Name: cultivate primary nasal epithelial cells from children and reprogram into induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2016-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
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저자는 다 능성 줄기 세포 시설 신시내티 아동 병원에서 공 촛점 이미징 코어를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) 및 2U19AI70235 (GKKH)에 의해 지원되었다.

다음 프로토콜은 기관 인간의 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다. 1. 코 점막을 샘플링 참고 : 호흡기 바이러스 감염의 흔적이없는 피사체에서 샘플을 얻습니다. <ol><li> 참가자 방문하기 전에 15 ML 원뿔 신선한를 준비하고 2 ml의 BEGM (기관지 상피 세포 성장 배지) 플러스 20 ㎕를 멸균 펜 / 패 혈성 / Fungizone (P / S / F) (0.01 %)를 추가합니다. </li><li> 열기 세포학 단지 샘플을 복용하기 전에 브러시 및 살균 브러시를 유지해야하고, 코 표면 이외의 모든 표면을 만지지 마십시오. </li><li> 가만히 앉아 천장을 향해 머리를 기울 참가자를 요청합니다. 작은이 이상 불안 아이들은 그들의 손에 앉아 및 / 또는 멀리 브러시를 때리는 등 모욕적 피하기 위해 누워. </li><li> 통로가 좁아 (작은 블랙홀처럼 보이는) 코의 뒤쪽에 브러시를 목표로하고 있습니다. 아래로 브러시를 밀어 브러시가 nostri에서 제거 될 때 손목을 비틀엘. </li><li> 원뿔에서 브러시를 놓고 BEGM에 잠수함. 여분의 브러쉬를 잘라 튜브에 뚜껑을 교체합니다. VORTEX하지 않습니다. 주 : 참가자 용의 경우와 동일한 방식으로했지만 제 콧 구멍에 제 브러쉬 얻었다. 양쪽 콧 구멍의 칫솔질을 얻는 것은 샘플링이 성공하는 높은 가능성이 발생합니다. 같은 콧 구멍을 샘플링 출혈이 발생할 수 가능성 샘플을 향상되지 않습니다. </li><li> 따뜻한 물로 비이커를 사용하여 운송 중 가능한 37 ° C에 가까운 샘플을 보관하십시오. </li></ol> 2. 세포 수와 Cytospin <ol><li> 부드럽게 BEGM에 브러시를 교반하고 hemacytometer를 사용하여 세포 수의 샘플 10 μL를 취할. 라이브 / 죽은 얼룩의 10 μl를 추가 만 현미경으로 세포를 살고 계산합니다. </li><li> 샘플의 50 μl를 타고 1X PBS 200 μL에 희석. 2 분 동안 300 rpm에서 유리 슬라이드와 스핀에 부착 cytospin 깔때기에 추가합니다. 따라와 건조 O / N 및 얼룩 슬라이드를 밀어 보자g 제조업체의 지침. 바람직하게는 어둠 속에서, O / N을 건조하도록 허용합니다. </li><li> 헤마 3 얼룩 얼룩 슬라이드 <ol><li> 각 솔루션 (; 헤마 3 솔루션 I, 핑크, 헤마 정착액, 밝은 파란색과 헤마 3 솔루션 II, 푸른 깊이)로 이동시켜 염색 접시에; 사용하지 않을 때는 커버하십시오. 슬라이드 염색 보트에 슬라이드를 삽입 </li><li> 딥 슬라이드는 지속적으로 30 초 동안 정착에 다음 과잉 배출 할 수 있습니다. 딥 내가 30 초 동안, 다음 과잉 배출 할 수 있도록 솔루션에 지속적으로 슬라이드. 딥은 과잉 배출 할 수 있도록 30 초 동안 지속적으로 솔루션 II에 슬라이드 </li><li> 물이 맑은 실행까지 탈 이온수로 씻어. 어둠 속에서 바람직하게는, O / N을 건조하도록 허용 </li></ol></li><li> 상피 세포의 비율을 결정, 현미경 카운트 세포에서 슬라이드 봐. 샘플링이 좋은 경우 90 % 이상이어야합니다. </li></ol> 3. 시드 셀 주 : 적절한 인증 조직 문화의 모든 세포 배양 과정을 수행후드 무균 기술을 사용. <ol><li> 소 피부 콜라겐 (BDC)와 코트 판, 유형 1. 49.5 ㎖의 1X PBS에 희석 3 ㎎ / ㎖ BDC의 0.5 ML을 추가합니다. 몇 판을 사용할 경우 더 적은을 준비합니다. 코트 2 시간 동안 37 ° C에서 T25의 2 ml의 BDC와 플라스크 및 멸균 후드 O에 품어 / N 또는 필요한 경우. </li><li> 배양 후, 남아있는 액체를 대기음. 멸균 후드에서 30 분 동안 자외선에 플라스크를 노출. 하지만 1 개월까지 4 °에서 C에 대한 저장소 플라스크, 세포를 파종하기 전에 C를 RT로 가져 또는 37 °. </li><li> 시드 할 준비가 될 때까지 37 ° C에서 BEGM에 브러시와 세포를 유지합니다. 조심스럽게 휙 원뿔 내부 브러시,하지만 소용돌이하지 않습니다. <ol><li> 플레이트 T25 플라스크에 7 × 10 5 세포. 이하이 있으면 작은 컨테이너 6 웰 플레이트 중 하나와 같은 잘 사용한다. 이 크기의 플레이트는 약 3 × 10 5 세포를 필요로한다. 참고 :이 많은 세포가없는 경우, 계속하지 않는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 멸균 후드 아래, 튜브 및 GE에서 브러시을ntly 코팅이 긁히지 않도록주의하면서, 코팅 된 플라스크의 표면에 브러시를 회전 할 수 있습니다. 적절한 생물 학적 용기에 브러시를 폐기하십시오. </li><li> 천천히 원뿔에서 그리고 T25 플라스크에 BEGM에 남아있는 세포를 피펫. 현미경으로 세포를 관찰한다. 부유 세포의 숫자가 관찰되며이 단계 (도 3a)에서 허용되는 코 일부 파편이있을 수있다. </li></ol> 4. 세포 배양 <ol><li> 세포를 파종 한 후,이를 중단없이 48 시간 (그림 3)에 안주 할 수 있습니다. 48 시간 후, 천천히 그리고 부드럽게 2 ml의 따뜻한 BEGM 및 무균 페니실린 / 스트렙토 마이신 / Fungizone (P / S / F) 20 μl를 추가합니다. 참고 : 미디어의 원래 2 ml에 대기음하지 마십시오. </li><li> 파종 후 4 번째 날, 신중하게 모든 액체를 대기음, 신선한 4 ㎖로 교체 BEGM 플러스 1X 펜 / 연쇄상 구균이 (fungizone가 더 이상 필요하지 않습니다) 가온. 이틀 미디어를 변경하고 연결에 대한 세포를 평가, 표준, 성장과 합류. 세포에 도달하면 ~ 80 %의 합류, 일반적으로 2-3 주 내에, 그들은 계대 할 준비가 된 것입니다. </li><li> 하나 T25 플라스크 (약 2.5 × 10 6 세포 때 합류) 세 T25 플라스크 또는 1 T75 플라스크에 계대 수 있습니다. 제 1 통로 후, 세포는 약 3 일 합류에게 도달 튼튼하고 건강해야한다. </li></ol> 5.과 Passaging 세포 <ol><li> 부드럽게 접시에서 미디어를 대기음. 약 4 분 동안 인큐베이터에있는 접시와 장소 T25 플라스크 당 1 ml의 0.05 % 트립신 솔루션을 추가하거나 세포를 플레이트에서 분리 될 때까지. 세포마다 2 분의 분리의 수준을 확인하고 이상 10 분에 트립신을 두지 마십시오. </li><li> 효소를 중화 5 ㎖의 트립신 중화 솔루션 (TNS), 또는 혈청 함유 미디어를 추가합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 플라스크 장소에서 모든 액체 및 세포를 제거합니다. </li><li> 5 분 동안 200 XG (감속 가속도 0 0)에서 원심 분리 세포 펠렛을 얻었다. 기음 superna새로운 플라스크에 필요한 볼륨 S BEGM에서 + P / 중대장과에 resuspend 세포 (T75 플라스크에 대한 T25 플라스크 4 ml의 10 ㎖) </li><li> (2.1) 전술 한 바와 같이 라이브 / 죽은 얼룩 세포 수를 수행합니다. 코팅 된 플라스크에 BEGM 세포의 적절한 금액을 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 상기 상세한 유지 또는 용액 당 0.5 × 106 세포의 농도로 배지 (70 % BEGM, 20 % FBS와 10 % DMSO)를 동결 cryopreserve. </li></ol> iPSCs 6. 재 프로그래밍 참고 : iPSCs를 생성하기 전에 생성과 인간 iPSCs의 사용을 규제하는 모든 기관 규정 준수를 보장합니다. 배양 배지는 통상적으로 항생제를 함유하지 않는 멸균 기술은 IPSC 배양에 특히 중요하다. NECs 건강 표시하고 견고 성공적인 프로그래밍에 대한 증식있는 것이 중요합니다. <ol><li> 판 6 잘 조직 배양 플레이트의 웰 당 5 × 10 5 NECs. 24 시간 후, 폴리 브렌 추가BEGM에 매체 인 Oct4, Sox2이, Klf4, C-Myc와 발현 렌티 바이러스 입자를 첨가하여 8 μg의 / ㎖ 및 형질 도입 NECs 최종 농도. 5 ~ 27의 감염 (MOI)의 다양성을 달성하는 것을 목표로하고 있습니다. <ol><li> MOI를 결정하는 것과, 농축 - 렌티 바이러스 스톡의 희석액을 제조하고 이들로 희석 HT1080 세포를 형질 도입. HT1080 세포에서 발현 dTomato 제 명백하게 검출 후 dTomato 양성 세포 / 희석 각 셀의 작은 덩어​​리의 수를 기록하여 &quot;형질 도입 단위 용액 /&quot;의 수를 계산한다. 참고 : 일반적으로 너무 높은 희석 (모든 dTomato 긍정적이다) 너무 낮은 (없음 또는 양성 세포의 커플)이있을 것이다. </li><li> 세포의 분리 양성 세포 / 작은 덩어​​리가 확인되는 희석에서 득점을 수행합니다. 적절한 희석 인자 단위 / ㎖ 열 변환 수를 보정함으로써 역가를 결정한다. MOI는 수의 비율의 바이러스 입자 (27)의 수를 셀 형질. 참고 : 각 dTomato 양성 세포 / 작은 덩어​​리가 하나의 바이러스 입자에서 발생하는 가정한다. </li></ol></li><li> 약 3 시간 후 전달 매체를 제거하고 신선한 BEGM로 교체합니다. 제도적 승인 절차를 사용하여 렌티 바이러스 함유 미디어를 폐기하십시오. 3 일간 인큐베이터에 형질 NECs를 돌려줍니다. </li><li> 3 일에, 신선한 BEGM와 미디어를 교체 한 다음 다른 3 일간 배양한다. 기음 미디어는 1X PBS로 세포를 씻어 잘 1 ml를 0.05 % 트립신 솔루션을 추가 보냈다. 트립신과 통로 세포 (섹션 5) 위의 기록으로. 조심스럽게 4 ml의 BEGM + P / S에 뜨는 및에 resuspend 세포를 대기음. 세포를 준비하는 경우 (다음 단계 참조) BDC 코팅 6 웰 플레이트의 웰에 새로운 계대 또는 MEF 배양에 첨가 될 수있다. </li><li> MEF 코팅 된 플레이트를 준비합니다. 4 일에 () +/- Thiazovivin (SPT를 수행 단계 6.6를 참조)도 6의 2 웰 (1 ㎖ / 잘) 0.1 % 젤라틴 용액을 추가합니다. 다음에하루는 불 활성화 MEFs에 28 병을 해동. </li><li> MEF 미디어 (DMEM + 1 배 NEAA + 10 % DFCS) 10 ㎖로 MEFs에 배치합니다. 5 분 200 XG에 스핀 펠렛합니다. MEF 미디어를 Resuspend. 대기음 6 웰 플레이트에서 젤라틴과 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트의 웰 당 1.87 × 10 5 MEFs에 추가합니다. 37 ° C에서 O / N을 품어, 또는 24 시간의 최소. </li><li> BEGM의 양도 2 ㎖를 이전에 코팅 된 6 웰 플레이트의 두 우물에 잘 당 세포를 형질 도입 및 / N을 O를 품어 함유. 다음날 4 NG / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자를 함유하는 표준 hESC의 미디어 웰 당 2.5 ㎖로 교체 BEGM. 신선한 hESC의 매체와 세포를 공급 +/- SPT를 매일 10 일 동안 참고 : NECs (23)에 대한 효율성과 프로그래밍의 반응 속도를 향상시키기 위해 작은 분자 (SB431542, PD0325901 및 Thiazovivin (SPT) 칵테일)의 칵테일을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 십일 후, SPT없이 hESC의 미디어를 사용하여 매일 먹이를 계속합니다. hESC의 같은 식민지 때까지 매일 문화를 피드(그림 5A, P0 식민지)를 나타납니다. 세포질 비와 눈에 띄는 핵소체 : 높은 핵으로 추정 iPSCs을 품고 식민지를 확인합니다. </li><li> hESC의 같은 형태를 가진 수동 소비세 및 전송 식민지 공급 장치가없는 시스템에서 별도의 선으로 문화와 확​​장을 위해 우물을 분리합니다. 절제 식민지는 이러한 조건에 빠르게 적응해야한다. <ol><li> 도금 절제 식민지 후이 이산 추정 IPSC 라인은 지금 통로 1 (P1)으로 간주됩니다. 매일 mTeSR1와 피드 문화. 통로 및 표준 절차를 사용하여 IPSC 라인을 확장합니다. P1의 식민지들은 계대되어야하는 크기에 도달하는 것은 일주일에 며칠이 걸릴 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 7. 문화 iPSCs 유지 <ol><li> 피드 및 일일 문화를 평가합니다. 수동 소비세 지역은 멸균 유리 피펫 또는 마이크로 피펫 팁으로 긁어에 의해 명백한 차별화를 전시. 매일 수확 후 미디어를 변경합니다. </li><li> 통로 세포 approxima 후tely 4 일마다 : 부드럽게 흡인 미디어, 6 웰 플레이트 (하프 공급 볼륨)의 웰 당 1 ml의 따뜻한 스파 아제 (Dispase) (1 ㎎ / ㎖)을 추가 한 후 약 4 분 동안 37 ° C에서 품어. 식민지의 가장자리는 식민지 주위에 흰색 테두리처럼 보이는, 리프트 시작합니다. 조심스럽게 스파 아제 (Dispase)를 대기음 및 예열 DMEM / F12와 함께 배를 씻는다. </li><li> 2 ml의 mTeSR1를 추가하고 판에서 식민지를 들어 올릴 셀 리프터를 사용합니다. 식민지가 작은 클러스터로 분할 될 때까지 부드럽게 세포를 씹다에 5 ㎖의 혈청 학적 피펫 또는 P1000의 마이크로 피펫을 사용합니다. <ol><li> 생존 후속 증식 차선 바와 같이, 매우 작은 클러스터 또는 단일 셀의 제조 피. 콜로니를 다시 도금하면, 1 : 4 내지 1 : 6 분할 최적 콜로니 밀도를 유지한다. 부드럽게 판에서 식민지와 미디어를 제거하고 새로운, 마트 리겔 코팅 된 웰에 추가 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

코 점막 상피 세포 (NECs)는기도 질환 연구를위한 액세스 플랫폼, 그리고 NEC-iPSCs 질병 개발, 치료 및 치료 1,31,32을 탐구하는 흥미로운 수단을 제공합니다. NECs 쉽게 스트레스 또는 잠재적으로 유해한 절차 6,23없이 얻을 수있다. 우리의 경험에 의하면,이 프로토콜에 설명 된대로 코 점막의 샘플링은 스트레스를 덜하고 더 나은 어린이를위한 채혈보다 인식이 나타납니다. 따라서,이 방...

인간의 샘플 (hiPSCs)에서 유도 만능 줄기 세포는 줄기 세포 연구의 빠른 개발 기술입니다. 그들은 훨씬 적은 윤리적, 도덕적 결점의 1, 2와 배아 줄기 세포 (hESC의) 연구에 대한 대안을 제공합니다. 그들은 hESCs는 3-5 성적으로 동일하지 않지만, hiPSCs 개발 및 질환 표현형을 모델링하는 독특한 방법을 제공하고이 질환 상태와 관련 5-8 조직 유래 될 수있다. 생성 hiPSCs 새로운 방법을 끊임없이 이식에 적합한 GMP 품질 iPSCs을 제조하고, 또한 리 프로그래밍 프로세스 6,9-11의 적시성 및 효율성을 증가시키는 방법으로, 시작하는 최적의 세포 유형을 식별하기 위해 탐색되고있다. 기도 상피 세포 알레르기 성 염증 (12)의 개발에 중요하며, 상피 immun와 상호 작용을 통해 알레르기 반응과기도 개형의 중요한 드라이버 인전자와 기질 세포. 기도 상피 기원과 천식과 같은 폐 질환의 지속성에 필수적인 역할을한다. 그러나, 낮은기도 상피 세포, 특히 건강 관리 환자와 어린이, 임상에서 얻을하기가 어렵습니다. 대기 오염 물질과 알레르기 항원에 대한 반응을 연구, 특히 여러 연구의 데이터는, 코 점막의 상피 세포가 낮은기도 상피 세포 13-20에 대한 유효하고 실질적인 프록시 있다는 전제를 지원합니다. 코 점막은 90 % 이상 섬모기도 상피 세포로 구성하고 다른 세포 / 조직 샘플링 기술보다 덜 침습적이고 같이이 코 점막 상피 세포 (NECs)를 샘플링하는 것은 쉽게, 연령 네다섯 한 어린 아이에서 수행 될 수있다 감염 20-23과 같은 부작용의 위험을 최소화과 관련. 그것은 긴 불필요한, ​​종종 고통스러운 기관지의 procedu없이 건강하고 병에 걸린 어린이 모두를 샘플링 할 수있는 신속하고 간단한 방법을 제공합니다진정 작용을 필요로 입술. 이전의 연구는 천식 심각도 습관병 아형 비점막뿐만 아니라 천식 어린이로부터 취한 기관지 세포 샘플 모두에서 구별 될 수 있음을 발견하고, 두 조직 유형 간의 유전자 발현은 비 편재 유전자 (22)의 약 90 %에서 유사 24. iPSCs의 소스로, NECs 다른 자주 사용되는 세포 유형을 통해 이점을 제공합니다. 섬유 아세포는 종종 IPSC 생성을 위해 사용되지만, 이들 세포를 쉽게 피부 생검에서 배양 될 수 있지만,이 프로세스는 일반적으로 국소 마취, 절개 봉합을 필요로하고, 감염 될 위험과 관련된다. 따라서, 생검이 유형의 환자의 동의를 얻는 것은 25 어려울 수 있습니다. 섬유 아세포에 대한 한 대안은 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)이다. 그러나, 소아에서 IPSC 생성을위한 충분한 혈액을 얻는 것이 어려울 수있다. 또한, 다운 스트림 액세스 포인트의 제한이있다섬유 아세포 및 혈액 세포 유래 iPSCs, 특정 세포 유형 5,26 특히 분화 능력에 대한 plications. 따라서, 상대의 접근성 및 컬렉션 다음 부작용의 낮은 위험을 주어 NECs 소아 인구에서 IPSC 생성을위한 이상적인 셀 소스를 나타낸다. iPSCs 소설 질병 모델을 인간 개발 연구 생성 플랫폼으로 최근에 많은 주목을 받아 맞춤 치료를위한 세포의 잠재적 인 소스로했다. 이 기술의 잠재력이 실현 될 수 있기 전에, 프로그래밍 과정의 분자 토대가 설명 될 필요가 있지만, 지금이 프로토콜 내에서 설명 된 절차를기도 노출에 집중 조사 연구 해명 것임은 물론위한 플랫폼을 제공하는 iPSCs 관련된 개인화 된 의약품의 효과를 연구. 여러 연구소의 공동 작업은 generatio하게되었다코 점막을 샘플링뿐만 아니라, NECs를 배양하고, iPSCs (23)이 세포를 재 프로그램뿐만 아니라에 대한 성공적인 기술의 N. 이 문서에서는 최적의 샘플링, 배양 및 프로그래밍 환경을위한 프로토콜의 개요를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>15 ml conical</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>Protocol Step 1.1.</td></tr><tr><td>BEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Protocol Step 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep/Fungicide</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Protocol Step 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Protocol Step 4.a.</td></tr><tr><td>cytosoft cytology brush</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-263-357</td><td>Protocol Step 1.2.</td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-900-CI</td><td>Protocol Step 2.1.</td></tr><tr><td>hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Protocol Step 2.1.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2438-4</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>Cytology Funnel Clips</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>cytospin funnel</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-640-320</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>Cytospin 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A78300003</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>blank slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95933</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>hema 3 stain kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>Bovine Dermal Colagen, type 1</td><td>Life Technologies</td><td>A1064401</td><td>Protocol Step 3.2.</td></tr><tr><td>T25 flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-45</td><td>Protocol Step 3.3.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td>Protocol Step 5.2.</td></tr><tr><td>Trypsin Neutralizing Solution</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td>Protocol Step 5.2.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 &amp;deg;C for 30 min</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Protocol Step 5.5.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide Hybri-Max&amp;trade;, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, &amp;ge;99.7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Protocol Step 5.5.</td></tr><tr><td>polycistonic lentivirus*</td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Millipore</td><td>SCR511</td><td>Protocol Step 6.4.&amp;nbsp;&lt;br/&gt; A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-134220</td><td>Protocol Step 6.4.</td></tr><tr><td>Irradiated CF1 MEFs</td><td>GlobalStem&amp;nbsp;</td><td>GSC-6301G</td><td>Protocol Step 6.4.</td></tr><tr><td>hESC media</td><td>See recipe included in protocol</td><td></td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>Thiazovivin&amp;nbsp;</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>hESC-qualified Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Protocol Step 6.13.</td></tr><tr><td>Corning plate, 6 well</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Protocol Step 6.13.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell</td><td>5850</td><td>Protocol Step 6.13.</td></tr><tr><td>250 ml disposable filter flask (0.22 &amp;micro;m)</td><td>Fisher</td><td>SCGP-U02-RE&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dispase</td><td>StemCell</td><td>7923</td><td>Protocol Step 7.3.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Protocol Step 7.3.</td></tr><tr><td>cell lifter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td>Protocol Step 7.4.</td></tr><tr><td>hESC Media**</td><td></td><td></td><td>Protocol Step 6.11.&lt;br/&gt; components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 &amp;deg;C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 &amp;deg;C longer than 15 min</td></tr><tr><td>DMEM-F12 50/50 media</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;11330-032</td><td>Final Concentration</td></tr><tr><td>KO replacement serum (KO-SR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>0.2</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>55 mM &amp;szlig;-mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>100x non-essential amino acids</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1x</td></tr><tr><td>2 &amp;micro;g/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

cultivate primary nasal epithelial cells from children and reprogram into induced pluripotent stem cells

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

코 전정 불리는 코 초기 부분, 연골 조직 (29)으로 둘러싸인 영역이다. 브러쉬 코 밸브 (소공의 internum 또는 비공 뒷면에서 본 &quot;블랙홀&quot;) 이상, 코이 영역을지나 원활하게 진행해야하고, 시료 비갑개 (도 1)로부터 얻어진다. 비강 비갑개은 코 (29)의 표면적을 증가 샘플링 그들에게 최적 위치를 결정 뼈 구조이다. 이 지역은 또한 밀접하게 하...

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Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

어린이에서 차 비강 상피 세포를 배양 및 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

cultivate-primary-nasal-epithelial-cells-from-children-reprogram-into

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.1K 조회수.  Cincinnati Children's Hospital. This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

비디오: Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

연구

발생학

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient's symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Expansion of human pediatric esophageal epithelial cells utilizing conditional reprogramming provides investigators with a patient-specific population of cells that can be utilized for engineering esophageal constructs for autologous implantation to treat defects or injury and serve as a reservoir for therapeutic screening assays.

조직 공학 및 질병 조사에있는 사용을위한 소아 인간의 식도 상피 세포의 조건부 재 프로그래밍

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

신경과학

Generation of Airway Epithelial Cell Air-Liquid Interface Cultures from Human Pluripotent Stem Cells

Diseases of the conducting airway such as asthma, cystic fibrosis (CF), primary ciliary dyskinesia (PCD), and viral respiratory infections are major causes of morbidity and mortality worldwide. In vitro platforms using human bronchial epithelial cells (HBECs) have been instrumental to our understanding of the airway epithelium in health and disease. Access to HBECs from individuals with rare genetic diseases or rare mutations is a bottleneck in lung research.
Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are readily generated by "reprogramming" somatic cells and retain the unique genetic background of the individual donor. Recent advances allow for the directed differentiation of iPSCs to lung epithelial progenitor cells, alveolar type 2 cells, as well as the cells of the conducting airway epithelium via basal cells, the major airway stem cells.
Here we outline a protocol for the maintenance and expansion of iPSC-derived airway basal cells (hereafter iBCs) as well as their trilineage differentiation in air-liquid interface (ALI) cultures. iBCs are maintained and expanded as epithelial spheres suspended in droplets of extracellular matrix cultured in a primary basal cell medium supplemented with inhibitors of TGF-&#223; and BMP signaling pathways. iBCs within these epithelial spheres express key basal markers TP63 and NGFR, can be purified by fluorescence activated cell sorting (FACS), and when plated on porous membranes in standard ALI culture conditions, differentiate into a functional airway epithelium. ALI cultures derived from healthy donors are composed of basal, secretory and multiciliated cells and demonstrate epithelial barrier integrity, motile cilia, and mucus secretion. Cultures derived from individuals with CF or PCD recapitulate the dysfunctional CFTR-mediated chloride transport or immotile cilia, the respective disease-causing epithelial defects.
Here, we present a protocol for the generation of human cells that can be applied for modeling and understanding airway diseases.

Recent advances in human induced pluripotent stem cell differentiation protocols allow for the stepwise derivation of organ-specific cell types. Here, we provide detailed steps for the maintenance and expansion of iPSC-derived airway basal cells and their differentiation into a mucociliary epithelium in air-liquid interface cultures.

인간 다능성 줄기 세포로부터의 기도 상피 세포 공기-액체 계면 배양물의 생성

Diseases of the conducting airway such as asthma, cystic fibrosis (CF), primary ciliary dyskinesia (PCD), and viral respiratory infections are major ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

생물학

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

생체공학

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...