있습니다. A2는 4X 목적으로 캡처 라이브, 흠없는 코로나 섹션에서 SNc와 SNR의 위치를 보여줍니다. 셀 - 풍부한 SNc 및 셀 - 가난한 SNR은 또한 분명하게 식별됩니다. VTA, 복부 tegmental 지역. B1은 전체 세포 모드로 고정되어 SNR GABA 신경 세포되는 패치를 보여줍니다. B2 현재 클램프 녹음 모드에서 SNR GABA의 신경의 전형적인 electrophysiological 속성을 보여줍니다. 이러한 뉴런 화재 자연 고주파 액션 짧은 기간의 잠재력과 현재 주사를 hyperpolarizing에 약한 나 H - 중재 천칭자리 응답을했습니다. B3 현재 클램프 녹음 모드에서 nigral DA의 뉴런의 전형적인 electrophysiological 속성을 보여줍니다. 그들은 오랜 기간의 자연 저주파 행동 잠재력을 해고하고 눈에 잘 띄는 I H - 중재 천칭자리 (화살표 머리) 현재 주사를 hyperpolarizing에 대응되어 있습니다. 따라서 SNR GABA의 뉴런과 뉴런 nigral 도파민의 명확. electrophysiologically 확인 B4은 electrophysiological 확인 SNR GABA 신경 세포에서 scRT - PCR 제품의 젤 사진을 보여줍 있습니다. 글루 탐 산염 탈카복실화효소 1 (GAD1)​​ mRNA 있지만 티로신 hydroxylase (TH) mRNA가 검출되었다. Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 및 Kv3.4에 대한 mRNAs이 SNR GABA 신경 세포에서 발견되었습니다. B5는 SNR DA 신경 세포에의 연결을 Kv3 채널 mRNAs의 scRT - PCR 검출을 보여줍니다. 회 mRNA 있지만 GAD1의 mRNA는 electrophysiologically 확인 SNR DA 신경 세포에서 발견되었다. Kv3.2, Kv3.3 및 Kv3.4에 대한 mRNAs이 SNR DA 뉴런. B6 풀링된 데이터를 보여줍니다에서 발견되었습니다. 7. 잠재적인 거짓 부정과 거짓 긍정적인 결과 경험을 바탕으로 여러 가지 요인이 허위 부정 scRT - PCR 결과를 초래할 수 있습니다. 이러한 요인 피펫 팁 막히는, RNase의 오염, 그리고 비효율적인 PCR primers의 패치로 인해 세포질의 충분한 양의 aspirating에 실패를 포함합니다. 패치 피펫 팁 괴롭히는은 일반적으로 비디오 모니터에 볼 수 증가와 접속 저항로 표시하실 수 있습니다. RNase 오염은 철저한 해제 및 착용 장갑에 의해 피할 수 있습니다. PCR 프라이머의 효과가 뇌 조직을 펀치에서 총 RNA를 사용하여 테스트해야합니다 (. 만주국 외 2008;. 딩 외 2011). 우리가 항상 먼저 RT 전에 우리 샘플을 치료하기 위해 DNase를 사용하여 이후, 우리는 거짓 긍정적인 결과가 발생하지 않았습니다. 이론적으로, DNase를 소화하지 않고, 게놈 DNA의 오염 때문에 유전자가 intronless 또는 뇌관 쌍을 때 false로 긍정적인 감지가 발생할 수 있습니다는 인트론 지역에 걸쳐되지 않습니다.

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	<li>J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription.">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li><li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons.">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li><li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons.">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li><li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons.">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li><li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons.">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li><li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata.">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

scRT - PCR과 뇌 슬라이스의 패치 클램프 녹음의 조합은 우리가 여기 이온 채널, 수용체, 그리고 개별적 특징 뉴런의 신경 전달 물질 합성을위한 핵심 효소에 대한 mRNA 발현 프로파일을 조사하는 훌륭한 방법을 제공 보여주었다. (; 만주국 외 2009.. Surmeier 외 1996) 문제의 단백질이 발견과 같은 낮은 표현 수준 및 / 또는 적절한 항체의 부족으로 인해 immunohistochemistry 같은 다른 방법을 사용하여 현지 수없...

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="표 1" /> 표 1. 주요 시약 및 장비 <img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="표 2" /> 표 2. 쥐의의 연결 Kv3 채널, 티로신 hydroxylase (TH)와 glutamic 산 탈카복실화효소 1 (GAD1) ​​scRT - PCR을위한 mRNAs을 위해 뇌관 쌍

profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques

포유류의 중추 신경계에서 다양한 분자 및 기능적 특성과 뉴런의 종류는 서로 분리하는 어렵고도 쉽게 자신의 형태에 의해 식별되지 함께 혼합된 있습니다. 그러므로, 그것은 특정 신경 세포 유형의 유전자 발현을 분석하는 것이 어렵습니다. 여기서 우리는 상당한 nigra의 신경 세포의 다른 유형의 프로파일 mRNA 표현에 단일 셀 리버스 전사 중합 효소의 연쇄 반응 (scRT - PCR)과 전체 세포 패치 클램프 녹음 기술을 결합하여 절차를 문서. Electrophysiological 기법 먼저 각 뉴런의 neurophysiological과 기능적 속성을 기록하는 데 사용됩니다. 그런 다음, 단일 electrophysiologically 특징 nigral 뉴런의 세포질은 aspirated과 신경 전달 물질 합성 효소, 수용체 및 이온 채널에 대한 mRNA 발현 프로파일을 얻기 위해 scRT - PCR 분석의 대상이됩니다. 높은 선택성 및 감도는 immunohistochemistry 인해 적절한 항체 또는 단백질의 낮은 표현 수준의 부족으로 사용할 수 없습니다 때이 방법은 특히 유용합니다. 이 방법은 다른 뇌 영역에서 뉴런에 적용됩니다.

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Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

뉴런 먼저 electrophysiologically 특징입니다. 그런 다음 기록된 신경 세포의 세포질은 aspirated과 신경 전달 물질 합성 효소, 이온 채널, 수용체에 대한 mRNAs의 표현을 감지하기 위해 전사 - PCR 분석을 반대를 받게됩니다.

단일 셀 RT - PCR 기법을 사용 Nigral 뉴런의 전압 - 문이 칼륨 채널 mRNA의 표현을 프로파일

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

profiling-voltage-gated-potassium-channel-mrna-expression-nigral

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K 조회수.  University of Tennessee College of Medicine. 뉴런 먼저 electrophysiologically 특징입니다. 그런 다음 기록된 신경 세포의 세포질은 aspirated과 신경 전달 물질 합성 효소, 이온 채널, 수용체에 대한 mRNAs의 표현을 감지하기 위해 전사 - PCR 분석을 반대를 받게됩니다.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

척수 전기 생리학 II : 세포 흡입 전극 제작

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

만들기, 테스트 및 성인 뇌의 조직 조각에 칼륨 이온 선택적 Microelectrodes를 사용 하 여

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing platforms process all input cells indiscriminately. Sometimes, fluorescence-activated cell sorting (FACS) is used upstream to isolate a specifically labeled population of interest. A limitation of FACS is the need for high numbers of input cells with significantly labeled fractions, which is impractical for collecting and profiling rare or sparsely labeled neuron populations from the mouse brain. Here, we describe a method for manually collecting sparse fluorescently labeled single neurons from freshly dissociated mouse brain tissue. This process allows for capturing single-labeled neurons with high purity and subsequent integration with an in vitro transcription-based amplification protocol that preserves endogenous transcript ratios. We describe a double linear amplification method that uses unique molecule identifiers (UMIs) to generate individual mRNA counts. Two rounds of amplification results in a high degree of gene detection per single cell.

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

This protocol describes the manual sorting procedure to isolate single fluorescently labeled neurons followed by in vitro transcription-based mRNA amplification for high-depth single-cell RNA sequencing.

단일 셀 RNA 시퀀싱 시퀀싱 (디바-Seq) 절대 수 수동 정렬 및 두 배 전사 생체 외에서 를 사용 하 여 붙일 레이블이 마우스 뉴런의

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...