המחברים מבקשים להודות במתקן לתאי גזע פלוריפוטנטיים ואת Core הדמיה Confocal בבית החולים סינסינטי ילדים. עבודה זו נתמכה על ידי R21AI119236 (HJ), R21AI101375 (HJ), NIH / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ), U19 AI070412 (HJ) ו 2U19AI70235 (GKKH).

הפרוטוקול הבא אחרי הקווים המנחים של ועדת האתיקה לניסויים בבני אדם מוסדות. 1. דגימת האף הרירי הערה: קבל דגימות נבדקים אשר הינם ללא סימני זיהום ויראלי בדרכי הנשימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טרי חרוטי 15 מ&quot;ל לפני הביקור משתתף ולהוסיף 2 מ&quot;ל BEGM (מדיום הגידול תא אפיתל הסימפונות) בתוספת 20 μl סטרילי פן / סטרפטוקוקוס / Fungizone (P / S / F) (0.01%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מברשת ציטולוגיה להרחיב רק לפני נטילת המדגם, ואל תשכחו לשמור מברשת סטרילית לא נוגע בו לכל משטחים מלבד משטחי האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאל משתתף לשבת בשקט להטות את הראש כלפי מעלה, אל התקרה. יש קטנים או ילדים חסרי מנוחה יותר לשבת על הידיים ו / או בשכיבה כדי למנוע לחבוט המברשת הצדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון מברשת בחלק האחורי של האף שבו המעבר מצמצם (נראה כמו חור שחור קטן). חלק מברשת למטה ולסובב פרקים כמו המברשת תיוסר nostril. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח מברשת חרוטים לצלול BEGM. חותכי מברשת עודפת ולהחליף כובע על צינור. לא מערבולת. הערה: אם המשתתף הוא מוכן, להשיג מברשת שנייה באותו אופן אבל בנחיר השני. קבלת רפרוף קל על שני הנחיריים תגרום סבירות גבוהה יותר כי הדגימה תהיה מוצלחת. דגימה באותו הנחיר עלולה לגרום לדימום לא ישפר את המדגם סביר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור דגימות קרובות ל -37 מעלות צלזיוס ככל האפשר במהלך הובלה באמצעות מבחנה עם מים חמים. </li></ol> 2. ספירת תאים ו Cytospin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להתסיס את המברשת BEGM ולקחת 10 μl של המדגם עבור ספירת תאים באמצעות hemacytometer. הוסף 10 μl של כתם חי / מת ולספור לחיות תאים רק תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 50 μl של המדגם לדלל 200 μl עם 1x PBS. הוסף משפך cytospin המצורף שקופית זכוכית ספין ב 300 סל&quot;ד במשך 2 דקות. בואו להחליק שקופית O / N ו- כתם יבש following להוראות היצרן. אפשר להתייבש O / N, רצוי בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות כתם עם המה 3 Stain <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כל פתרון (מקבע המה, תכלת; המה 3 פתרון אני, ורוד; ו המיתי 3 פתרון שני, כחול עמוק) לתוך צלחת מכתים; שמור מכוסה כשאינו בשימוש. הכנס שקופיות לתוך סירה מכתימה שקופית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים שקופיות ברציפות מקבע במשך 30 שניות, ולאחר מכן לאפשר עודף לניקוז. טובלי שקופיות ברציפות פתרון אני במשך 30 שניות, ולאחר מכן לאפשר עודף לניקוז. טובלי שקופיות ברציפות הפתרון השני במשך 30 שניות, ולאחר מכן לאפשר עודף לנקז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים ללא יונים עד המים זורמים ברורים. אפשר להתייבש O / N, רצוי בחושך </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תראה שקף מתחת תאי מיקרוסקופ וספירה, לקבוע אחוז תאי אפיתל. צריך להיות 90% או יותר אם הדגימה היא טובה. </li></ol> 3. תאים מתזמנים הערה: ביצוע כל הליכי תרבית תאים בתרבות רקמות נכונה מוסמכתמכסה המנוע באמצעות טכניקה סטרילית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל צלחות עם שור Dermal קולגן (BDC), סוג 1. הוסף 0.5 מ&quot;ל של 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BDC מדולל 49.5 מ&quot;ל 1x PBS. כן פחות אם רק כמה צלחות תשמשנה. מעיל בקבוקון T25 עם 2 מ&quot;ל BDC דגירה O בשכונה סטרילי / N או ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, אם יהיה צורך בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לשאוף כל נוזל נותר. לחשוף צלוחיות לאור UV למשך 30 דקות במנדף סטרילית. צלוחיות חנות עד חודש אחד בכל 4 ° C, אבל להביא אותם RT או 37 ° C לפני זריעת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור מברשת ותאי BEGM על 37 מעלות צלזיוס עד מוכן זרע. בעדינות מברשת סוויש בתוך חרוטים, אבל לא מערבולת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 7 x 10 5 תאים בבקבוק T25. אם יש פחות, להשתמש במיכל קטן, כגון אחד טוב של צלחת 6 באר. צלחת בגודל זה דורש כ 3 x 10 5 תאים. הערה: אם אין תאים רבים זה, זה לא מומלץ להמשיך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה מנוע סטרילית, לקחת מברשת מתוך צינור gently לסובב מברשת על פני השטח של הבקבוק המצופה, נזהר שלא לשרוט את הציפוי. בטל המברשת במיכל Biohazard המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט פיפטה את התאים הנותרים ב BEGM מתוך החרוטים לתוך בקבוק T25. שים את התאים תחת מיקרוסקופ. מספר התאים הצפים יקוים וייתכנו כמה פסולת מהאף, אשר מקובל בשלב זה (איור 3 א). </li></ol> 4. תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זריעת תאים, ולתת להם להתיישב במשך 48 שעות ללא הפרעה (איור 3). לאחר 48 שעות, לאט ובעדינות להוסיף 2 מ&quot;ל חם BEGM ו -20 μl סטרילי פניצילין / סטרפטומיצין / Fungizone (P / S / F). הערה: אין לשאוב תקשורת 2 מיליליטר של המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4 th לאחר הזריעה, לשאוב את כל הנוזל בזהירות, ולהחליף עם 4 מ&quot;ל טריים, חימם BEGM בתוספת 1x פן / סטרפטוקוקוס (fungizone כבר לא נחוץ). שינוי בתקשורת כל יומיים ולהעריך תאים לצרףment, צמיחה מפגש. כאשר התאים מגיעים ~ 80% המפגש, בדרך כלל בתוך 2-3 שבועות, הם מוכנים להיות passaged. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוק T25 אחת (כ -2.5 x 10 6 תאים כאשר ומחוברות) ניתן passaged לשלוש צלוחיות T25 או בבקבוק T75 אחד. לאחר המעבר הראשון, תאים צריכים להיות חזקים ובריאים, להגיע למפגש על כל שלושה ימים. </li></ol> 5. תאים Passaging <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשאוב התקשורת מהצלחת. הוסף 1 מ&quot;ל 0.05% פתרון טריפסין לכל בקבוק T25 לצלחת ומניחים בחממה במשך כ 4min, או עד תאים להתנתק הצלחת. בדוק את רמת הניתוק של תאים כל 2 דקות ואל תשאיר טריפסין על יותר מ 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל טריפסין נטרול פתרון (TNS), או מדיה המכילה סרום לנטרל את האנזים. הסר את כל הנוזל ותאי מהבקבוק ומכניסים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 200 (האצה 0 האטה 0) במשך 5 דקות כדי לקבל תא גלולה. לשאוב supernaתאי tant ו resuspend BEGM + P / S בהיקף הנדרש הצלוחיות החדשות (4 מיליליטר עבור בקבוק T25, 10 מיליליטר עבור בקבוק T75) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו ספירת תאים עם כתם חי / מת כפי שתואר לעיל (2.1). הוספת הכמות מתאימה של BEGM ותאי כדי הצלוחיות המצופות ולחזור אל האינקובטור. לשמור כמפורט לעיל או cryopreserve מקפיא בינוני (70% BEGM, 20% FBS ו 10% DMSO) בריכוז של 0.5-2 x 10 6 תאים לכל מיליליטר. </li></ol> 6. תכנות מחדש כדי iPSCs הערה: לפני יצירת iPSCs, לפקח על קיום כל התקנות המוסדיות המסדירות את הדור ושימוש iPSCs אדם. טכניקת סטרילית חשובה במיוחד עבור תרבויות iPSC, כמדיום תרבות אינו מכיל אנטיביוטיקה באופן שגרתי. זה קריטי, כי NECs נראה בריא והם שגשוג וחסון לתכנות מחדש מוצלח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 5 x 10 5 NECs לכל גם צלחת בתרבית רקמה 6 היטב. לאחר 24 שעות, להוסיף polybreneכדי BEGM לריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו transduce NECs ידי הוספת חלקיקים lentiviral להביע Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc לתקשורת. שואפים להשיג ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של ~ 5 27. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי קביעת משרד הפנים, להכין דילולים סידוריים של המניות המרוכזות-lentiviral ו transduce HT1080 תאים עם דילולים אלה. לאחר זיהוי הראשון באופן חד משמע ביטוי dTomato בתאי HT1080, לחשב את המספר &quot;יחידות transducing / מיליליטר&quot; כשקלע את מספר תאי dTomato החיובי / גושים קטנים של תאים כל דילול. הערה: בדרך כלל, תהיה דילולים כי הן גבוהות מדי (הכל dTomato חיובי) ו נמוך מדי (ללא או רק כמה תאים חיוביים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע ניקוד הדילולים שבו נבדלו תאים חיוביים / גושים קטנים של תאים מזוהים. לקבוע את כייל על ידי תיקון מספר transducing מ&quot;ל / יחידות עם גורם לדילול המתאים. משרד הפנים הוא אזי היחס בין מספרשל transduced תאים למספר חלקיקי הנגיף 27. הערה: כל תא dTomato החיובי / גוש קטן מניחה לנבוע חלקיק וירוס אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ -3 שעות-שלאחר התמר, להסיר תקשורת ולהחליף עם BEGM הטרי. מחק תקשורת lentivirus המכיל באמצעות נהלים שאושרו מוסדי. חזור NECs transduced אל האינקובטור במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, להחליף תקשורת עם BEGM הטרי, ולאחר מכן דגירה במשך 3 ימים נוספים. לשאוב בילה התקשורת, לשטוף תאים עם 1x PBS ולהוסיף 1 מ&quot;ל 0.05% פתרון טריפסין אל הבאר. תאי מעבר עם טריפסין כפי שנכתב לעיל (סעיף 5). בזהירות לשאוב תאים supernatant ו resuspend ב 4 מ&quot;ל BEGM + P / S. תאים יכולים להיות passaged כדי באר חדשה של צלחת 6 היטב מצופית BDC, או הוסיפו לתרבויות MEF, אם מוכן (ראו השלב הבא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחות מצופות MEF. ביום 4 להוסיף פתרון ג&#39;לטין 0.1% (1 מ&quot;ל / טוב) 2 הבארות של 6 היטב (כדי לבצע +/- Thiazovivin (SPT) ראה שלב 6.6). על הבאיום, להפשיר בקבוקון של MEFs מומת 28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים MEFs לתוך 10 מ&quot;ל של התקשורת MEF (DMEM + 1x NEAA + 10% dFCS). ספין על XG 200 במשך 5 דקות עד גלולה. גלולה בתקשורת MEF. ג&#39;לטין לשאוב מהצלחת 6 היטב ומוסיפים 1.87 x 10 5 MEFs לכל גם צלחת 6 היטב מצופה ג&#39;לטין. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס, או למשך תקופה מינימלית של 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 2 מ&quot;ל של BEGM מכילים transduced תאים לכל גם לתוך 2 בארות צלחת 6 מצופה בעבר היטב דגירה O / N. ביום למחרת, להחליף BEGM עם 2.5 מ&quot;ל לכל טוב של התקשורת תקן hESC המכיל 4 ng / גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי מ&quot;ל. Feed תאים עם התקשורת hESC טרי +/- SPT יומי במשך 10 ימים הערה: אפשר להוסיף קוקטייל של מולקולות קטנות (SB431542, PD0325901, ו Thiazovivin (SPT) קוקטייל) כדי לשפר את היעילות ואת קינטיקה של תכנות מחדש עבור NECs 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עשרה ימים, להמשיך להאכיל יומי באמצעות התקשורת hESC ללא SPT. Feed תרבויות יומיים עד מושבות hESC הדמוילהופיע (איור 5 א, המושבה P0). זיהוי מושבות מחסה iPSCs המשוערת על ידי הגרעין הגבוה שלהם: יחס cytoplasmic ו nucleoli הבולט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות בלו והעברה ידניות עם מורפולוגיה hESC הדמוי להפריד בארות לתרבות והרחבה כקווים נפרדים במערכת מזין חינם. מושבות ניכרות צריכות להסתגל במהירות לתנאים אלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מושבות ציפוי ניכר קווי iPSC המשוערים הדיסקרטיים אלה נחשבים כיום מעבר 1 (P1). תרבויות עדכונים יומיים עם mTeSR1. מעבר ולהרחיב קווי iPSC באמצעות נהלים סטנדרטיים. זה עלול לקחת מספר ימים עד שבוע עבור מושבות p1 להגיע לגודל שבו הם צריכים להיות passaged. </li></ol></li></ol> 7. שימור iPSCs בתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Feed ולהעריך תרבויות יומיות. ידני באזורי בלו מפגינים בידול גלוי על ידי גירוד עם טפטף זכוכית סטרילית או קצה פיפטה מיקרו. שינוי תקשורת לאחר קטיף יומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאים לאחר approximately כל ארבעה ימים: בעדינות התקשורת לשאוב, להוסיף 1 מ&quot;ל Dispase חם (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לכל היטב צלחת 6-היטב (חצי נפח האכלה), ואז לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך כ -4 דקות. הקצוות של המושבות יתחילו להרים, אשר נראה כמו מתווה לבן ברחבי המושבה. בעדינות לשאוב Dispase ולשטוף 3x עם חימם DMEM / F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל mTeSR1 ולהשתמש מרים תא להרים את מושבות מהצלחת. השתמש פיפטה 5 מ&quot;ל סרולוגית או micropipette P1000 כדי triturate התאים בעדינות עד מושבות מחולקות לאשכולות קטנים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע לייצר אשכולות קטנים מאוד או תאים בודדים, כמו התפשטות הישרדות עוקבת תהיה תת-אופטימלית. כאשר מחדש ציפוי מושבות, 1: 4 ל -1: 6 פיצול ישמור צפיפות מושבה אופטימלית. הוצא בעדינות מושבות תקשורת מהצלחת ולהוסיף חדשות, בארות מצופות matrigel. </li></ol></li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

תאי אפיתל האף (NECs) מהווים פלטפורמה נגישה ללימוד מחלות דרכי הנשימה, ו- NEC-iPSCs להציע דרך מרגשת לחקור את התפתחות המחלה, טיפול ותרפיה 1,31,32. NECs ניתן להשיג בקלות ללא 6,23 נהלים מלחיצים או מזיקים. מניסיוננו, הדגימה של רירית האף כמתואר בפרוטוקול זה נראה פחות מלחיץ נתפס ...

תאי גזע מושרים ממדגם אדם (hiPSCs) הם טכנולוגיה לפיתוח מהיר של חקר תאי גזע. הם מציעים אלטרנטיבת תאי גזע עובריים (hESC) מחקר עם הרבה פחות 1,2 חסרונות אתיים ומוסריים. למרות שהם אינם זהים epigenetically כדי hESCs 3-5, hiPSCs מציע דרך ייחודית לבנות מודל פנוטיפים התפתחות ומחלות, והם יכולים לנבוע רקמות רלוונטיות למצב המחלה 5-8. שיטות חדשות של hiPSCs יצירת נבדקות ללא הרף כדי לזהות סוגי תאים אופטימלי להתחיל עם, כדרך להכין iPSCs GMP באיכות מתאימה להשתלה, וגם להגדיל את העיתוי ואת היעילות של תהליך תכנות מחדש 6,9-11. תאי אפיתל דרכי נשימה הם קריטיים בהתפתחות דלקת אלרגית 12, ו האפיתל הוא נהג עיקרי של תגובות אלרגיות שיפוץ דרך נשימה באמצעות אינטראקציה עם immunתאי דואר סטרומה. אפיתל דרכי הנשימה ממלאת תפקיד חיוני מהמוצא וההתמדה של מחלות ריאה כגון אסטמה. עם זאת, תאי אפיתל דרכי נשימה תחתונה קשים להשיג במסגרת רפואית, במיוחד מחולים וילדי ביקורת בריאים. נתונים ממחקרים כמה תומכי ההנחה כי תאי אפיתל מן רירית אף הם פרוקסי תקף ומעשי עבור תאי אפיתל דרכי נשימה נמוכה 13-20, במיוחד כאשר לומדים תגובות מזהמי אוויר אלרגנים. רירית האף מורכבת יותר מ -90% דרך נשימה ריסי בתאי אפיתל דגימה לתאי האפיתל אף אלה (NECs) יכולה להתבצע בקלות אצל ילדים צעירים כמו גיל ארבעה או חמש, כפי שהוא פחות פולשנית מאשר טכניקות דגימת תא / רקמה אחרות והוא קשור לסיכון מינימאלי של תופעות לוואי כגון זיהום 20-23. הוא מציע דרך מהירה ופשוטה לדגום שני ילדים בריאים וחולים ללא ארוכה, מיותר, ולעתים קרובות procedu ברונכוסקופיה הכואבמיל מחייבי הרגעה. מחקרים קודמים מצאו כי תת המחלה קשורה חומרת האסתמה ניתן להבחין הן רירית האף, כמו גם דגימות תאים הסימפונות שנלקחו ילדים אסתמטיים, ביטוי גנים בין שני סוגי רקמות היה דומה כ -90% מהגנים הלא בכל מקום 22 , 24. כמקור iPSCs, NECs להציע יתרונות על פני סוגי תאים אחרים מנוצל לעיתים קרובות. פיברובלסטים משמשים לעתים קרובות דור iPSC, אבל למרות תאים אלה יכולים להיות מתורבתים בקלות מתוך ביופסיה של עור, תהליך זה בדרך כלל דורש הרדמה מקומית, חתך, ותפרים, והיא קשורה עם סיכון מסוים של זיהום. לכן השיג הסכמה מדעת מחולים עבור סוג זה של ביופסיה יכולה להיות קשה 25. חלופה אחת כדי פיברובלסטים היא תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs). עם זאת, זה יכול להיות קשה להשיג דם מספק עבור דור iPSC מחול ילדים. בנוסף, קיימות מגבלות של ap במורד הזרםplications עבור פיברובלסטים iPSCs דם תא נגזר, במיוחד קיבולת הבידול שלהם סוגי תאים מסוימים 5,26. לכן, בהתחשב הנגישות היחסית ואת הסיכון הנמוך של תופעות לוואי בעקבות בגבייתם NECs מהווה מקור תא אידיאלי עבור דור iPSC מאוכלוסיות ילדים. iPSCs קיבלו הרבה תשומת לב לאחרונה כפלטפורמה ללימוד ההתפתחות האנושית, יצירת מודלים המחלה רומן, כמקור פוטנציאלי של תאים עבור טיפולים אישית. לפני את מלוא הפוטנציאל של הטכנולוגיה הזו יכולה להתממש, את הבסיס המולקולרי של תהליך תכנות מחדש צריך להיות הובהר, אך לעת עתה פרוטוקול זה ואת הנהלים המפורטים בתוך יבהיר את המחקרים התמקדו חשיפות דרכי הנשימה, כמו גם לספק פלטפורמה לומד את ההשפעות של טיפול תרופתי אישי המעורב iPSCs. העבודה השיתופית של מספר מעבדות הובילה generation של טכניקה מוצלחת לא רק דגימה של רירית האף, אבל גם culturing NECs, ו תכנות מחדש של תאים אלה iPSCs 23. מאמר זה מספק תיאור של פרוטוקול דגימה אופטימלית, culturing, ותנאי תכנות מחדש.

<table><tbody><tr><td>15 ml conical</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>Protocol Step 1.1.</td></tr><tr><td>BEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Protocol Step 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep/Fungicide</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Protocol Step 1.1.</td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Protocol Step 4.a.</td></tr><tr><td>cytosoft cytology brush</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-263-357</td><td>Protocol Step 1.2.</td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-25-900-CI</td><td>Protocol Step 2.1.</td></tr><tr><td>hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-54</td><td>Protocol Step 2.1.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2438-4</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>Cytology Funnel Clips</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>cytospin funnel</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-640-320</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>Cytospin 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A78300003</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>blank slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95933</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>hema 3 stain kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td>Protocol Step 2.2.</td></tr><tr><td>Bovine Dermal Colagen, type 1</td><td>Life Technologies</td><td>A1064401</td><td>Protocol Step 3.2.</td></tr><tr><td>T25 flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-45</td><td>Protocol Step 3.3.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td>Protocol Step 5.2.</td></tr><tr><td>Trypsin Neutralizing Solution</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td>Protocol Step 5.2.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65 &amp;deg;C for 30 min</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Protocol Step 5.5.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide Hybri-Max&amp;trade;, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, &amp;ge;99.7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Protocol Step 5.5.</td></tr><tr><td>polycistonic lentivirus*</td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Millipore</td><td>SCR511</td><td>Protocol Step 6.4.&amp;nbsp;&lt;br/&gt; A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-134220</td><td>Protocol Step 6.4.</td></tr><tr><td>Irradiated CF1 MEFs</td><td>GlobalStem&amp;nbsp;</td><td>GSC-6301G</td><td>Protocol Step 6.4.</td></tr><tr><td>hESC media</td><td>See recipe included in protocol</td><td></td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010</td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>Thiazovivin&amp;nbsp;</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>Protocol Step 6.11.</td></tr><tr><td>hESC-qualified Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Protocol Step 6.13.</td></tr><tr><td>Corning plate, 6 well</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Protocol Step 6.13.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell</td><td>5850</td><td>Protocol Step 6.13.</td></tr><tr><td>250 ml disposable filter flask (0.22 &amp;micro;m)</td><td>Fisher</td><td>SCGP-U02-RE&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dispase</td><td>StemCell</td><td>7923</td><td>Protocol Step 7.3.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Protocol Step 7.3.</td></tr><tr><td>cell lifter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td>Protocol Step 7.4.</td></tr><tr><td>hESC Media**</td><td></td><td></td><td>Protocol Step 6.11.&lt;br/&gt; components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4 &amp;deg;C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37 &amp;deg;C longer than 15 min</td></tr><tr><td>DMEM-F12 50/50 media</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;11330-032</td><td>Final Concentration</td></tr><tr><td>KO replacement serum (KO-SR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>0.2</td></tr><tr><td>200 mM L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>55 mM &amp;szlig;-mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>100x non-essential amino acids</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>1x</td></tr><tr><td>2 &amp;micro;g/ml Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

cultivate primary nasal epithelial cells from children and reprogram into induced pluripotent stem cells

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

החלק הראשוני של האף, שנקרא פרוזדור האף, הוא האזור המוקף סחוס 29. המברשת צריכה ללכת בצורה חלקה בעבר באזור זה של האף, מעבר שסתום האף (ostium internum, או &quot;חור השחור&quot; לראות בחלק האחורי של Nare), ואת המדגם המתקבל חלזוני הנח (איור 1). Turbinates האף הם מבנ?...

Watch this Scientific Journal Video about Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

טפח תאי אפיתל באף הראשי מיילד לתכנת מחדש לתאי גזע מושרים

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

cultivate-primary-nasal-epithelial-cells-from-children-reprogram-into

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.1K Views.  Cincinnati Children's Hospital. This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Video: Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient's symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Expansion of human pediatric esophageal epithelial cells utilizing conditional reprogramming provides investigators with a patient-specific population of cells that can be utilized for engineering esophageal constructs for autologous implantation to treat defects or injury and serve as a reservoir for therapeutic screening assays.

תכנות מחדש מותנה של תאי אפיתל ושט האדם Pediatric לשימוש בהנדסת רקמות וחקירת מחלות

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

מבוסס-RNA תכנות מחדש של האנושי Fibroblasts הראשי לתוך תאי גזע Pluripotent המושרה

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants that circumvent histocompatibility barriers. However, progression through a pluripotent state and subsequent complete differentiation into desired lineages remains a roadblock for the clinical translation of iPSC technology because of the associated neoplastic potential and genomic instability. Recently, we and others showed that somatic cells cannot only be converted into iPSCs but also into different types of multipotent somatic stem cells by using defined factors, thereby circumventing progression through the pluripotent state. In particular, the direct conversion of human fibroblasts into induced neural progenitor cells (iNPCs) heralds the possibility of a novel autologous cell source for various applications such as cell replacement, disease modeling and drug screening. Here, we describe the isolation of adult human primary fibroblasts by skin biopsy and their efficient direct conversion into iNPCs by timely restricted expression of Oct4, Sox2, Klf4, as well as c-Myc. Sox2-positive neuroepithelial colonies appear after 17 days of induction and iNPC lines can be established efficiently by monoclonal isolation and expansion. Precise adjustment of viral multiplicity of infection and supplementation of leukemia inhibitory factor during the induction phase represent critical factors to achieve conversion efficiencies of up to 0.2%. Thus far, patient-specific iNPC lines could be expanded for more than 12 passages and uniformly display morphological and molecular features of neural stem/progenitor cells, such as the expression of Nestin and Sox2. The iNPC lines can be differentiated into neurons and astrocytes as judged by staining against TUJ1 and GFAP, respectively. In conclusion, we report a robust protocol for the derivation and direct conversion of human fibroblasts into stably expandable neural progenitor cells that might provide a cellular source for biomedical applications such as autologous neural cell replacement and disease modeling.

Generation of induced pluripotent stem cells provides fascinating prospects for the derivation of autologous transplants. However, progression through a pluripotent state and laborious re-differentiation still hinders clinical translation. Here we describe the derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into induced neural progenitor cells and the subsequent differentiation into neural lineages.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Neuroscience

Generation of Airway Epithelial Cell Air-Liquid Interface Cultures from Human Pluripotent Stem Cells

Diseases of the conducting airway such as asthma, cystic fibrosis (CF), primary ciliary dyskinesia (PCD), and viral respiratory infections are major causes of morbidity and mortality worldwide. In vitro platforms using human bronchial epithelial cells (HBECs) have been instrumental to our understanding of the airway epithelium in health and disease. Access to HBECs from individuals with rare genetic diseases or rare mutations is a bottleneck in lung research.
Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are readily generated by "reprogramming" somatic cells and retain the unique genetic background of the individual donor. Recent advances allow for the directed differentiation of iPSCs to lung epithelial progenitor cells, alveolar type 2 cells, as well as the cells of the conducting airway epithelium via basal cells, the major airway stem cells.
Here we outline a protocol for the maintenance and expansion of iPSC-derived airway basal cells (hereafter iBCs) as well as their trilineage differentiation in air-liquid interface (ALI) cultures. iBCs are maintained and expanded as epithelial spheres suspended in droplets of extracellular matrix cultured in a primary basal cell medium supplemented with inhibitors of TGF-&#223; and BMP signaling pathways. iBCs within these epithelial spheres express key basal markers TP63 and NGFR, can be purified by fluorescence activated cell sorting (FACS), and when plated on porous membranes in standard ALI culture conditions, differentiate into a functional airway epithelium. ALI cultures derived from healthy donors are composed of basal, secretory and multiciliated cells and demonstrate epithelial barrier integrity, motile cilia, and mucus secretion. Cultures derived from individuals with CF or PCD recapitulate the dysfunctional CFTR-mediated chloride transport or immotile cilia, the respective disease-causing epithelial defects.
Here, we present a protocol for the generation of human cells that can be applied for modeling and understanding airway diseases.

Recent advances in human induced pluripotent stem cell differentiation protocols allow for the stepwise derivation of organ-specific cell types. Here, we provide detailed steps for the maintenance and expansion of iPSC-derived airway basal cells and their differentiation into a mucociliary epithelium in air-liquid interface cultures.

יצירת תרביות ממשק אוויר-נוזל של תאי אפיתל דרכי הנשימה מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Diseases of the conducting airway such as asthma, cystic fibrosis (CF), primary ciliary dyskinesia (PCD), and viral respiratory infections are major ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Biology

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Bioengineering

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...