Name: cultivate primary nasal epithelial cells from children and reprogram into induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2016-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

著者らは、多能性幹細胞機能とシンシナティ小児病院での共焦点イメージングコアを承認したいと思います。この作品は、R21AI119236（HJ）、R21AI101375（HJ）、NIH / NCATS 8UL1TR000077-04（HJ）、U19 AI070412（HJ）と2U19AI70235（GKKH）によってサポートされていました。

以下のプロトコルは、金融機関、人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。 1.鼻粘膜をサンプリング注：呼吸器ウイルス感染の兆候がない被験者からのサンプルを入手します。 <ol><li>参加者の訪問の前に、15ミリリットルの円錐形の新鮮なを準備し、2ミリリットルBEGM（気管支上皮細胞増殖培地）を加えた20μlの滅菌ペン/連鎖球菌/ファンギゾン（P / S / F）（0.01％）を追加します。 </li><li>オープン細胞診だけで試料を採取する前に、ブラシ、および滅菌ブラシを保つようにしてくださいと鼻の表面以外の任意の表面に触れないでください。 </li><li>じっと座っていると天井に向かって頭を傾けるために参加者を確認して下さい。小さい以上の落ち着きのない子供たちは手の上および/または離れてブラシを叩き避けるために横たわって座っています。 </li><li> （小さなブラックホールのように見える）の通路が狭く鼻の奥にブラシを目指します。ダウンブラシをスライドさせ、ブラシがnostriから除去される手首をねじりますリットル。 </li><li>円錐形にブラシを配置し、BEGMに水没。余分なブラシをカットし、チューブのキャップを交換してください。 VORTEXしないでください。 注：参加者が喜んであれば、同じようにが、第2の鼻孔に第2のブラシを得ます。両方の鼻孔のブラッシングを得ることは、サンプリングが成功する可能性が高くになります。同じ鼻孔をサンプリングする出血になることがあり、おそらくサンプルを改善されません。 </li><li>暖かい水を入れたビーカーを使用して輸送中、可能な限り37°Cに近いサンプルを保管してください。 </li></ol> 2.セル数とサイトスピン<ol><li>ゆっくりBEGMにブラシを攪拌し、血球計を用いて、細胞数のために10μlのサンプルを取ります。生/死染色の10μlを添加して、顕微鏡下でのみ生きた細胞を数えます。 </li><li> 50μlのサンプルを取り、1×PBSで200μlに希釈します。 2分間300rpmでスライドガラスとスピンに取り付けられたサイトスピン漏斗に追加します。 followinドライO / Nと染色スライドをスライドさせてみましょうグラムの製造元の指示。好ましくは暗闇の中で、O / Nを乾燥することができます。 </li><li>ヘマ3ステインで染色スライド<ol><li>染色皿に（とヘマ3溶液II、深い青色;私はピンク、ヘマ3ソリューションヘマ固定液、ライトブルー）の各溶液を移します。使用しないときに覆われて保管してください。スライド染色ボートにスライドを挿入</li><li>ディップスライドは連続して30秒間固定液で、次いで過剰を排出することができます。ディップは、私が30秒間、次いで過剰を排出することを可能にするソリューションで連続的にスライドします。ディップは、30秒間溶液IIで連続的にスライドし、次いで過剰を排出することを可能にします</li><li>水が透明に実行されるまで脱イオン水ですすいでください。暗闇の中で好ましくは、O / Nを乾燥することができます</li></ol></li><li>顕微鏡下でスライドを見て、細胞をカウントし、上皮細胞の割合を決定します。サンプリングが良好であれば90％以上でなければなりません。 </li></ol> 3.播種細胞注：適切と認定された組織培養内のすべての細胞培養手順を実行しフードは、無菌技術を使用して。 <ol><li>ウシ真皮コラーゲン（BDC）でコーティングプレートは、タイプ1は49.5ミリリットル1×PBSで希釈した3 mg / mlとBDCの0.5ミリリットルを追加します。ほんの数プレートを使用する場合は以下を準備します。コー​​ト2ミリリットルBDCとT25フラスコ、必要に応じて、2時間、無菌フードのO / Nまたは37℃でインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、残りの液体を吸引します。無菌フードで30分間UV光にフラスコを公開します。ストア4℃で最大1ヶ月間のフラスコが、細胞を播種する前に、RTまたは37℃にそれらをもたらします。 </li><li>シード準備ができるまで、37℃でBEGMにブラシと細胞を保管してください。静かにスウィッシュ円錐形の内部にブラシが、渦ありません。 <ol><li>プレートT25フラスコ中の7×10 5個の細胞。以下である場合、例えば、6ウェルプレートの1ウェルとして小さな容器を使用します。このサイズのプレートは、約3×10 5個の細胞を必要とします。 注：この多くの細胞が存在していない場合は、継続することはお勧めできません。 </li></ol></li><li>無菌フードの下では、チューブの外にブラシを取るとGEntlyコーティングに傷を付けないように注意して、コーティングされたフラスコの表面にブラシを回転させます。適切なバイオハザード容器にブラシを破棄します。 </li><li>ゆっくりと円錐の外とT25フラスコにBEGMで残りの細胞をピペット。顕微鏡下で細胞を観察します。浮遊細胞の数が観察され、この段階（ 図3A）で許容される鼻からのいくつかの破片があってもよいです。 </li></ol> 4.細胞培養<ol><li>細胞を播種した後、それらを中断せずに48時間（ 図3）のために解決しましょう。 48時間後、ゆっくりと優しく暖かいBEGM 2ミリリットルを追加し、20μlの滅菌ペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾン（P / S / F）。 注：メディアの元の2ミリリットルを吸引しないでください。 </li><li>播種後4 日目に、慎重にすべての液体を吸引し、新鮮な4ミリリットルと交換し、BEGMプラス1×ペニシリン/ストレプトマイシンが（ファンギゾンはもはや必要ではない）温めました。 2日毎に培地を変更し、添付のための細胞を評価しますメント、成長、および合流。細胞は〜80％コンフルエンスに達した場合、通常2-3週間で、彼らは継代する準備ができています。 </li><li> One T25フラスコ3 T25フラスコまたは1 T75フラスコに継代することができる（コンフルエントは、約2.5×10 6細胞）。最初の継代後、細胞を3日ごとに約コンフルエンスに達し、堅牢かつ健康でなければなりません。 </li></ol> 5.継代細胞<ol><li>静かにプレートから培地を吸引除去します。約4分のためのインキュベーターでプレートと場所にT25フラスコあたり1ミリリットル0.05％トリプシン溶液を追加し、または細胞がプレートから剥がれるまで。セルごとに2分の剥離のレベルをチェックし、より長い10分にトリプシンを放置しないでください。 </li><li>酵素を中和するために5ミリリットルのトリプシン中和溶液（TNS）、または血清含有培地を追加します。 15ミリリットルコニカルチューブにフラスコと場所からすべての液体とセルを削除します。 </li><li> 5分間200×gで（加速0減速0）における遠心分離、細胞ペレットを得ました。吸引しsuperna新しいフラスコに必要な量でS BEGMで+ P /タント再懸濁細胞（T75フラスコ用T25フラスコのための4ミリリットル、10ミリリットル） </li><li> （2.1）上記のように生/死染色で細胞数を実行します。コー​​トフラスコにBEGM、細胞の適切な量を追加し、インキュベーターに戻します。上記に詳述したように維持するか、または1mlあたり0.5〜2×10 6細胞の濃度で（70％BEGM、20％FBSおよび10％DMSO）凍結培地中で凍結保存。 </li></ol>性IPSC 6.リプログラミング注：iPS細胞を生成する前に、人間性IPSCの生成と使用を管理するすべての機関の規制の遵守を確保します。培養培地は、日常的な抗生物質が含まれていないとして、滅菌技術は、IPSC培養のために特に重要です。 NECSは健康に見えるとロバスト成功した再プログラミングのために増殖していることが重要です。 <ol><li>プレート6ウェル組織培養プレートのウェル当たり5×10 5 NECS。 24時間後、ポリブレンを追加BEGMへのメディアへのOct4、Sox2の、Klf4の、のc-mycを発現するレンチウイルス粒子を添加することにより、8 / mlのと伝達NECSの最終濃度まで。 〜5 27の感染多重度（MOI）を達成することを目指しています。 <ol><li> MOIを決定するために、集中レンチウイルスストックの連続希釈液を準備し、これらの希釈液でHT1080細胞を形質導入。 HT1080細胞におけるdTomato式の明確に最初の検出後、dTomato陽性細胞/各希釈における細胞の小塊の数を採点することによって「形質導入単位/ ml」の数を計算します。 注：一般的に、高すぎる希釈（すべてがdTomato正）と低すぎる（noneまたは陽性細胞の夫婦のみ）があります。 </li><li>細胞の離散陽性細胞/小塊が識別された希釈液からスコアリングを行います。適切な希釈率で単位/ mlの形質導入の数を補正することにより力価を決定します。 MOIは、その後数の割合でありますウイルス粒子27の数に形質導入した細胞の。 注：各dTomato陽性細胞/小塊は、単一のウイルス粒子から発生すると想定されます。 </li></ol></li><li>約3時間形質導入後、メディアを取り出し、新鮮なBEGMと交換します。制度-承認された手順を使用して、レンチウイルス含有培地を捨てます。 3日間インキュベーターに形質導入​​さNECSを返します。 </li><li> 3日目に、新鮮なBEGMでメディアを交換してから、別の3日間インキュベートします。吸引除去は、メディアが、1×PBSで細胞を洗浄し、ウェルに1ミリリットル0.05％トリプシン溶液を添加過ごしました。上に書いたようにトリプシンで継代細胞（セクション5）。慎重に4ミリリットルBEGM + P / Sで上清と再懸濁細胞を吸引します。準備ができた場合細胞は、（次の手順を参照）、BDCでコーティングした6ウェルプレートの新しいウェルに継代し、またはMEF培養物に添加することができます。 </li><li> MEFコーティングしたプレートを準備します。 4日目に、6ウェルの2ウェルに0.1％ゼラチン溶液を（1ミリリットル/ウェル）（実行するには+/- Thiazovivin（SPT）は、ステップ6.6を参照）を追加します。次の上当日は、不活性化されたMEF 28のバイアルを解凍します。 </li><li> MEF培地（DMEM + 1×NEAA + 10％のDFC）の10ミリリットルにしたMEFを置きます。ペレットに5分間200×gでスピン。 MEF培地で再懸濁。 6ウェルプレートから吸引したゼラチン及びゼラチンでコーティングした6ウェルプレートのウェル当たり1.87×10 5のMEFを追加します。 O / N、37℃で、または24時間の最小インキュベート。 </li><li> BEGMが以前にコーティングした6ウェルプレートの2ウェルにウェル当たり形質導入した細胞を含有し、O / Nインキュベートの譲渡2ミリリットル。翌日、4 ngの/ mlの塩基性線維芽細胞成長因子を含む標準hESC媒体のウェル当たり2.5ミリリットルでBEGMを交換してください。 10日間毎日新鮮なhESC媒体+/- SPTで細胞をフィード 注：それはNECS 23再プ ​​ログラミングの効率と速度を向上させるために、小分子（SB431542、PD0325901、およびThiazovivin（SPT）のカクテル）のカクテルを追加することが可能です。 </li><li> 10日後、SPTなしのhESCのメディアを使用して、毎日餌を続けます。ヒトES細胞様コロニーまで毎日文化をフィード表示される（ 図5A、P0コロニー）。細胞質比および顕著な核小体：その高い核によって推定されるiPS細胞を保有するコロニーを特定します。 </li><li>ヒトES細胞様の形態を使用して手動で物品税と移転コロニーは、フィーダーフリーシステムで別々のラインとしての文化や拡張のために井戸を分離します。切除されたコロニーは、これらの条件に迅速に適応する必要があります。 <ol><li>切除されたコロニーをメッキした後、これらの離散推定されるIPSCラインは現在、継代1（P1）と考えられています。 mTeSR1で毎日文化を養います。パッセージとは、標準的な手順を用いてIPSCラインを展開します。 p1のコロニーは、彼らが継代されるべきサイズに到達することは、週に数日かかる場合があります。 </li></ol></li></ol> 7.文化でiPS細胞を維持<ol><li>フィードと毎日文化を評価します。手動で消費税の領域は滅菌ガラスピペットまたはマイクロピペットチップでこすることによって明白な分化を示します。毎日のピッキング後にメディアを変更します。 </li><li> approxima後の継代細胞tely 4日毎：優しく吸引メディアは、6ウェルプレート（半分送り量）のウェルあたり1ミリリットル暖かいディスパーゼ（1mg / ml）を追加し、その後、約4分間37℃でインキュベートします。コロニーの縁は、コロニーの周りに白い輪郭のように見えている、持ち上げるために開始されます。静かにディスパーゼを吸引し、温めたDMEM / F12で3回洗います。 </li><li> 2ミリリットルmTeSR1を追加し、プレートからコロニーを持ち上げるために、セルリフターを使用します。コロニーが小さいクラスタに分割されるまで、細胞を穏やかに粉砕するために5ミリリットルの血清学的ピペットまたはP1000マイクロピペットを使用してください。 <ol><li>生存とその後の増殖が次善であるように、非常に小さなクラスターまたは単一細胞を産生することは避けてください。コロニーを再メッキすると、1：4〜1：6分割が最適なコロニー密度を維持します。静かにプレートからコロニーとメディアを削除し、新しい、マトリゲル被覆ウェルに追加します。 </li></ol></li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

鼻上皮細胞（NECS）気道疾患を研究するためのアクセス可能なプラットフォームであり、NEC-iPS細胞は、疾患の発症、治療および治療​​1,31,32を探索するエキサイティングな道を提供しています。 NECSは簡単にストレスの多いまたは潜在的に有害な手順6,23なく得ることができます。我々の経験では、このプロトコルで説明したように鼻粘膜のサンプリングは、子供のための採血...

ヒトサンプル（hiPSCs）から誘導された多能性幹細胞は、幹細胞研究の急速な発展技術です。彼らは、胚性幹細胞（hESCの）はるかに少ない倫理的、道徳的な欠点1,2との研究に代わるものを提供しています。彼らはヒトES細胞3-5のエピジェネティックに同一ではないですが、hiPSCsは、開発および疾患の表現型をモデル化するためのユニークな方法を提供し、彼らは、疾患状態5-8に関連する組織に由来することができます。生成hiPSCsの新しい方法は、常に移植に適したGMP品質のiPS細胞を作製する方法として、で開始し、また、再プログラミングプロセス6,9-11の適時性と効率性を高めるために最適な細胞型を同定するために探索されています。 気道上皮細胞は、アレルギー性炎症12の開発において重要である、と上皮はIMMUNとの相互作用を介してアレルギー反応と気道リモデリングの主要なドライバですeとの間質細胞。気道上皮は、喘息などの肺疾患の起源および持続性において重要な役割を果たしています。しかし、下気道上皮細胞は、特に健康な対照患者や子どもたちから、臨床の場で得ることは困難です。いくつかの研究からのデータは、大気汚染物質やアレルゲンに対する応答を研究する場合は特に、鼻粘膜から上皮細胞が下気道上皮細胞のための有効かつ実用的なプロキシであることを前提13-20をサポートしています。鼻粘膜は、90％以上の繊毛気道上皮細胞で構成され、それが他の細胞/組織サンプリング技術よりも低侵襲性であるとされ、これらの鼻上皮細胞（NECS）をサンプリングすることは容易に、年齢4または5のように幼い子供にして行うことができますこのような感染20-23のような有害事象のリスクが最小限に関連付けられています。それは、長い間、不必要な、そしてしばしば痛みを伴う気管支鏡。手順なしで健康と病気の両方の子をサンプリングするために迅速かつ簡単な方法を提供しています鎮静を必要と解像度。以前の研究は、喘息の重症度に関連する疾患のサブタイプは鼻粘膜、ならびに喘息の子供から採取した気管支細胞試料の両方で識別することができることを見出しており、2つの組織タイプ間の遺伝子発現は、非ユビキタス遺伝子22の約​​90％で類似していました、24。 iPS細胞の供給源としては、NECSは、他の頻繁に利用される細胞型に比べて利点を提供します。線維芽細胞は、多くの場合、IPSCを生成するために使用されているが、これらの細胞は容易に皮膚生検から培養することができるが、このプロセスは、典型的には、局所麻酔、切開、および縫合糸を必要とし、感染症のいくつかのリスクと関連しています。したがって、生検のこのタイプの患者からインフォームドコンセントを得ることが25困難な場合があります。線維芽細胞の一つの代替は、末梢血単核細胞（PBMC）です。しかし、小児患者からIPSCを生成するために十分な血液を得ることが困難となります。また、下流APの制限があります線維芽細胞および血液細胞由来のiPS細胞、特定の細胞タイプ5,26、特にそれらの分化能のために襞。したがって、相対的なアクセシビリティとその収集以下の副作用のリスクが低い与えられ、NECSは、小児集団からのIPSCを生成するための理想的な細胞源を表します。 性IPSCは、新規疾患モデルを生成し、人間開発を研究するためのプラットフォームとして、最近多くの注目を受け、パーソナライズされた治療用細胞の潜在的な供給源としています。この技術の全潜在能力を実現することができる前に、リプログラミング過程の分子基盤を解明する必要がありますが、今の内に概説され、このプロトコルおよび手順は、気道曝露に焦点​​を当てた調査研究を解明し、同様のためのプラットフォームを提供しますiPS細胞が関与する個別化医療の効果を研究します。 いくつかの研究室の共同作業はGENERATIOにつながっています鼻粘膜を採取するだけでなく、NECSを培養し、iPS細胞23に、これらの細胞を再プログラミングするだけでなく、ために成功した技術のn個。この記事では、最適なサンプリング、培養、および再プログラミング条件のためのプロトコルの概要を提供します。

<table><tbody><tr><td>15 ml conical</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>Protocol Step 1.1.</td></tr><tr><td>BEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Protocol Step 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep/Fungicide</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Protocol Step 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Protocol Step 4.a.</td></tr><tr><td>cytosoft cytology brush</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-263-357</td><td>Protocol Step 1.2.</td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-900-CI</td><td>Protocol Step 2.1.</td></tr><tr><td>hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Protocol Step 2.1.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2438-4</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>Cytology Funnel Clips</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>cytospin funnel</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-640-320</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>Cytospin 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A78300003</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>blank slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95933</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>hema 3 stain kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>Bovine Dermal Colagen, type 1</td><td>Life Technologies</td><td>A1064401</td><td>Protocol Step 3.2.</td></tr><tr><td>T25 flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-45</td><td>Protocol Step 3.3.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td>Protocol Step 5.2.</td></tr><tr><td>Trypsin Neutralizing Solution</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td>Protocol Step 5.2.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 &amp;deg;C for 30 min</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Protocol Step 5.5.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide Hybri-Max&amp;trade;, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, &amp;ge;99.7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Protocol Step 5.5.</td></tr><tr><td>polycistonic lentivirus*</td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Millipore</td><td>SCR511</td><td>Protocol Step 6.4.&amp;nbsp;&lt;br/&gt; A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-134220</td><td>Protocol Step 6.4.</td></tr><tr><td>Irradiated CF1 MEFs</td><td>GlobalStem&amp;nbsp;</td><td>GSC-6301G</td><td>Protocol Step 6.4.</td></tr><tr><td>hESC media</td><td>See recipe included in protocol</td><td></td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>Thiazovivin&amp;nbsp;</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>hESC-qualified Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Protocol Step 6.13.</td></tr><tr><td>Corning plate, 6 well</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Protocol Step 6.13.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell</td><td>5850</td><td>Protocol Step 6.13.</td></tr><tr><td>250 ml disposable filter flask (0.22 &amp;micro;m)</td><td>Fisher</td><td>SCGP-U02-RE&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dispase</td><td>StemCell</td><td>7923</td><td>Protocol Step 7.3.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Protocol Step 7.3.</td></tr><tr><td>cell lifter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td>Protocol Step 7.4.</td></tr><tr><td>hESC Media**</td><td></td><td></td><td>Protocol Step 6.11.&lt;br/&gt; components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 &amp;deg;C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 &amp;deg;C longer than 15 min</td></tr><tr><td>DMEM-F12 50/50 media</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;11330-032</td><td>Final Concentration</td></tr><tr><td>KO replacement serum (KO-SR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>0.2</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>55 mM &amp;szlig;-mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>100x non-essential amino acids</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1x</td></tr><tr><td>2 &amp;micro;g/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

cultivate primary nasal epithelial cells from children and reprogram into induced pluripotent stem cells

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

鼻前庭と呼ばれる鼻の最初の部分は、軟骨29で囲まれた領域です。ブラシは鼻弁（口のinternum、または鼻孔の奥に見える「ブラックホール」）を超えて、鼻のこの領域を超えてスムーズに行く必要があり、サンプルは下鼻 ​​甲介（ 図1）から得られます。鼻甲介は、それらのサンプリングのための理想的な場所作り、鼻29の表面積を増加?...

Watch this Scientific Journal Video about Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

子供からプライマリ鼻上皮細胞を培養し、人工多能性幹細胞に再プログラム

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

cultivate-primary-nasal-epithelial-cells-from-children-reprogram-into

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.1K ビュー.  Cincinnati Children's Hospital. This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

ビデオ: Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

発生生物学

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient's symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Expansion of human pediatric esophageal epithelial cells utilizing conditional reprogramming provides investigators with a patient-specific population of cells that can be utilized for engineering esophageal constructs for autologous implantation to treat defects or injury and serve as a reservoir for therapeutic screening assays.

ティッシュ・エンジニアリングと疾病調査に使用するための小児のヒト食道上皮細胞の条件付き再プログラミング

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

主な羊水および膜 Xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

RNA に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

神経科学

Generation of Airway Epithelial Cell Air-Liquid Interface Cultures from Human Pluripotent Stem Cells

Diseases of the conducting airway such as asthma, cystic fibrosis (CF), primary ciliary dyskinesia (PCD), and viral respiratory infections are major causes of morbidity and mortality worldwide. In vitro platforms using human bronchial epithelial cells (HBECs) have been instrumental to our understanding of the airway epithelium in health and disease. Access to HBECs from individuals with rare genetic diseases or rare mutations is a bottleneck in lung research.
Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are readily generated by "reprogramming" somatic cells and retain the unique genetic background of the individual donor. Recent advances allow for the directed differentiation of iPSCs to lung epithelial progenitor cells, alveolar type 2 cells, as well as the cells of the conducting airway epithelium via basal cells, the major airway stem cells.
Here we outline a protocol for the maintenance and expansion of iPSC-derived airway basal cells (hereafter iBCs) as well as their trilineage differentiation in air-liquid interface (ALI) cultures. iBCs are maintained and expanded as epithelial spheres suspended in droplets of extracellular matrix cultured in a primary basal cell medium supplemented with inhibitors of TGF-&#223; and BMP signaling pathways. iBCs within these epithelial spheres express key basal markers TP63 and NGFR, can be purified by fluorescence activated cell sorting (FACS), and when plated on porous membranes in standard ALI culture conditions, differentiate into a functional airway epithelium. ALI cultures derived from healthy donors are composed of basal, secretory and multiciliated cells and demonstrate epithelial barrier integrity, motile cilia, and mucus secretion. Cultures derived from individuals with CF or PCD recapitulate the dysfunctional CFTR-mediated chloride transport or immotile cilia, the respective disease-causing epithelial defects.
Here, we present a protocol for the generation of human cells that can be applied for modeling and understanding airway diseases.

Recent advances in human induced pluripotent stem cell differentiation protocols allow for the stepwise derivation of organ-specific cell types. Here, we provide detailed steps for the maintenance and expansion of iPSC-derived airway basal cells and their differentiation into a mucociliary epithelium in air-liquid interface cultures.

ヒト多能性幹細胞からの気道上皮細胞気液界面培養物の生成

Diseases of the conducting airway such as asthma, cystic fibrosis (CF), primary ciliary dyskinesia (PCD), and viral respiratory infections are major ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

生物学

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

生物工学

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

エア·液界面での人間の鼻上皮細胞の培養

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...